1株貓源長灣泥沙門菌的分離鑒定及致病性分析

王 俊,陳劍鋒,張欣欣,趙思雅,禹海杰,趙海云,崔國林

(1.嘉興職業(yè)技術(shù)學院,浙江 嘉興 314036;2.河北工程大學 生命科學與食品工程學院,河北 邯鄲 056038)

沙門菌是一種重要的人獸共患病原菌,感染宿主范圍廣,易造成人和動物之間的水平傳播,尤其是人與食品動物及寵物之間。根據(jù)美國疾病預防控制中心調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,2020年全美共計發(fā)生沙門菌感染事件1 786起,涉及50個州,其中366名患者住院治療和1名患者死亡,5歲以下兒童感染率高達25%,流行病學調(diào)查結(jié)果表明64名患者具有寵物接觸史。YANG等[1]收集2018-2019年江蘇徐州469份寵物犬、貓肛門拭子,分離27株沙門菌,分布于7個血清型且均為人獸共患血清型,揭示人與犬、貓之間存在沙門菌傳播風險。

WOODWARD等[2]調(diào)查統(tǒng)計1991-1996年加拿大引起人和寵物沙門菌病的血清型分布,從13名患者樣本和1只烏龜樣本中分離到長灣泥沙門菌,進一步調(diào)查發(fā)現(xiàn)13名長灣泥沙門菌感染患者中有10名存在烏龜接觸史。2016年9月國內(nèi)長灣泥沙門菌感染首次暴發(fā),從浙江省余姚市1名1歲患有急性胃腸炎兒童糞便樣本分離獲得,隨后于2017年北京市6月齡急性重癥感染兒童再次分離,流行病學調(diào)查顯示患兒父母有巴西紅耳龜接觸史,2018年9月江蘇省徐州市分離于出血性腹瀉兒童樣本,流行病學調(diào)查結(jié)果得出該家庭喂養(yǎng)的巴西龜4份糞便中均分離到長灣泥沙門菌,同年10月從浙江省慈溪市婦幼保健院1名1歲5月齡腹瀉兒童樣本再次分離1株;2020年,浙江紹興柯橋區(qū)某腸胃炎患者糞便樣本中分離獲得1株[3-7]。以上調(diào)查結(jié)果表明,長灣泥沙門菌已在國內(nèi)多個省市流行,且以浙江省分離率較高,感染導致5歲齡以下兒童的發(fā)病偏高,臨床癥狀主要表現(xiàn)為出血性腹瀉伴隨發(fā)熱,流行病學調(diào)查表明感染者多有寵物龜直接或間接接觸史。目前關(guān)于長灣泥沙門菌的生物學特性和致病性尚不清楚。本研究首次從國內(nèi)寵物貓糞便腹瀉樣本中分離獲得1株長灣泥沙門菌,通過培養(yǎng)特性、運動性等生物學特性、耐藥性和小鼠致病性分析,為該血清型的科學防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料鼠傷寒沙門菌ATCC14028和大腸桿菌ATCC25922由本實驗室保存;HE培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基、MH液體培養(yǎng)基、BPW培養(yǎng)基、孔雀綠氯化鎂培養(yǎng)基和藥敏紙片均購自杭州濱河微生物試劑有限公司;TSA和TSB培養(yǎng)基購自美國BD公司;革蘭陰性細菌鑒定卡購自梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;2×Taq PCR StarMix(含染料)購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司;沙門菌屬診斷血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.2 細菌的分離將采集的腹瀉病貓的肛門拭子放入100 mL滅菌的BPW培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24 h;吸取1 mL液體加入10 mL孔雀綠氯化鎂培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24 h;將細菌培養(yǎng)液分別接種至TSA和XLD培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)18 h。挑取XLD瓊脂平板中單個黑色可疑菌落進一步接種至TSA瓊脂平板中,37℃培養(yǎng)18 h。

1.3 分離菌的鑒定

1.3.1PCR方法鑒定 刮取TSA平板上的單個菌落,置于50 μL無菌水中充分混勻制成菌懸液。采用煮沸法獲取細菌的基因組DNA作為基因擴增模板。PCR反應(yīng)體系(25 μL):2×Taq PCR StarMix 12.5 μL,DNA模板1 μL,上、下游引物各0.5 μL(F:5′-CCCWGTAAGRCCATAGCGTA-3′,R:5′-GGCAGCAATAACGGCATAGC-3′),ddH2O補足至25 μL。反應(yīng)條件:94℃ 5 min,94℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s,共30個循環(huán);最后72℃終延伸7 min。

1.3.2沙門菌的MLST分析 參考KIDGELL等[8]設(shè)計的用于擴增7個管家基因的引物序列,進行PCR擴增。將擴增獲得的7個基因片段送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列分析。將獲得的7個管家基因序列提交至數(shù)據(jù)庫(https://enterobase.warwick.ac.uk/species/index/senterica)檢索沙門菌的序列型(sequence type,ST)。

1.3.3血清凝集試驗鑒定 刮取TSA平板上的單個菌落,置于50 μL無菌水中充分混勻制成菌懸液。采用玻片凝集試驗鑒定細菌的血清型。

1.4 分離菌的生長特性測定取-80℃保存的長灣泥沙門菌SJ202101和鼠傷寒沙門菌ATCC14028菌株接種至TSA平板,37℃、200 r/min過夜培養(yǎng)后挑取單個菌落分別接種至SS瓊脂培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基、HE瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)18 h,觀察菌落顏色和形態(tài)并拍照記錄。分別挑取長灣泥沙門菌SJ202101和鼠傷寒沙門菌ATCC14028單個菌落接種至5 mL LB肉湯培養(yǎng)基中,37℃、200 r/min過夜培養(yǎng)后調(diào)整菌液濃度至D600 nm約為1.0,以1∶100接種至100 mL新鮮LB培養(yǎng)基中,每2 h測定D600 nm值。

1.5 分離菌的生化鑒定從TSA瓊脂培養(yǎng)基上挑取可疑菌落,用生理鹽水制備成濁度適當?shù)木鷳乙?用VITEK全自動生化鑒定儀進行鑒定。

1.6 運動性分析將長灣泥沙門SJ202101和鼠傷寒沙門菌ATCC14028過夜培養(yǎng)物濃度調(diào)整至D600 nm=1.0,移液器吸取2 μL滴加至LB肉湯(0.3%瓊脂),37℃培養(yǎng)3,5 h,測量細菌菌環(huán)直徑并拍照。

1.7 分離菌的耐藥性測定挑取長灣泥沙門菌單個菌落接種至MH液體培養(yǎng)基中,200 r/min振蕩培養(yǎng)約2 h。收集菌液,調(diào)整菌液濃度約為1.5×108CFU/mL。采用K-B瓊脂擴散法測定分離菌對臨床常見的15種抗生素藥物的敏感性,15種藥物分別是氟喹諾酮類(環(huán)丙沙星5 μg/片、諾氟沙星10 μg/片),頭孢類(頭孢哌酮75 μg/片、頭孢噻肟30 μg/片、頭孢曲松30 μg/片、頭孢吡肟30 μg/片),碳青霉烯類(亞胺培南10 μg/片、美羅培南10 μg/片),氨基糖苷類(卡那霉素30 μg/片、慶大霉素10 μg/片),喹諾酮類(萘啶酮酸30 μg/片,四環(huán)素類(多西環(huán)素30 μg/片),磺胺類(復方新諾明27.35/1.25 μg/片),單環(huán)β-內(nèi)酰胺類(氨曲南30 μg/片),β-內(nèi)酰胺類和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復合物(氨芐西林/舒巴坦10/10 μg/片)。設(shè)置大腸桿菌ATCC25922作為對照。結(jié)果判定參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)指南。

1.8 動物感染試驗60只6～8周齡雌性昆明小鼠購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。將小鼠隨機分成6組,每組10只,腹腔注射方式感染,A組感染劑量為1×109CFU/只,B組感染劑量為1×108CFU/只,C組感染劑量為1×107CFU/只,D組感染劑量為1×106CFU/只,E組感染劑量為1×105CFU/只,F組為空白對照組注射相同劑量無菌生理鹽水。感染后連續(xù)觀察10 d,記錄小鼠的發(fā)病和死亡情況。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用GraphPad Prism 9.0軟件,差異顯著性檢驗采用t檢驗,ns.P≥0.05;*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001;****.P<0.000 1。

2 結(jié)果

2.1 細菌的分離鑒定參照沙門菌檢驗國家標準方法,對腹瀉寵物貓糞便拭子進行沙門菌分離培養(yǎng),獲得1株可疑菌株。運用本實驗室前期設(shè)計的沙門菌鑒定通用引物對可疑菌落進行檢測[9],結(jié)果顯示在500～750 bp之間存在典型目的條帶(603 bp),初步判定可疑菌落為沙門菌(圖1A)。進一步MLST分析結(jié)果顯示此分離株的ST型為3918(圖1B)。血清凝集試驗結(jié)果顯示沙門菌分離株的血清型為17:a,1,5:-,結(jié)果表明,可疑菌落確定為長灣泥沙門菌(SalmonellaJangwani),命名為SJ202101株。

2.2 分離菌的生長特性測定將長灣泥沙門菌SJ202101和鼠傷寒沙門菌ATCC14028分別接種至LB肉湯培養(yǎng)基測定生長曲線,結(jié)果顯示SJ202101和ATCC14028具有相似的生長趨勢(圖2A)。將SJ202101接種至麥康凱瓊脂平板、XLD平板、HE平板和SS平板,37℃過夜培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài)和顏色,結(jié)果顯示SJ202101在TSA平板上呈典型的灰白色半透明菌落,在麥康凱瓊脂平板上呈灰白色邊緣整齊菌落,在XLD平板上呈邊緣濕潤的黑色菌落,在HE平板上呈邊緣濕潤的黑色菌落,在SS平板上呈黑色菌落(圖2B),符合《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門菌檢驗》中關(guān)于沙門菌屬菌株培養(yǎng)特性。

2.3 分離菌的生化鑒定運用法國梅里埃公司全自動細菌鑒定系統(tǒng)鑒定SJ202101和ATCC14028的46種生化反應(yīng),結(jié)果顯示,SJ202101呈現(xiàn)硫化氫產(chǎn)生、賴氨酸脫羧酶等陽性反應(yīng),尿素酶產(chǎn)生等陰性反應(yīng),根據(jù)GB 4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門菌檢驗》的沙門菌屬菌株典型生化反應(yīng)結(jié)果,符合沙門菌屬菌株的生化反應(yīng)特征;對比ATCC14028株,SJ202101的乳酸鹽產(chǎn)堿、鳥氨酸脫羧酶、谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶等43種生化反應(yīng)結(jié)果相同,L-脯氨酸芳胺酶、5-酮-葡萄糖苷和β-葡萄糖苷酸酶3種生化反應(yīng)結(jié)果不同,均呈陽性反應(yīng)(表1)。

2.4 分離菌的運動性測定結(jié)果如圖3所示,將長灣泥沙門菌SJ202101和鼠傷寒沙門菌ATCC14028分別接種至半固體瓊脂中培養(yǎng)3 h后測量菌圈直徑,結(jié)果顯示長灣泥沙門菌SJ202101運動性與鼠傷寒沙門菌ATCC14028無顯著性差異(P≥0.05)。

2.5 分離菌的耐藥性測定采用K-B瓊脂擴散法測定長灣泥沙門菌對15種抗生素藥物的敏感性,結(jié)果顯示長灣泥沙門菌SJ202101對頭孢曲松、萘啶酮酸、亞胺培南、環(huán)丙沙星、氨曲南等15種藥物均敏感,表明抗生素是治療SJ202101株感染的有效方法。

2.6 小鼠感染試驗分別以不同劑量長灣泥沙門菌SJ202101株腹腔注射感染昆明鼠連續(xù)觀察10 d,結(jié)果顯示,109,108CFU/只感染組感染后24 h內(nèi)小鼠表現(xiàn)精神沉郁、不愿走動、被毛粗亂、眼分泌物增多,最后全部死亡,死亡率為100%;107CFU/只感染組感染后在觀察期內(nèi)8只小鼠表現(xiàn)精神沉郁、被毛粗亂,死亡8只,死亡率為80%(圖4);106CFU/只感染組感染后48 h內(nèi)2只小鼠表現(xiàn)嚴重的精神沉郁,最后死亡,死亡率為20%,其余8只小鼠分別以不同程度表現(xiàn)出活動性減少、被毛粗亂、眼角分泌物增多;105CFU/只感染組在10 d觀察期內(nèi)未出現(xiàn)明顯臨床癥狀,精神狀態(tài)和采食量未發(fā)生明顯變化。

表1 細菌生化反應(yīng)結(jié)果

差異性顯著檢驗采用t檢驗,ns.no significant,P≥0.05

圖4 小鼠感染試驗

3 討論

前期調(diào)查結(jié)果表明長灣泥沙門菌為典型的多宿主血清型,存在發(fā)生人和異寵(烏龜)兩者之間水平傳播的潛在風險,從而顯著提高人的感染發(fā)病率,尤其對于免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全的兒童、免疫系統(tǒng)缺陷病人、孕婦和年長者,進一步開展長灣泥沙門菌研究對于開展長灣泥沙門菌的科學防控具有重要意義。前期關(guān)于長灣泥沙門菌的研究報道主要圍繞人類和寵物龜樣本,本研究首次從國內(nèi)寵物貓糞便中分離獲得,揭示了該血清型存在的新傳染源和新的傳播途徑,豐富了沙門菌的流行病資料。2021年寵物行業(yè)白皮書調(diào)查顯示我國城鎮(zhèn)家庭中寵物貓飼養(yǎng)數(shù)量達到5 806萬只,由此導致的人獸共患病傳播風險進一步提高,關(guān)于臨床寵物貓感染長灣泥沙門菌情況仍需要進一步調(diào)查統(tǒng)計。長灣泥沙門菌作為國內(nèi)近年來新發(fā)血清型,研究內(nèi)容多局限于患者的病例報道。本研究通過測定分離菌株的培養(yǎng)特性、生長特性和生化反應(yīng)特征,揭示該血清型菌株具有沙門菌屬細菌典型的生長特征,能夠為長灣泥沙門菌的臨床調(diào)查提供科學數(shù)據(jù)[10]。

細菌運動性能夠幫助細菌躲避惡劣生存環(huán)境,同時運動性也是參與沙門菌黏附入侵器官組織重要的致病因子[11]。長灣泥沙門菌與鼠傷寒沙門菌均具有雙相鞭毛,運動性相似,表明長灣泥沙門菌對小鼠具有較強的致病性,存在鞭毛參與。因?qū)櫸镓垉r格昂貴且不易獲得,本試驗使用昆明小鼠作為替代,通過致病性試驗分析表明長灣泥沙門菌對小鼠具有較強的致病性,106CFU能夠引起小鼠100%發(fā)病率,小鼠發(fā)病臨床癥狀與其他沙門菌血清型感染較為相似[12],該分離株可以為后續(xù)基礎(chǔ)應(yīng)用研究提供依據(jù)。

抗生素治療作為控制細菌感染行之有效的方法,本研究通過耐藥性試驗分析長灣泥沙門菌對檢測的15種藥物均較為敏感,為臨床長灣泥沙門菌感染治療提供參考依據(jù)。由于本試驗僅分離獲得1株長灣泥沙門菌,關(guān)于該血清型的耐藥水平仍需要進一步調(diào)查證實。

綜上,本研究首次從國內(nèi)寵物貓糞便樣本中分離獲得1株長灣泥沙門菌,揭示其生物學特性和動物致病性,為該血清型的臨床防控提供依據(jù)。