1株大鯢源多重耐藥維氏氣單胞菌全基因組解析及其致病性

郝成森,劉 佳,王 艷,駱澤禮,宋振輝,張立武,楊曉偉,,趙光偉,*

(1.西南大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,重慶 榮昌 402460;2.上海海關(guān),上海 200135;3.重慶三杰眾鑫生物工程有限公司,重慶 榮昌 402460)

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)是氣單胞菌科(Aeromondaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)的成員,該菌革蘭陰性、兼性厭氧并具有運(yùn)動(dòng)能力[1],呈世界性分布,并具有廣泛的宿主范圍,對畜禽、水產(chǎn)動(dòng)物和免疫力低下的人具有較強(qiáng)的致病性,是一種典型的人-畜-水生動(dòng)物共患病病原菌[2]。繁殖過程中可產(chǎn)生氣溶素、腸毒素、黏附因子等毒力因子,可引起人的胃腸炎、蜂窩織炎、腦膜炎以及敗血癥等[3];致病性維氏氣單胞菌感染狐貍造成腸道積氣,心臟、肺臟、腎臟等主要臟器出血等病變,引起死亡[4];在水生動(dòng)物中該菌引起的疾病更為常見,大口黑鱸、錦鯉、草魚、中華鱉、中華絨鰲蟹、中國大鯢等均有維氏氣單胞菌感染的報(bào)道[5-9],患病動(dòng)物表現(xiàn)皮膚潰爛、內(nèi)臟出血、腹水等多種臨床癥狀,對養(yǎng)殖業(yè)危害較大。

中國大鯢(Chinese giant salamander)屬于國家二級保護(hù)動(dòng)物,已被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約》附錄Ⅰ[10-11],因其極高的科研、觀賞、保健、藥用及食用價(jià)值,其人工繁育產(chǎn)業(yè)在我國發(fā)展迅猛,生產(chǎn)區(qū)主要集中在我國陜西、四川、重慶、貴州、湖南、湖北等地。人工養(yǎng)殖過程中大鯢細(xì)菌性疾病時(shí)有發(fā)生,其中維氏氣單胞菌也是常見的細(xì)菌病之一,感染后大鯢皮膚及四肢潰爛、腹腔大量積液,病死率高。而在治療及預(yù)防這類疾病的過程中,又由于抗生素使用的不規(guī)范以及餌料、水環(huán)境污染等眾多因素,導(dǎo)致耐藥性菌株不斷出現(xiàn),增加了防控的難度。本試驗(yàn)針對前期分離的1株大鯢源多重耐藥菌株進(jìn)行全基因組測序以及致病性和耐藥基因的檢測,以期為該病原的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株維氏氣單胞菌CQ-AV1株分離自重慶市開州某大鯢人工繁育場,患病大鯢皮膚及肢體潰爛、腹水。分離菌經(jīng)16S rDNA和gyrB測序鑒定確定為維氏氣單胞菌,藥敏試驗(yàn)顯示CQ-AV1株對多種β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和四環(huán)素類藥物有耐藥性,為多重耐藥菌株。分離菌加甘油保護(hù)劑于-80℃ 保存。

1.2 主要試劑細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)購自天根生化科技有限公司;2×Rapid Taq Master Mix和DL2000 DNA Marker購自南京諾唯贊生物科技有限公司;引物合成及PCR產(chǎn)物測序在北京六合華大基因重慶分公司完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康大鯢30尾,購自陜西漢中紅星大鯢養(yǎng)殖場,6月齡,體長(20±5)cm,體質(zhì)量為(100±10)g,飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室安靜的暗環(huán)境中,室溫18～25℃,每天換水1次,飼喂養(yǎng)殖場配送餌料;SPF昆明鼠10只(20～25 g,雌性),購自重慶國家生物產(chǎn)業(yè)基地實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 主要分析軟件和數(shù)據(jù)庫Trimmomatic(http://www.usadellab.org/cms/index.php),HGA(https://github.com/aalokaily/Hierarchical-Genome-Assembly-HGA),SSPACE(https:// www.Base clear.com/ services/bioinformatics/basetools/),QUAST(http://bioinf.spbau.ru/quast),Barrnap 0.8(https:// github.com/tseemann/barrnap),VFDB數(shù)據(jù)庫(Virulence Factors of Pathogenic Bacteria,http://www.mgcacc n/VFs/download),CGE數(shù)據(jù)庫(Center for Genomic Epidemiology,http://www.genomicep idemiology.org/)。

1.5 維氏氣單胞菌純培養(yǎng)及擴(kuò)增取-80℃保存的維氏氣單胞菌CQ-AV1株劃線接種于LB平板,于30℃恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。挑取單個(gè)菌落至LB液體培養(yǎng)基,30℃振蕩培養(yǎng)至D600值為1.0,3 000×g離心20 min,收集菌體。

1.6 細(xì)菌DNA的提取利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA,微量分光光度計(jì)測定DNA純度和含量,確保D260/280在1.8～2.0之間,D260/230值在2.0以上,低溫送至成都羅寧生物科技有限公司進(jìn)行全基因測序。

1.7 文庫構(gòu)建及測序采用全基因組鳥槍法(whole genome shotgun,WGS)策略,構(gòu)建約350 bp 大小的文庫,基于Illumina HiSeq測序平臺的雙端測序PE150測序方法進(jìn)行測序。首先使用Covaris M220對鑒定合格的基因組DNA進(jìn)行超聲破碎隨機(jī)片段化,形成一系列在350 bp左右的DNA小片段,在片段的兩個(gè)末端加上接頭,使用Illumina公司TruSeqTMDNA PCR-Free Sample Prep Kit構(gòu)建大小為350 bp的單鏈DNA文庫。使用測序試劑盒HiSeq 3000/4000 SBS Kit(300 cycles)FC-410-1003進(jìn)行測序,將構(gòu)建好的文庫種到已連接引物的測序芯片上(Flowcell),產(chǎn)生互補(bǔ)雜交,再加入dNTP和聚合酶,以此連續(xù)重復(fù)進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增,DNA鏈的數(shù)量以指數(shù)增長,最后形成單克隆DNA簇。利用邊合成邊測序的原理:加入特定DNA聚合酶及帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP進(jìn)行延伸,一個(gè)循環(huán)只延伸一個(gè)正確互補(bǔ)的堿基,后用激光掃描根據(jù)4種不同的熒光信號讀取堿基種類。以此重復(fù),直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。最后統(tǒng)計(jì)每個(gè)循環(huán)所讀取到的熒光信號結(jié)果,獲得完整序列信息。

1.8 測序數(shù)據(jù)的組裝、注冊及注釋利用Trimmomatic軟件對測序數(shù)據(jù)中產(chǎn)生的低質(zhì)量和污染序列進(jìn)行修剪和過濾,去除接頭污染,切除兩端堿基質(zhì)量小于3的堿基。使用HGA V1.0進(jìn)行序列組裝,并通過軟件SSPACE、QUAST軟件對組裝后的結(jié)果進(jìn)一步的校正和評價(jià)。將全基因組序列信息注冊至GenBank數(shù)據(jù)庫中,并通過NCBI上的原核基因組注釋通道PGAP(prokaryotic genome annotation pipeline)對組裝后的基因組序列進(jìn)行注釋。全基因組序列與已注冊的其他菌株進(jìn)行比較,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,進(jìn)而將全基因組序列在上傳至VFDB數(shù)據(jù)庫,對其毒力基因進(jìn)行分析,獲得該菌株相關(guān)毒力因子信息;將全基因組序列在上傳至 CGE數(shù)據(jù)庫,利用其ResFinder數(shù)據(jù)庫分析比對該菌株所攜帶的耐藥基因,獲得該菌株的耐藥信息。

1.9 致病性試驗(yàn)參考其他動(dòng)物源維氏氣單胞菌致病性試驗(yàn)的感染劑量[4-9],首先將CQ-AV1株菌液濃度調(diào)整為9.5×108CFU/mL,腹腔注射小鼠(n=5)0.5 mL,另有5只小鼠僅腹腔注射等量生理鹽水作為對照;感染后每天觀察小鼠的精神狀態(tài)和發(fā)病情況,及時(shí)剖檢死亡小鼠,觀察其病變。隨后,調(diào)整CQ-AV1株菌液濃度為6.0×108CFU/mL進(jìn)行大鯢的致病性試驗(yàn),共分為6組(n=5),其中1～5組為感染組,第6組為陰性對照注射生理鹽水,5個(gè)感染組分別腹腔注射濃度為6.0×108,6.0×107,6.0×106,6.0×105和6.0×104CFU/mL的菌液0.5 mL,觀察并記錄大鯢的發(fā)病及死亡情況,觀察時(shí)間為30 d。對發(fā)病死亡的大鯢進(jìn)行剖檢、觀察其病變情況,并取其肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織進(jìn)行病理切片,HE染色后觀察其病變特征,同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌的分離以驗(yàn)證科赫法則。

2 結(jié)果

2.1 全基因組測序結(jié)果測序結(jié)果經(jīng)過濾后得到的高質(zhì)量DNA序列,通過軟件HGA V1.0對序列進(jìn)行組裝,共獲得41個(gè)重疊群(contigs),組成36個(gè)scaffolds數(shù)據(jù),總長度4 782 590 bp,其中最大的scaffold有425 514 bp。將組裝好的全基因組序列注冊到GenBank數(shù)據(jù)庫中,登錄號為:RZII00-000000.1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/RZII00000000)。通過GenBank中原核基因組注釋通道PGAP對CQ-AV1進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)的注釋,發(fā)現(xiàn)該菌基因組GC含量為58.48%,有5個(gè)rRNA和75個(gè)tRNA基因,其中rRNA包括:3個(gè)5S rRNA,16S rRNA和23S rRNA各1個(gè);tRNA基因預(yù)測到22個(gè)同種型,其中Leu類最多,有8個(gè),其次是Gly、Thr、Ser類各7個(gè);基因組編碼基因共4 323個(gè),假基因62個(gè);通過對蛋白編碼基因中存在的信號肽序列進(jìn)行分析,蛋白中共有4 378個(gè)信號肽位點(diǎn)。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹的繪制將大鯢源菌株CQ-AV1與GenBank中其他動(dòng)物源維氏氣單胞菌菌株序列進(jìn)行比對,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CQ-AV1與豬源菌株(A5、A136、A86、A34和A31株)位于同一分支,具有最近的親緣關(guān)系;與鱸魚源菌株(BAQ-071013-135株)和羅非魚源菌株(UDRT09和NK01株)相鄰,親緣關(guān)系次之;與人源菌株親緣關(guān)系最遠(yuǎn),如AK247、CN17AOO29、553-SP、CN17A0154和71506株等。

圖1 CQ-AV1菌株與GenBank中其他動(dòng)物源維氏氣單胞菌菌株構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 毒力基因注釋VFDB數(shù)據(jù)庫注釋CQ-AV1菌株的毒力因子有7大類(表1),分別是氣溶素(aerolysin)、溶血素(hemolysin)、直接血紅素?cái)z取蛋白系統(tǒng)(direct heme uptake system)、菌毛相關(guān)蛋白(Pili-related protein)、鞭毛相關(guān)蛋白(Flagella related protein)、Ⅱ型分泌途徑蛋白(type Ⅱ secretion system protein,T2SS)和Ⅲ型分泌途徑蛋白(type Ⅲ secretion system protein,T3SS)。注釋的毒力基因總共有159種,共320個(gè)。其中鞭毛蛋白類最多(163個(gè)),其次是菌毛蛋白(56個(gè)),最少的是氣溶素和直接血紅素?cái)z取蛋白,均只有2個(gè)。

2.4 抗生素耐藥基因注釋ResFinder數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)表明發(fā)現(xiàn)CQ-AV1菌株中存在5個(gè)耐藥基因(表2),分別為氨基糖苷類aac(3)-IId、β-內(nèi)酰胺類AmpS、blaCEPH-A3、blaTEM-1B和四環(huán)素類Tet(E)。

表1 VFDB數(shù)據(jù)庫注釋CQ-AV1菌中毒力相關(guān)基因

表2 ResFinde數(shù)據(jù)庫注釋CQ-AV1耐藥基因結(jié)果

2.5 致病性試驗(yàn)結(jié)果感染組小鼠腹腔注射CQ-AV1株菌液后10 h內(nèi)全部死亡,死亡小鼠可見腹部膨大,剖檢發(fā)現(xiàn)腸腔內(nèi)充滿氣體,內(nèi)臟充血;陰性對照組小鼠均無異常。

CQ-AV1株菌腹腔接種大鯢后24 h,5個(gè)感染組均出現(xiàn)行動(dòng)減緩,表皮黏液脫落現(xiàn)象;72 h時(shí)6×108感染組1條大鯢死亡,腹部注射處皮膚紅腫、潰爛(圖2A),同組另1條大鯢出現(xiàn)腹部膨脹癥狀(圖2B);6×107感染組也出現(xiàn)1條腹部膨脹的大鯢,其余感染組均未出現(xiàn)異常;觀察期結(jié)束后,6×108感染組死亡率20%,其余4個(gè)感染組均無死亡;對感染死亡大鯢剖檢,發(fā)現(xiàn)肝臟、腎臟、肺臟充血腫大,腹腔積液,胃腸充血(圖2C),與自然感染結(jié)果相似;陰性對照組中國大鯢均無任何異常。

圖2 CQ-AV1菌株6×108感染組死亡大鯢臨床及剖檢結(jié)果

病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)感染組發(fā)病大鯢主要臟器中存在充血、出血和炎性細(xì)胞浸潤等病變?；疾〈篥F肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹,嚴(yán)重的表現(xiàn)為空泡變性、壞死,狄氏間隙內(nèi)枯否氏細(xì)胞增多(圖3A);脾臟組織結(jié)構(gòu)破壞,脾索排列紊亂,脾竇、脾小結(jié)內(nèi)紅細(xì)胞增多,淋巴細(xì)胞核腫大、溶解(圖3B)。肺臟組織中炎性細(xì)胞增多,間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量絲網(wǎng)狀纖維蛋白,黏膜下出現(xiàn)大量紅細(xì)胞(圖3C)。腎臟結(jié)構(gòu)被破壞,毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞變性壞死,整個(gè)囊腔充滿纖維蛋白,腎小管中可見蛋白管型(圖3D)。而陰性對照組大鯢各臟器均正常。

3 討論

維氏氣單胞菌在自然界中分布廣泛,在水環(huán)境、土壤和水生動(dòng)物中報(bào)道較多,是一種對人、畜、魚均具有感染性的致病菌,具有一定的公共衛(wèi)生意義[1],特別是在水生和兩棲動(dòng)物中,近年來維氏氣單胞菌感染引起鯉、鯽、鰻和鱘等魚類以及蝦、蟹和鱉等動(dòng)物發(fā)病的報(bào)道很多[5-9],本試驗(yàn)菌株分離自患病大鯢,進(jìn)一步說明該菌感染譜廣泛。結(jié)合致病性試驗(yàn)結(jié)果,CQ-AV1對小鼠具有較強(qiáng)的致死性,人工感染后小鼠均在12 h內(nèi)急性死亡,然而將菌株按不同劑量接種大鯢,盡管所有大鯢都表現(xiàn)出一定的運(yùn)動(dòng)遲緩、表皮黏液脫落等現(xiàn)象,但僅在最高劑量組(6×108CFU/mL)出現(xiàn)2尾死亡,而較低劑量的(6.0×106,6.0×105和6.0×104CFU/mL)3個(gè)組大鯢在出現(xiàn)一過性臨床表現(xiàn)后均無死亡,說明該菌對大鯢的致病性較弱,同時(shí)也反映出該菌對不同宿主的致病性存在一定的差別。

二代測序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS)和生物信息學(xué)手段的發(fā)展對深入了解細(xì)菌的生物特征提供了幫助。本試驗(yàn)通過全基因組測序及組裝成功獲得了CQ-AV1株的完整序列信息,系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示該菌與豬源維氏氣單胞菌的親緣關(guān)系最為接近,而與魚源和人源菌株相對較遠(yuǎn),經(jīng)調(diào)查大鯢繁育場周邊有豬散養(yǎng)戶,存在豬-大鯢傳播的可能性。全基因組信息對進(jìn)一步深入了解該菌的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ),借助VFDB數(shù)據(jù)庫[12]發(fā)現(xiàn)CQ-AV1株的毒力因子主要包括鞭毛蛋白、T3SS、T2SS、氣溶素、溶血素、直接血紅素?cái)z取蛋白和菌毛相關(guān)蛋白共320個(gè)。其中鞭毛蛋白和菌毛相關(guān)蛋白分別介導(dǎo)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)和黏附作用[13],T3SS通過運(yùn)載毒力相關(guān)的效應(yīng)分子以抵抗宿主自身的防御[14],而氣溶素和溶血素被認(rèn)為是細(xì)菌產(chǎn)生致病性的效應(yīng)毒力因子[15-16],尤其是氣溶素已經(jīng)被證實(shí)是維氏氣單胞菌的主要毒力因子,可以破壞腸道組織使得菌體穿透腸道壁屏障而進(jìn)入周身系統(tǒng),本試驗(yàn)中小鼠和大鯢感染后表現(xiàn)出的病理特征及臨床表現(xiàn)(如腸道鼓氣、肝臟等出血)與CQ-AV1菌株中氣溶素、溶血素等毒力因子的生物學(xué)效應(yīng)一致。

維氏氣單胞菌的耐藥性也是困擾臨床養(yǎng)殖的一個(gè)重要問題,不同時(shí)空和宿主的菌株所表現(xiàn)出的耐藥性有很大差別,這對臨床藥物的使用提出了更高的要求,前期的試驗(yàn)結(jié)果顯示CQ-AV1株對氨基糖苷類和β-內(nèi)酰胺類藥物具有較強(qiáng)的耐藥性,本試驗(yàn)通過ResFinder耐藥基因數(shù)據(jù)庫的注釋共發(fā)現(xiàn)了5個(gè)耐藥基因,其中β-內(nèi)酰胺類最多,共有3種,包括AmpS、blaCEPH-A3和blaTEM-1B,此外還有氨基糖苷類aac(3)-IId和四環(huán)素類Tet(E)。在同一菌株中檢測到5種不同的耐藥基因,一方面能夠解釋菌株藥敏試驗(yàn)所表現(xiàn)出對氨基糖苷類和β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥現(xiàn)象,與其表型一致,且與臨床中經(jīng)常使用卡那霉素、頭孢曲松、頭孢喹肟等藥物具有一定的相關(guān)性;另一方面也充分體現(xiàn)出維氏氣單胞菌耐藥的復(fù)雜性,這與以往報(bào)道[6-7]的氣單胞菌耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重是一致的。

β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制為質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC β-內(nèi)酰胺酶和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生,進(jìn)而水解藥物的β-內(nèi)酰胺環(huán),使酰胺鍵斷裂而失去抗菌活性[17],按照Ambler分類法將β-內(nèi)酰胺酶分成了4類:即A類超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)、B類金屬酶(metallo-β-lactamases,MBL)、C類頭孢菌素酶(AmpC酶)和D類苯唑西林酶(OXA酶),值得注意的是本試驗(yàn)CQ-AV1中blaTEM-1B屬于A類ESBLs,blaCEPH-A3屬于B類MBL,AmpS則屬于D類OXA酶耐藥基因,在同一個(gè)菌株中同時(shí)出現(xiàn)3種類型的耐藥基因在臨床分離菌株中是比較少見的,這進(jìn)一步說明了耐藥情況的嚴(yán)重性和復(fù)雜性。此外,在一份我國臺灣地區(qū)調(diào)查[18]中發(fā)現(xiàn),某些人源的氣單胞菌株(豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌)中,blaMOX和blaCEPH陽性菌株分別占調(diào)查菌株的29.4%(45/153)和7.8%(12/153),說明這些耐藥菌株已經(jīng)對人類的健康構(gòu)成了潛在威脅,因此規(guī)范養(yǎng)殖行業(yè)抗生素的使用以及對替抗產(chǎn)品(如中草藥)的研發(fā)是非常必要的。

CQ-AV1菌株中還檢測到含有氨基糖苷類耐藥基因aac(3)-IId和四環(huán)素類Tet(E),其中aac(3)-IId是產(chǎn)氨基糖苷類修飾酶中氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的成員之一,通過催化氨基糖苷藥物氨基或羥基的共價(jià)修飾,使得氨基糖苷類藥物與核糖體的結(jié)合減少而介導(dǎo)耐藥;Tet(E)是一種外排蛋白,可將四環(huán)素排出胞外從而降低胞內(nèi)的藥物濃度,核糖體因此受到保護(hù),從而產(chǎn)生了耐藥性,這是維氏氣單胞菌中研究較早的一種耐藥機(jī)制[19],后被證實(shí)Tet(E) 基因是介導(dǎo)氣單胞菌分離株對四環(huán)素類藥物耐藥的優(yōu)勢基因[20],本試驗(yàn)在CQ-AV1菌株中僅發(fā)現(xiàn)這一種四環(huán)素類耐藥基因,與其是優(yōu)勢基因的結(jié)論一致。

綜上,本試驗(yàn)首次對1株大鯢源多重耐藥維氏氣單胞菌進(jìn)行了全基因組測序,通過生物信息學(xué)手段對其基因組結(jié)構(gòu)、毒力和耐藥基因進(jìn)行了分析注釋,為研究維氏氣單胞菌的分子流行病學(xué)、致病性及耐藥特征等方面提供了參考。