華中地區(qū)犬細(xì)小病毒流行病學(xué)調(diào)查及其VP2基因序列分析

陳林文,戴佩華,曹龍龍 ,葉佳雯,惠曉晨,汪文淵,周登元,3,曹勝波,李秋燕,3*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖北 武漢430070;2.湖北省黃石市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法支隊(duì),湖北 黃石 435000;3.武漢科前生物股份有限公司,湖北 武漢 430040)

犬細(xì)小病毒2型(canine parvovirus 2,CPV-2)屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬的成員,其基因組為單股DNA[1],病毒粒子呈二十面體立體對(duì)稱,無(wú)囊膜,直徑為20 nm左右[2]。犬細(xì)小病毒病是高發(fā)病率和病死率的傳染病,可引起出血性胃腸炎和心肌炎[3],尤其對(duì)2～6月齡幼犬危害最大[4],嚴(yán)重危害犬類健康。

美國(guó)學(xué)者在1977年發(fā)現(xiàn)犬細(xì)小病毒并將其命名為CPV-2[5-6]。CPV-2基因組全長(zhǎng)5 323 nt,有2個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框,編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2和結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2,其中VP2蛋白是病毒最主要的結(jié)構(gòu)蛋白[7],占病毒衣殼蛋白的90.0%[8],含病毒主要抗原決定簇,在病毒的跨物種傳播、結(jié)合與侵入細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9]。最初的CPV-2在傳播過(guò)程中由于VP2基因不斷出現(xiàn)突變,形成CPV-2a亞型并取代原來(lái)的CPV-2。之后CPV-2a亞型出現(xiàn)了N426D、N426E關(guān)鍵突變,形成CPV-2b、CPV-2c兩種亞型[10],近年來(lái)CPV-2a、CPV-2b亞型出現(xiàn)S297A關(guān)鍵突變形成New-CPV-2a、New-CPV-2b亞型[11],這些變異病毒株的抗原性產(chǎn)生明顯差異[12]。國(guó)內(nèi)流行毒株正不斷發(fā)生變化,2011-2013年河南省主要流行株為CPV-2a、CPV-2b型[13],而2021年河南流行株為New-CPV-2a、CPV2c型[14]。

本研究對(duì)我國(guó)華中地區(qū)CPV-2進(jìn)行檢測(cè),從陽(yáng)性樣品中分離病毒,基于VP2基因序列進(jìn)行分析,確定分離病毒的亞型,豐富華中地區(qū)CPV-2的變異情況和流行趨勢(shì),為加強(qiáng)犬細(xì)小病毒的防控,進(jìn)一步研制高效疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑病毒DNA/RNA提取試劑盒(柱提法)購(gòu)自科前生物股份有限公司;Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;胎牛血清、胰酶及DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;Alexa FluorTM488羊抗鼠IgG(H+L)二抗購(gòu)自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 病料樣品及細(xì)胞系收集疑似CPV-2感染的犬糞便樣品共418份,分別采自湖北省武漢市、鄂州市、黃石市,湖南省長(zhǎng)沙市以及河南省信陽(yáng)市動(dòng)物醫(yī)院。將糞便樣品加入1.5 mL無(wú)菌生理鹽水中,于-80℃凍融后,6 000 r/min離心5 min,上清用0.22 μm 濾器過(guò)濾至2 mL無(wú)菌離心管中,于-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｘ埬I傳代細(xì)胞系(F81)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)利用Primer Premier 5.0軟件,根據(jù)GenBank CPV-2全基因組設(shè)計(jì)檢測(cè)引物CPV-F/R及擴(kuò)增VP2全基因的特異性引物CPV-VP2-F/R(表1)。引物由北京擎科生物科技有限公司(武漢)合成。

表1 CPV檢測(cè)引物及VP2基因擴(kuò)增引物

1.4 樣品PCR檢測(cè)將樣品按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行DNA提取,利用表1中CPV-F/R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min;95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,共35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.5 病毒分離與培養(yǎng)將CPV-2陽(yáng)性樣品6 000 r/min離心10 min,上清用0.22 μm濾器過(guò)濾除菌后采用同步接毒的方法,按1∶10的比例加入F81細(xì)胞懸液中,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,直到出現(xiàn)80%病變時(shí)反復(fù)凍融3次收獲病毒液,用此方法連續(xù)傳代3次。

1.6 CPV-2間接免疫熒光試驗(yàn)在96孔板中加入100 μL的F81細(xì)胞懸液,試驗(yàn)組加入100 μL病毒液,對(duì)照組加入 100 μL 2%血清DMEM培養(yǎng)基。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱24 h后,棄去培養(yǎng)基,每孔加入50 μL甲醇室溫固定10 min。PBST洗3次,加入50 μL 1% BSA封閉液,室溫封閉30 min。棄去液體,PBST洗3次,加入50 μL 1∶200稀釋的一抗(針對(duì)CPV-2的單克隆抗體),室溫孵育3 h。棄去液體,PBST洗3次后避光加入50 μL 1∶2 000稀釋的Alexa FluorTM488羊抗鼠IgG二抗,室溫孵育40 min,PBST洗3次后,于熒光顯微鏡下觀察。

1.7 VP2基因氨基酸序列分析使用表1的CPV-VP2-F/R引物擴(kuò)增VP2全基因。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min;95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 2 min,共35個(gè)循環(huán);72℃終延伸10 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果,切膠回收送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。利用Megalign軟件將分離毒株VP2氨基酸序列進(jìn)行比較,參考表2進(jìn)行分型。

表2 CPV VP2基因分型參考

1.8 VP2基因同源性分析及遺傳進(jìn)化分析利用Lasergene 7.0軟件將分離毒株與參考毒株(表3)的VP2基因性進(jìn)行比對(duì),分析同源性;使用MEGA 7.0軟件中的Neighbor-joining方法將分離毒株與參考毒株(表3)的VP2基因進(jìn)行比對(duì)分析并繪制遺傳進(jìn)化樹。

表3 參考毒株背景信息

1.9 VP2基因抗原表位分析及選擇壓力分析使用Lasergene 7.0軟件預(yù)測(cè)VP2蛋白的抗原表位,并利用BioEdit軟件,基于VP2蛋白的氨基酸熵率對(duì)23株分離毒株進(jìn)行選擇壓力分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果以鑒定CPV-2陽(yáng)性樣品。結(jié)果顯示,365 bp處出現(xiàn)目的條帶(圖1),418份犬腹瀉糞便樣品中檢測(cè)出CPV-2陽(yáng)性358份,陽(yáng)性率為85.65%。

M.DL2000 DNA Marker;1.陽(yáng)性對(duì)照;2.陰性對(duì)照;3～8.部分病料檢測(cè)結(jié)果

2.2 華中各地區(qū)CPV-2檢測(cè)結(jié)果各地區(qū)檢測(cè)結(jié)果如表4所示,河南信陽(yáng)感染率最高為95.83%,湖北鄂州感染率最低為77.42%,不同地區(qū)之間感染率均處于較高水平。

表4 華中各地區(qū)CPV-2流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

2.3 華中地區(qū)不同年齡、性別、純種犬及非純種犬的CPV-2感染情況對(duì)不同年齡犬的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,1～3,4～6,7～12及12月齡以上CPV-2陽(yáng)性樣品數(shù)分別為177,107,55,19;1～3月齡犬感染率為92.18%;4～6月齡犬感染率為86.29%;7～12月齡犬感染率為78.57%,成年犬感染率為59.38%(表5),CPV感染率隨年齡增大而下降。純種犬與非純種犬感染率為87.10%,84.17%,但純種犬陽(yáng)性樣品占2/3,遠(yuǎn)高于非純種犬(表6)。公犬與母犬CPV感染率為85.31%,85.99%(表7)。

表5 華中地區(qū)不同年齡犬CPV的檢測(cè)結(jié)果

表6 華中地區(qū)純種犬與非純種犬CPV的檢測(cè)結(jié)果

表7 華中地區(qū)不同性別犬CPV的檢測(cè)結(jié)果

2.4 華中地區(qū)不同季節(jié)CPV-2的檢測(cè)結(jié)果對(duì)不同季節(jié)的犬進(jìn)行CPV-2檢測(cè),結(jié)果如圖2所示,春季、夏季、秋季、冬季感染率分別為92.68%,62.83%,87.18%,95.56%。該結(jié)果表明不同季節(jié)均易感染,但夏季感染率較低。

圖2 華中地區(qū)不同季節(jié)犬CPV的感染率

2.5 病毒分離與間接免疫熒光鑒定結(jié)果經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的樣品同步接毒F81細(xì)胞,盲傳3代均出現(xiàn)細(xì)胞病變,表現(xiàn)為拉網(wǎng)、脫落、變圓等癥狀。將收集的第1～3代病毒液反復(fù)凍融3次后再次接種F81細(xì)胞,72 h后進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)。結(jié)果顯示,23份陽(yáng)性樣品接毒細(xì)胞可以觀察到綠色熒光,而對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)熒光(圖3),初步分離得到23株CPV將其命名為CPV-22、CPV-25、CPV-26、CPV-27、CPV-28、CPV-29、CPV-36、CPV-39、CPV-40、CPV-41、CPV-46、CPV-47、CPV-49、CPV-51、CPV-53、CPV-54、CPV-57、CPV-59、CPV-61、CPV-62、CPV-63、CPV-67。

A、E、I.分別為1,2,3代CPV病毒液接種F81后間接免疫熒光鑒定;B、F、J.分別為1,2,3代CPV病毒液接種F81后細(xì)胞核DAPI染色;C、G、K.分別為1,2,3代CPV病毒液接種F81后細(xì)胞核染色與熒光染色合并;D、H、L.分別為1,2,3代CPV病毒液接種F81 細(xì)胞后白光觀察;M.未接毒F81細(xì)胞間接免疫熒光鑒定;N.未接毒F81細(xì)胞核DAPI染色;O.未接毒F81細(xì)胞核染色與熒光染色合并;P.未接毒 F81細(xì)胞白光觀察

2.6 VP2基因氨基酸序列分析將23株分離毒株與參考毒株EU659117、EU221279的VP2基因進(jìn)行氨基酸序列比對(duì),基因分型結(jié)果顯示,本研究分離毒株中有12株為New-CPV-2a亞型,占比為52.2%;5株為New-CPV-2b亞型,占比21.7%;6株為CPV-2c亞型,占比26.1%;主要的氨基酸突變?yōu)镕267Y、S297A、A300G、Q370R、N426D、N426E、T440A。分離毒株CPV-26發(fā)生了3個(gè)特殊的突變T44A、K271R、V316I;CPV-36和CPV-39發(fā)生了Q310E突變;CPV-62發(fā)生了A300S和A357N突變;CPV-53發(fā)生了V429I突變;CPV-67毒株發(fā)生了A5G突變。除了CPV-27、CPV-62發(fā)生了A300S突變而其他毒株均發(fā)生了A300G的突變。CPV-62發(fā)生了G452S突變。這些氨基酸位點(diǎn)突變說(shuō)明華中地區(qū)CPV-2正在不斷發(fā)生變異(圖4)。

2.7 VP2基因同源性分析及遺傳進(jìn)化分析用Lasergene 7.0 軟件將分離毒株與參考毒株(表3)的VP2基因進(jìn)行同源性分析,并用MEGA 7.0軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果顯示,分離毒株與參考毒株之間核苷酸同源性為98.5%～100.0%,氨基酸同源性在97.3%～100.0%之間;分離毒株之間核苷酸同源性為97.9%～99.9%,氨基酸同源性為95.9%～100.0%;分離毒株與疫苗株DM381006、EU659116、GU212791的VP2基因氨基酸同源性分別為96.6%～98.1%,97.7%～98.6%,97.5%～98.5%。遺傳進(jìn)化樹顯示,本研究12株New-CPV-2a型毒株與北京、上海、蘭州等分離毒株位于同一進(jìn)化分支;5株New-CPV-2b型毒株與廣州、河南分離毒株位于同一進(jìn)化分支;本研究分離的CPV-2c亞型與山東、河北、中國(guó)臺(tái)灣分離毒株處于同一進(jìn)化分支;本研究分離毒株與阿根廷、意大利、日本分離株不在同一分支,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖5)。

圖4 VP2氨基酸突變位點(diǎn)

2.8 VP2蛋白抗原表位分析及壓力選擇分析CPV-2的VP2蛋白的抗原表位分析預(yù)測(cè)了幾個(gè)主要表位在氨基酸位點(diǎn)0～50,225～325,350～450,475～525之間(圖6A)。在選擇壓力分析中,熵值較大的位點(diǎn)主要在260～330和350～460之間(圖6B)。表位預(yù)測(cè)和選擇壓力分析的結(jié)果彼此一致,表明這些位點(diǎn)出現(xiàn)氨基酸突變的概率較大。

3 討論

本研究檢測(cè)了華中地區(qū)CPV-2,感染率在77.42%～95.83%之間,與丁軻等[13]報(bào)道的河南省CPV-2陽(yáng)性率為88.48%相似。CPV-2感染率在不同年齡、品種季節(jié)之間表現(xiàn)出明顯差異[16],本研究發(fā)現(xiàn)CPV-2感染集中在1～6月齡犬,成年犬陽(yáng)性樣品數(shù)只占5.3%,純種犬陽(yáng)性樣品數(shù)為非純種犬的2倍,春季、秋季、冬季感染率明顯高于夏季,說(shuō)明華中地區(qū)CPV-2流行特點(diǎn)與其他地區(qū)相同。

VP2蛋白是CPV-2最主要的衣殼蛋白,其形成衣殼上的纖突是決定病毒抗原特性和宿主范圍的關(guān)鍵區(qū)域,本研究在分離毒株VP2基因中發(fā)現(xiàn)了8個(gè)新的氨基酸突變T44A、K271R、A300S、Q310E、V316I、A357N、V429I、G452S,這些位點(diǎn)在0～50,225～325,350～450,475～525之間與選擇壓力分析結(jié)果一致。有研究發(fā)現(xiàn)VP2蛋白的GH環(huán)突變率最高,即267～498位氨基酸[17],297位點(diǎn)氨基酸位于B細(xì)胞抗原表位附近,這些氨基酸位點(diǎn)突變可能形成新的抗原表位[18]。有研究表明A300G突變導(dǎo)致CPV-2與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合能力發(fā)生改變而影響其感染宿主范圍[19],本研究中出現(xiàn)的A300S突變是否會(huì)擴(kuò)大其宿主范圍還有待研究。2004年我國(guó)首次報(bào)道了Y324I的突變,2018年意大利報(bào)道了新的突變Y324L[10],本研究分離毒株中大部分為Y324I,未發(fā)現(xiàn)Y324L突變,表明國(guó)內(nèi)外突變趨勢(shì)略有差異。

“●”標(biāo)識(shí)本研究分離毒株;“▲”標(biāo)識(shí)疫苗毒株

A.CPV-VP2的抗原表位預(yù)測(cè);B.CPV-VP2 的氨基酸熵率

2000年意大利首次報(bào)道CPV-2c型毒株后[20],我國(guó)在2014年首次分離到CPV-2c型毒株[21]。2015-2016年江蘇、河南、廣西CPV分離毒株中CPV-2c型占22%,并首次報(bào)道了CPV-2c型中A5G、Q370R的突變[22],本研究中分離的CPV2c型毒株也發(fā)生了A5G、Q370R突變;2015年黑龍江省采集的201份腹瀉病料中95份檢測(cè)出CPV,陽(yáng)性率為47.26%,New-CPV-2a型占64.21%,New-CPV-2b占21.05%,CPV-2c型占14.74%[11];2016-2017年湖北檢測(cè)的15份CPV樣品中80%為CPV-2c型[23],本研究在華中地區(qū)檢測(cè)到New-CPV-2a基因型占比52.2%;New-CPV-2b基因型占比21.7%;CPV-2c基因型占比26.1%。目前New-CPV-2a型是華中地區(qū)最主要的流行毒株但CPV-2c型占比逐漸增加[24],可能成為華中地區(qū)下一個(gè)主要流行毒株。

同源性分析顯示華中地區(qū)分離毒株之間有較大差異,但遺傳進(jìn)化分支顯示不同的分離毒株與國(guó)內(nèi)各地分離株親緣關(guān)系較近,所以通過(guò)華中地區(qū)流行毒株可以推測(cè)并分析國(guó)內(nèi)主要的流行株。本研究分離得到23株CPV-2,并對(duì)其VP2基因序列進(jìn)行分析,確定了華中地區(qū)CPV-2的流行特點(diǎn),為我國(guó)華中地區(qū)CPV-2防控及研制高效疫苗奠定了基礎(chǔ)。