一種水溶性佐劑CS-GTA-ML對H7N9亞型禽流感滅活疫苗免疫效果評價(jià)

尹文竹,許澤玉,鄧碧華,馬 芳,周明旭,王海燕,盧 宇,*,張金秋,*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫工程研究所 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210014;2.江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,江蘇 南京 210014;3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

目前,疫苗提高了預(yù)防傳染性疾病的能力,降低了患病風(fēng)險(xiǎn)。然而,對于一些免疫原性較差的滅活疫苗而言,佐劑是其中必不可缺的關(guān)鍵成份[1]。水性佐劑,即傳統(tǒng)的鋁鹽佐劑,主要誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答,不能有效地刺激細(xì)胞免疫,同時(shí)會引起注射部位局部出現(xiàn)腫脹、紅斑、硬塊等不良反應(yīng)。

殼聚糖(chitosan,CS)是一種來源廣泛、價(jià)格低廉、具有良好生物相容性、可降解性和安全無毒等特點(diǎn)的陽離子型天然高分子聚合物,目前被廣泛應(yīng)用在畜禽飼料及疫苗佐劑。徐懷英等[6]利用其高度黏著性及長鏈結(jié)構(gòu),通過戊二醛乳化交聯(lián)新城疫病毒,制備成口服型新城疫微球疫苗,對強(qiáng)毒株有較強(qiáng)的保護(hù)性,且能同時(shí)促進(jìn)體液免疫和細(xì)胞免疫。但天然的CS在生理pH值下無法溶解,難以發(fā)揮其生物學(xué)活性。因此,解決CS在純水中的溶解性問題,是提高其生物利用度的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其中CS結(jié)構(gòu)中2-位氨基和3,6-位羥基是進(jìn)行化學(xué)修飾的重要位點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,通過雙親性、季磷化[9-10]、季胺化、烷基化、羧基化等化學(xué)修飾對其電荷、結(jié)構(gòu)、親疏水能力等進(jìn)行改造,從而解決CS的溶解性問題。

遞送類載體佐劑配伍疫苗后通過細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi),通過溶酶體逃逸,最終將抗原釋放于細(xì)胞質(zhì)才能發(fā)揮作用,其中溶酶體逃逸是的提高疫苗效力的關(guān)鍵步驟。溶酶體(lysosomes)為單層膜包被的囊狀結(jié)構(gòu),一般為真核細(xì)胞中的一種細(xì)胞器,其內(nèi)部pH值4.5～5.5。嗎啉環(huán)(morpholine)具有弱堿性(pKa = 8.36)作為一種溶酶體靶向定位基團(tuán),在熒光探針領(lǐng)域被廣泛報(bào)道。此外,嗎啉環(huán)具有雙親性,更易透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)含嗎啉環(huán)疫苗進(jìn)入溶酶體后,能在它的酸性微環(huán)境中質(zhì)子化,使得溶酶體膜破裂,破壞了溶酶體結(jié)構(gòu),引發(fā)抗原在溶酶體逃逸,大量的抗原被精準(zhǔn)地遞送給CD4 T細(xì)胞,引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。

本試驗(yàn)首先利用殼聚糖鏈2-位氨基與環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(GTA)發(fā)生加成開環(huán)反應(yīng),制備水溶性CS季銨鹽CS-GTA中間體,然后再與4-(2-氯乙基)嗎啉(ML)進(jìn)行N-烷基化反應(yīng)引入具有溶酶體靶向的嗎啉環(huán)基團(tuán),制備了CS-GTA-ML聚合物。由于CS-GTA-ML的電正性,能與帶負(fù)電荷的抗原通過靜電作用包裹抗原,同時(shí)利用CS對細(xì)胞的黏附性和嗎啉環(huán)的溶酶體靶向性,實(shí)現(xiàn)抗原提呈和溶酶體逃逸,從而起到免疫增強(qiáng)效應(yīng)和抗原遞送功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及細(xì)胞4～6周齡ICR雌性小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。小鼠飼養(yǎng)于獨(dú)立的籠具中,自由采食與飲水,飼料過程中嚴(yán)格按照免疫程序進(jìn)行免疫。SPF雞胚購自濟(jì)南鑫盛達(dá)生物工程有限公司。動物房定期消毒,室內(nèi)溫度為(25±1)℃,濕度為(50±10)%。1%紅細(xì)胞(RBCs)由SPF雞采血分離得到。

1.2 主要試劑CS(MW=20 W)、1 mol/L PBS緩沖液均購自Sigma-Aldrich試劑公司。環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(C6H14ClNO,)、4-(2-氯乙基)嗎啉(C6H12ClNO)、氫氧化鈉(NaOH,AR級)、乙醇(EtOH,AR級)等試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(Sinopharm Chemical Reagent Co.)。DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司產(chǎn)品。CCK-8試劑盒購自上海百賽生物技術(shù)股份有限公司。4%多聚甲醛、紅細(xì)胞裂解液、FITC anti-mouse CD3抗體、APC anti-mouse CD4抗體和PE anti-mouse CD8a抗體均購自上海生物科技股份有限公司。超純水由實(shí)驗(yàn)室Millipore Milli-Q純水儀制備。小鼠細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6及IFN-γ 的ELISA試劑盒均購自上海酶免生物技術(shù)有限公司。

1.3 CS-GTA-ML的制備方法CS-GTA-ML的合成路線如圖1所示。

圖1 CS-GTA-ML的合成路線圖

1.3.1CS-GTA的制備 參照文獻(xiàn)[20]方法,取5 g CS、10 g GTA于250 mL圓底燒瓶中,加入70 mL去離子水,80℃攪拌反應(yīng)8 h,反應(yīng)至溶液澄清時(shí)停止反應(yīng)。將反應(yīng)液在85℃、35 r/min條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。產(chǎn)物不完全蒸干,加入適量95%乙醇洗滌浸泡30 min后取出析出的固體物質(zhì)。粗產(chǎn)品通過抽濾,濾渣繼續(xù)用適量95%乙醇攪拌洗滌。攪拌3 h后,再次抽濾,濾渣利用紅外燈干燥,得到白色固體純品CS-GTA(9.2 g)。

1.3.2CS-GTA-ML的制備 取2 g CS-GTA、2 g ML和1 g NaOH加入到100 mL圓底燒瓶中,加入30 mL去離子水,80℃攪拌反應(yīng)12 h后停止反應(yīng)。待溫度降至室溫后,加入適量95%乙醇洗滌浸泡30 min后取出析出的粗產(chǎn)品。采用相同的純化方式得到白色純品CS-ML-ML(2.5 g)。

1.4 體外細(xì)胞毒性檢測采集ICR小鼠脾臟且去除RBCs后,分離懸浮單一的脾細(xì)胞并細(xì)胞計(jì)數(shù),加入96孔細(xì)胞板中保持 2×106個/孔,然后在37℃、5% CO2條件下孵育24 h;棄去培養(yǎng)基后加入100 μL含不同質(zhì)量濃度CS-GTA-ML的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h;再次棄去培養(yǎng)基后,用PBS緩沖液洗滌1次;最后加入90 μL純DMEM培養(yǎng)基和10 μL的CCK-8試劑繼續(xù)孵育1 h,使用酶標(biāo)儀(Bio-Rad,CA,USA)檢測D450 nm值。按照以下公式進(jìn)行計(jì)算:

1.5 體外溶血試驗(yàn)檢測采集SPF雞的新鮮血樣,1 000 r/min離心10 min收集RBCs。用PBS溶液洗滌3次,然后配制成1%的RBCs懸液,備用。將0.3 mL的 1% RBCs懸液分別加入到1.2 mL不同質(zhì)量濃度(0.005～10 g/L)的CS-GTA-ML溶液中。以1% RBCs懸液分別加入超純水和PBS作為陽性對照和陰性對照。所有樣品利用渦旋振蕩儀快速振蕩30 s后在室溫下放置2 h。4℃、1 500 r/min離心10 min,使用酶標(biāo)儀在D450 nm激發(fā)光下測定上清溶液的D值,并觀察541 nm處的最大D值。其溶血率(HR)由如下式計(jì)算:

1.6 HE組織染色試驗(yàn)20只4～6周齡ICR雌性小鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對照組,每組10只。試驗(yàn)組腹腔注射200 μL CS-GTA-ML(1 g/L),對照組注射相同劑量的PBS緩沖液。7 d內(nèi)觀察小鼠臨床反應(yīng)并記錄其體質(zhì)量變化。注射后7 d,將小鼠安樂處死,分別取其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及注射部位皮膚組織,利用4%多聚甲醛進(jìn)行固定,之后進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、染色,最后通過顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.7 小鼠體內(nèi)免疫評價(jià)試驗(yàn)48只4～6周齡ICR雌性小鼠隨機(jī)分為6組,每組8只。按表1進(jìn)行背部皮下免疫,在接種后14,28,42 d采血并分離血清,用于血凝抑制效價(jià)檢測。所有動物試驗(yàn)均符合江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)倫理要求。

表1 H7N9亞型禽流感滅活疫苗的小鼠免疫試驗(yàn)分組 μL

1.8 SPF雞體內(nèi)免疫評價(jià)60只6周齡SPF雞隨機(jī)分為6組,每組10只。按表2進(jìn)行頸部皮下免疫,在接種后14,28 d采血并分離血清,用于血凝抑制效價(jià)檢測。所有動物試驗(yàn)均符合江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)倫理要求。

表2 H7N9亞型禽流感滅活疫苗的SPF雞免疫試驗(yàn)分組 μL

1.9 脾CD4+、CD8a+T淋巴細(xì)胞的流式分析隨機(jī)每組抽取3只免疫后28 d的小鼠,安樂處死后取出脾臟并分離脾細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整為2×106個/150 μL的單分散脾細(xì)胞懸液,分別加入FITC anti-mouse CD3抗體、APC anti-mouse CD4抗體和PE anti-mouse CD8a抗體,4℃避光共孵育30 min,PBS洗滌2次后,通過BD AccuriTMC6 Plus流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 CS-GTA-ML的結(jié)構(gòu)表征CS主鏈上引入嗎啉環(huán)和季銨鹽后得到CS-GTA-ML,CS-GTA-ML能被核磁共振氫譜(1H NMR)和傅里葉紅外光譜(FT-IR)所表征。

如圖2A所示,CS、CS-GTA和CS-GTA-ML在D2O中的1H NMR中,δ 1.97×10-6(綠色區(qū)域)為CS去乙酰化殘留甲基質(zhì)子峰;和CS相比,CS-GTA和CS-GTA-ML分別在約3.21×10-6處觀察到一個非常強(qiáng)的峰值,表明季銨側(cè)鏈中的甲基基團(tuán)存在;在紅色區(qū)域δ 2.494×10-6,4.381×10-6,3.413×10-6處的峰可以歸屬為H-a、H-b和H-c。和CS-GTA相比,CS-GTA-ML在藍(lán)色區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)一個新峰,表明嗎啉環(huán)被修飾在CS的主鏈上。利用峰寬半定量估算出GTA嫁接率約為53%,ML的嫁接率約為15%。

同樣利用FI-IR(圖2B)可以觀察到,CS被GTA修飾后,在約1 478 cm-1處出現(xiàn)N-CH3的C-H不對稱彎曲振吸收峰(綠色區(qū)域)。一般來說,甲基的C-H不對稱彎曲振動吸收峰約為1 430 cm-1。由于季銨鹽陽離子強(qiáng)的吸電子效應(yīng),使得其向高波數(shù)方向移動。ML被修飾到CS-GTA分子中后,出現(xiàn)1個1 127 cm-1的新峰[23]。與ML的紅外譜圖相比,可以認(rèn)為它來自于ML環(huán)C-N伸縮振動吸收峰。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了CS-GTA-ML的結(jié)構(gòu)。

圖2 CS、CS-GTA和CS-GTA-ML的1H NMR圖(溶劑為D2O)(A)、FI-IR圖(B)和Zeta電位圖(C)

從圖2C中可以看出,隨著CS主鏈上GTA、ML的嫁接,中間體CS-GTA和目標(biāo)佐劑CS-GTA-ML仍帶正電荷分別為38.1,15.4 mV。配伍帶負(fù)電荷的H7N9亞型禽流感滅活抗原后,仍保持著12.5 mV的電正性。

此外,從表3中可以發(fā)現(xiàn)CS-GTA-ML在不同pH值下的水溶液中均可以溶解,在pH=5.5的酸性Tris緩沖液中最大溶解度為82.4 g/L;在pH=7.2的生理緩沖液(PBS)中最大溶解度為67.2 g/L;在pH=8.9的堿性Tris緩沖液中的最大溶解度為78.6 g/L。

表3 CS-GTA-ML在不同pH值下水溶液中的溶解度

2.2 CS-GTA-ML的生物相容性評價(jià)利用小鼠原代脾細(xì)胞為模式細(xì)胞器,配置不同質(zhì)量濃度的CS-GTA-ML進(jìn)行體外安全性評價(jià)。如圖3所示,當(dāng)質(zhì)量濃度低于50 mg/L時(shí),CS-GTA-ML對脾細(xì)胞有增殖效果;當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg/L時(shí),其細(xì)胞存活率仍高達(dá)92%;當(dāng)質(zhì)量濃度高達(dá)2 000 mg/L時(shí),脾細(xì)胞仍有73%左右的存活率。

從圖4的直觀圖中可以看出,隨著CS-GTA-ML質(zhì)量濃度的提高,EP管中上清液呈無色透明狀,RBCs沉積在管底、仍無破裂。從光譜圖中也可以看出D值隨著CS-GTA-ML質(zhì)量濃度的增加無明顯變化。當(dāng)質(zhì)量濃度高達(dá)10 g/L時(shí),通過公式計(jì)算發(fā)現(xiàn)HR僅0.5%左右,幾乎沒有溶血現(xiàn)象。

隨后,對皮下注射后7 d小鼠連續(xù)觀察其生活和精神狀態(tài),試驗(yàn)組(CS-GTA-ML)小鼠飲食、睡眠及精神狀態(tài)正常,小鼠被毛柔順,注射部位未出現(xiàn)紅腫、發(fā)炎、脫毛等反應(yīng)。進(jìn)一步對小鼠的重要器官和注射部位皮膚進(jìn)行病理切片分析(圖5),心臟、肝臟、脾臟、肺臟等臟器均無病變和損傷,其注射部位皮膚也未出現(xiàn)炎癥反應(yīng)等。

圖3 不同質(zhì)量濃度的CS-GTA-ML對原代脾細(xì)胞存活率

圖4 CS-GTA-ML的HR

圖5 小鼠注射1 g/L的CS-GTA-ML的組織病理觀察結(jié)果

2.3 CS-GTA-ML的血凝抑制效價(jià)評估利用免疫試驗(yàn)驗(yàn)證CS-GTA-ML的免疫增強(qiáng)活性。首先根據(jù)圖6的免疫方式和次數(shù)小鼠皮下免疫,并在免疫后7 d后開始采血進(jìn)行檢測。如圖7所示,免疫后7 d,對照組與試驗(yàn)組無顯著性差異(P>0.05);免疫14 d后,添加佐劑組疫苗免疫組小鼠血清HI效價(jià)均顯著提高,其中CS-GTA-ML+H7N9-100 mg/L組HI效價(jià)略高于ISA206+H7N9組(P<0.05)。至首次免疫后6周,隨著免疫時(shí)間的延長,CS-GTA-ML免疫組小鼠仍保持著較高的抗體水平。

定期監(jiān)測小鼠的體質(zhì)量變化,結(jié)果如圖8所示,免疫42 d后不同質(zhì)量濃度的CS-GTA-ML的H7N9疫苗組小鼠均生長良好,與PBS組和純H7N9疫苗組相比較,小鼠體質(zhì)量增加1.5 g左右,與ISA206+H7N9疫苗組小鼠體質(zhì)量接近,各組之間無顯著性差異(P>0.05)。

由圖9可見,SPF雞皮下免疫14 d后,CS-GTA-ML+H7N9-100 mg/L組HI效價(jià)仍顯著高于H7N9組(P<0.001),且與ISA206+H7N9組HI效價(jià)無顯著性差異(P>0.05)。但是,免疫28 d后,CS-GTA-ML+H7N9-100 mg/L組HI效價(jià)仍顯著高于ISA206+H7N9組(P<0.05)。

2.4 細(xì)胞因子檢測通過ELISA試劑盒對免疫后28 d采集的小鼠血清進(jìn)行IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ檢測。如圖10所示,與單一的H7N9疫苗對比,添加佐劑(ISA206和CS-GTA-ML)后,免疫后小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ均顯著上調(diào);與ISA206+H7N9組相比,CS-GTA-ML+H7N9-100 mg/L 組小鼠血清的IL-2(P<0.05)、IL-6(P<0.05)和IFN-γ(P<0.05)表達(dá)量有顯著性升高,而IL-4的表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)。

2.5 脾淋巴細(xì)胞中CD4+和CD8a+細(xì)胞亞群流式分析為了進(jìn)一步研究CS-GTA-ML對淋巴細(xì)胞的作用機(jī)制,通過流式細(xì)胞分析不同免疫組對脾T淋巴細(xì)胞分化的影響。

皮下免疫不同疫苗組后28 d,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測不同疫苗免疫組小鼠脾細(xì)胞中CD3+CD4+及CD3+CD8a+的比例。如圖11所示,試驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞中CD3+CD4+T細(xì)胞比例顯著高于空白對照(PBS)組,且添加CS-GTA-ML+H7N9-100 mg/L或ISA206+H7N9的疫苗組免疫后,小鼠脾細(xì)胞中CD3+CD4+T細(xì)胞比例顯著高于單純H7N9抗原免疫組。另外,結(jié)合CD8a+/CD4+比值可以發(fā)現(xiàn),CS-GTA-ML能顯著提高CD8a+T細(xì)胞的比例(圖11E)。

圖6 小鼠免疫試驗(yàn)方案

圖7 小鼠免疫后血清的HI抗體

圖8 小鼠免疫后體質(zhì)量變化

圖9 SPF雞免疫后28 d血清的HI抗體

圖10 小鼠免疫后血清中IL-2(A)、IL-4(B)、IL-6(C)和IFN-γ(D)的質(zhì)量濃度

圖11 流式細(xì)胞儀檢測免疫不同組別小鼠的脾CD4+、CD8a+T細(xì)胞的表達(dá)

3 討論

免疫佐劑是配合抗原使用的無免疫原且增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答的新物質(zhì)[24]。理想的免疫佐劑能在減少抗原用量及免疫次數(shù)的前提下產(chǎn)生高效免疫應(yīng)答,便于生產(chǎn)和使用。傳統(tǒng)的獸用油乳佐劑因代謝緩慢造成不良反應(yīng),因而亟需開發(fā)新型佐劑。有研究發(fā)現(xiàn),生物可降解材料CS已被證實(shí)具有佐劑性能,不僅能夠作為疫苗載體遞送[25-26],還能作為免疫增強(qiáng)劑[27]。通常將CS溶解在鹽酸溶液中,直鏈上的氨基吸附H+使其質(zhì)子化,形成帶正電荷的結(jié)構(gòu),便于通過電荷響應(yīng)負(fù)載抗原。但其僅能在酸性環(huán)境中溶解的缺點(diǎn)限制了進(jìn)一步的佐劑應(yīng)用。

本研究通過溫和的合成路線制備出CS-GTA-ML,并在不同pH環(huán)境下展現(xiàn)出良好的水溶性,通過體內(nèi)外生物相容性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其無毒、生物相容性好,為注射劑型的應(yīng)用提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。配合滅活H7N9亞型流感病毒評估CS-GTA-ML的免疫增強(qiáng)性能,不同質(zhì)量濃度CG-GTA-ML的血凝抑制效果不低于商品化的ISA206,且免疫42 d后仍有較高的血凝抑制作用,延長了免疫持續(xù)期。

CS刺激免疫效力有很多因素,如激活巨噬細(xì)胞、誘發(fā)研發(fā)性超敏反應(yīng)和產(chǎn)生循環(huán)抗體、誘發(fā)殺傷性淋巴細(xì)胞(CD8+)、激發(fā)NK細(xì)胞及誘發(fā)細(xì)胞因子等。本研究首先通過對免疫后2周的血清進(jìn)行細(xì)胞因子的檢測,發(fā)現(xiàn)CS-GTA-ML誘導(dǎo)機(jī)體分泌高水平的Th1型(INF-γ和IL-2)和Th2型(IL-6)細(xì)胞因子,初步判斷具有一定的體液和細(xì)胞雙重免疫。T淋巴細(xì)胞的活化及分化影響免疫途徑,其中CD4和CD8是兩個重要的細(xì)胞表面指標(biāo)。CD4+T細(xì)胞能夠參與Th細(xì)胞TCR識別抗原的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),在免疫反應(yīng)過程通常發(fā)揮輔助機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答的功能,CD8+T細(xì)胞則是重要的效應(yīng)細(xì)胞,具有殺傷靶細(xì)胞的功能。同時(shí),CD4+/CD8a+的比值同樣可以說明免疫增強(qiáng)作用的大小。進(jìn)一步探究對T淋巴細(xì)胞的分化,CS-GTA-ML刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的CD4+T細(xì)胞,可能是MHC Ⅱ類分子通過溶酶體途徑遞呈進(jìn)入淋巴細(xì)胞中,同時(shí)CD4+與CD8a+比值增加驗(yàn)證T淋巴細(xì)胞趨向于CD4的分化,誘導(dǎo)機(jī)體分泌大量的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子,增強(qiáng)了機(jī)體免疫應(yīng)答能力。

因此,推測帶有正電荷的CS-GTA-ML靜電結(jié)合H7N9滅活疫苗后通過皮下注射到機(jī)體后,利用CS的黏著性將疫苗帶入到DC細(xì)胞中,并通過嗎啉環(huán)的靶向溶酶體后,引起“質(zhì)子海綿效應(yīng)”,使得溶酶體內(nèi)環(huán)境吸收大量的H+,導(dǎo)致溶酶體膜內(nèi)外滲透壓變化,使得溶酶體膜破碎,引發(fā)溶酶體逃逸能力,將H7N9抗原緩慢釋放至細(xì)胞質(zhì)中,持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞雙重免疫。