金毛狗脊原葉體增殖和孢子體轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

黃嘉鳳, 但 俊, 黃滿霖, 陳選鵬, 黃海波

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院, 廣州 510006)

金毛狗脊[Cibotiumbarometz(L. ) J. Sm.]為蚌殼蕨科(Dicksoniaceae)金毛狗屬(CibotiumKaulf.)多年生大型樹狀陸生蕨類[1],又稱金毛猴、狗青、百枝、金毛狗等,以根狀莖入藥,具有祛風(fēng)濕、補肝腎、強腰膝等功效,適用于腰背酸痛、風(fēng)寒濕痹、手足麻木及半身不遂等癥,是重要的藥用植物[2]。金毛狗脊植株具有四季常綠的大型羽狀葉,且根狀莖和葉柄基部密被金色茸毛而狀似伏地的金毛狗,形態(tài)獨特,具有較高的經(jīng)濟開發(fā)價值[3-4]。雖然金毛狗脊分布范圍較廣,但由于生存環(huán)境破壞嚴(yán)重以及人為大量采挖等因素的影響,野生資源量不斷減少,已被列為國家二級保護植物[5]。通過金毛狗脊組織培養(yǎng)的研究,對保護野生資源、擴大該物種的數(shù)量,對該物種的開發(fā)利用等具有重要意義。

目前,針對金毛狗脊的組織培養(yǎng)研究多集中在金毛狗脊的孢子萌發(fā)[6-7]、配子體發(fā)育[8-9]和孢子體誘導(dǎo)[10]方面,缺乏對金毛狗脊原葉體增殖和孢子體誘導(dǎo)分化方面的研究。蘇鈺琴[10]研究了6-BA對金毛狗脊孢子體誘導(dǎo)分化的影響;李雪等[6]研究了無機鹽濃度和是否添加KT、NAA和BA對孢子體誘導(dǎo)的影響,但其考察的影響金毛狗脊生長發(fā)育的因素還不夠完善,且因素水平設(shè)置不夠。因此,設(shè)計無機鹽、蔗糖、KT、NAA和6-BA等5因素4水平正交實驗,研究金毛狗脊原葉體增殖和孢子體轉(zhuǎn)化的最佳培養(yǎng)條件,為金毛狗脊組織培養(yǎng)提供理論依據(jù),以更好地實現(xiàn)金毛狗脊孢子無菌繁殖培養(yǎng)。

1 材料與方法

1.1 孢子的采集

金毛狗脊孢子于2021年4月17日采自廣州花都區(qū)梯面鎮(zhèn)西坑村,113°14′15.12″E,23°34′40.76″N,海拔101 m。采集孢子時將背面有成熟孢子囊的羽片剪下,用干凈的報紙包裹并裝于干凈的密封袋中帶回實驗室,于室內(nèi)通風(fēng)干燥處放置1 d,輕輕拍打使孢子囊內(nèi)的孢子充分脫落,取出羽片后把報紙上的孢子先后用60目和200目的金屬篩過篩,得到較為純凈的孢子粉。過篩后的孢子粉收集于50 mL離心管內(nèi),密封條密封,放入密封袋中于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 孢子的消毒

孢子在接種前進行消毒處理,稱取適量金毛狗孢子,置于2 mL離心管中,先用無菌水潤濕,離心去掉上清液,加入5%次氯酸鈉水溶液,浸泡消毒4 min,離心去上清液,用無菌水清洗3～5次,加入蒸餾水至2 mL搖勻。

1.3 培養(yǎng)基的篩選

采用正交設(shè)計考察不同濃度的無機鹽、蔗糖、萘乙酸(NAA)、激動素(KT)和6-芐氨基嘌呤(6-BA)對金毛狗脊原葉體增殖和孢子體轉(zhuǎn)化的影響,用L16(45)正交表安排實驗,見表1。

表1 金毛狗脊原葉體增殖和孢子體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基正交設(shè)計Table 1 Orthogonal design table of Cibotium barometzprotophyll proliferation and sporophyte transformation medium

1.4 實驗方法

從孢子接種培養(yǎng)60～80 d所得原葉體中,選取生長良好無污染的翠綠色原葉體團在超凈工作臺上,將其剝離開,分割成1 cm3的小原葉體團,每瓶接種5個原葉體團(圖1),16個處理組,每組15瓶。接種30 d后將原葉體團取出稱量每瓶的總鮮重,使用烘箱,于60 ℃烘干6 h,稱量每瓶總干重,得到原葉體增殖后的重量數(shù)據(jù)[11]。

注:A為接種前;B為接種后;培養(yǎng)瓶直徑6.8 cm。圖1 金毛狗脊原葉體Fig.1 Cibotium barometz protolophylls

圖3 16個處理組金毛狗脊孢子體轉(zhuǎn)化結(jié)果Fig.3 Transformation results of sporophytes in 16 treatment groups

同樣方法,每瓶接種5個原葉體團,16個處理組,每組15瓶。培養(yǎng)80 d后計算孢子體轉(zhuǎn)化數(shù)和孢子體轉(zhuǎn)化率,得到孢子體轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)。以第一片孢子小葉片出現(xiàn)視為孢子體開始轉(zhuǎn)化,預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)原葉體接種40～55 d后開始轉(zhuǎn)化,故原葉體增殖培養(yǎng)以原葉體接種30 d后統(tǒng)計數(shù)據(jù),孢子體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)開始轉(zhuǎn)化30 d后(原葉體接種80 d后)進行孢子體轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計

數(shù)據(jù)采用Minitab軟件對指標(biāo)的綜合評分進行極差分析,采用SPSS軟件對原始數(shù)據(jù)進行非參數(shù)檢驗分析。孢子體轉(zhuǎn)化數(shù)為每瓶從5個原葉體團觀測到的小孢子體總數(shù)。

孢子體轉(zhuǎn)化率/%=(原葉體團轉(zhuǎn)化數(shù)/原葉體接種團數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基配比對金毛狗脊原葉體增殖的影響

表2結(jié)果表明,無機鹽、蔗糖和NAA濃度對金毛狗脊原葉體增殖有顯著影響,而KT濃度對原葉體增殖無顯著影響,原葉體鮮重表明,6-BA濃度對原葉體增殖影響無顯著差異,從原葉體干重結(jié)果可知,6-BA濃度對原葉體增殖存在顯著影響。隨著無機鹽濃度升高,原葉體重量呈先升后降趨勢,最佳無機鹽濃度為1/2MS,在無機鹽為零的13～16處理組中,原葉體生長發(fā)育較差,發(fā)黃發(fā)蔫;隨著蔗糖濃度升高,原葉體重量先增后減,添加2%蔗糖最為適宜。原葉體重量隨著NAA濃度提高呈先增后減又增的趨勢,當(dāng)NAA濃度為0.1 mg/L時,原葉體增殖結(jié)果最佳;原葉體重量隨著6-BA濃度提高呈先減后增又減的趨勢,當(dāng)6-BA濃度為0.3 mg/L時,原葉體增殖效果最佳。

表2 不同培養(yǎng)基配比對金毛狗脊原葉體增殖的影響Table 2 Effects of different media ratios on the proliferation of protolophylls in Cibotium barometz

由于實驗涉及原葉體鮮重和原葉體干重兩個指標(biāo),因此采用排隊評分法[12]對實驗結(jié)果進行分析,原葉體重量從小到大排序依次評分1～16分,將每組實驗的兩個指標(biāo)得分相加即得綜合評分(表3),隨即進行極差分析,分析結(jié)果如表4所示。

表3 原葉體增殖排隊評分法結(jié)果Table 3 Results of protophyll proliferation queuing scoring method

表4 原葉體增殖排隊評分法極差分析Table 4 Extreme analysis table of protophyll proliferation queuing scoring method

在16組實驗中,Y8組原葉體鮮重、干重和實驗綜合評分最高,條件為1/2MS+3%蔗糖+0.3 mg/L KT+0.1 mg/L NAA,原葉體干重和鮮重分別為1.798 1 g、0.159 1 g。根據(jù)極差分析結(jié)果(表5),5個因素對金毛狗脊原葉體增殖的影響為:蔗糖(B)>無機鹽(A)>NAA(D)>6-BA(E)>KT(C),最佳培養(yǎng)基配比為B3A2D2E3C2,即1/2MS+2%蔗糖+0.1 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT。

表5 不同培養(yǎng)基配比對原葉體增殖的影響非參數(shù)檢驗Table 5 Nonparametric test of the effect of different media ratios on protophyll proliferation

2.2 不同培養(yǎng)基配比對金毛狗脊孢子體轉(zhuǎn)化的影響

表6結(jié)果表明,無機鹽、KT、NAA和6-BA濃度對金毛狗脊孢子體轉(zhuǎn)化有顯著影響,而蔗糖濃度對孢子體轉(zhuǎn)化無顯著影響。隨著無機鹽濃度升高,孢子體轉(zhuǎn)化數(shù)和轉(zhuǎn)化率均呈先升后降趨勢,1/4MS對于孢子體轉(zhuǎn)化最適宜,在無機鹽為零的13～16處理組中,原葉體生長發(fā)育較差,逐漸發(fā)黃并死亡,無法誘導(dǎo)孢子體;隨著NAA濃度提高,孢子體轉(zhuǎn)化數(shù)和孢子體轉(zhuǎn)化率呈先增后減又增的趨勢,當(dāng)NAA濃度為0.1 mg/L時,孢子體轉(zhuǎn)化結(jié)果最佳;隨著6-BA濃度提高,孢子體轉(zhuǎn)化數(shù)和孢子體轉(zhuǎn)化率呈先減后增又減的趨勢,不添加6-BA時,孢子體轉(zhuǎn)化效果最佳;孢子體轉(zhuǎn)化數(shù)和孢子體轉(zhuǎn)化率隨著KT濃度的提高呈先減后增的趨勢,當(dāng)KT濃度為0.5 mg/L時,孢子體轉(zhuǎn)化結(jié)果最佳。

表6 不同培養(yǎng)基配比對孢子體轉(zhuǎn)化的影響Table 6 Effects of different media ratios on sporophyte transformation

由于實驗指標(biāo)同樣有兩個:孢子體轉(zhuǎn)化數(shù)和孢子體轉(zhuǎn)化率,因此采用排隊評分法對實驗結(jié)果進行分析,從小到大排序給分,轉(zhuǎn)化數(shù)和轉(zhuǎn)化率為0的均給1分,其余依次下去,數(shù)據(jù)相同則取平均,如排名為7的數(shù)據(jù)有兩組,則評分為7.5分,將每組實驗的兩個指標(biāo)分?jǐn)?shù)相加即得綜合評分(表7),隨即進行極差分析,分析結(jié)果如表8所示。

表7 孢子體轉(zhuǎn)化排隊評分法結(jié)果數(shù)據(jù)Table 7 Sporophyte transformation queuing scoring method result data

表8 孢子體轉(zhuǎn)化排隊評分法極差分析Table 8 Extreme analysis table of sporophyte transformation queuing scoring method

表9 不同培養(yǎng)基配比對孢子體轉(zhuǎn)化的影響非參數(shù)檢驗Table 9 Nonparametric test of the effect of different media ratios on sporophyte transformation

在16組實驗中,Y10組孢子體轉(zhuǎn)化數(shù)、轉(zhuǎn)化率和實驗綜合評分最高,即條件為1/4MS+1%蔗糖+0.5 mg/L KT+0.3 mg/L NAA,孢子體轉(zhuǎn)化數(shù)和轉(zhuǎn)化率分別為61.44和100%。Y6組孢子體轉(zhuǎn)化率雖然也達到100%,但孢子體轉(zhuǎn)化數(shù)僅為37.78,僅為Y10組(61.44)的50%,故Y6組劣于Y10組。根據(jù)極差分析(表8),5個因素對金毛狗脊孢子體轉(zhuǎn)化的影響為:無機鹽(A)>蔗糖(B)>KT(C)>6-BA(E)>NAA(D),最佳培養(yǎng)基配比為A3B2C4E1D2,即1/4MS+1%蔗糖+0.5 mg/L KT+0.1 mg/L NAA。

圖2 16個處理組金毛狗脊原葉體增殖結(jié)果 Fig.2 Proliferation results of protolophylls of Cibotium barometz in 16 treatment groups

3 結(jié)論與討論

培養(yǎng)基中無機鹽濃度對金毛狗脊原葉體的生長發(fā)育和孢子體轉(zhuǎn)化都有顯著影響。本研究表明,金毛狗脊原葉體增殖宜采用1/2MS,孢子體轉(zhuǎn)化宜采用1/4MS。在無機鹽為零的處理組中,原葉體生長發(fā)育較差,逐漸發(fā)黃并死亡,無法誘導(dǎo)孢子體,不能正常生長發(fā)育,這說明在金毛狗脊原葉體增殖和孢子體轉(zhuǎn)化過程中,無機鹽是必不可少的成分,且低濃度的無機鹽更適宜于金毛狗脊原葉體的生長發(fā)育。李雪等[6]認(rèn)為,低鹽離子濃度有利于金毛狗脊孢子體的誘導(dǎo),1/10 MS孢子體誘導(dǎo)相對最高。本實驗結(jié)果與之有一定差異,原因有待進一步驗證。

蔗糖可為蕨類植物的生長發(fā)育提供碳源,同時調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的滲透壓。在蔗糖對金毛狗脊原葉體增殖和孢子體轉(zhuǎn)化影響的研究中發(fā)現(xiàn),蔗糖對金毛狗脊的原葉體增殖影響較大,但對金毛狗脊的孢子體轉(zhuǎn)化無明顯影響,在一定范圍內(nèi),較高的蔗糖含量更有利于金毛狗脊的原葉體增殖,而金毛狗脊孢子體轉(zhuǎn)化對蔗糖的需求不高,因此培養(yǎng)中可不添加或少量添加蔗糖。吳華等[13]對扇葉鐵線蕨(AdiantumflabellulatumL.)的研究表明,蔗糖有利于分生區(qū)的發(fā)育和性器官的分化,本實驗結(jié)果與之一致;而在孢子體轉(zhuǎn)化上結(jié)果不同,蔗糖對金毛狗脊孢子體轉(zhuǎn)化影響不顯著,原因可能為蕨類植物之間存在一定差異,金毛狗脊孢子體轉(zhuǎn)化相較扇葉鐵線蕨對蔗糖的需求更少。

本研究表明,NAA和6-BA對金毛狗脊原葉體增殖和孢子體轉(zhuǎn)化均有顯著影響。添加低濃度NAA(0.1 mg/L),有利于金毛狗脊原葉體增殖和孢子體轉(zhuǎn)化,且生根也較多,可以達到孢子體誘導(dǎo)的目的;與王益和[14]的實驗結(jié)果一致。添加低濃度6-BA(0.3 mg/L),有利于金毛狗脊原葉體增殖;不添加6-BA對孢子體轉(zhuǎn)化更適宜。蘇鈺琴[10]在原葉體接種25 d后統(tǒng)計金毛狗脊孢子體分化率,發(fā)現(xiàn)隨著6-BA濃度的增加,孢子體分化率提高,原葉體變得緊實,當(dāng)6-BA濃度達1.5 mg/L時,分化率最高,再加大6-BA的濃度,分化率降低。本實驗結(jié)果與其不一致,原因可能是原葉體初始大小和培養(yǎng)天數(shù)的不同,導(dǎo)致所得到的孢子體轉(zhuǎn)化率不一致;另外,6-BA濃度設(shè)置的不同,金毛狗脊的孢子體轉(zhuǎn)化可能需要較高濃度的6-BA,有待進一步的驗證。KT對金毛狗脊的孢子體轉(zhuǎn)化有利,隨著KT濃度的提高,孢子體轉(zhuǎn)化數(shù)和孢子體轉(zhuǎn)化率呈先減后增的趨勢,原因可能為金毛狗脊生長所需KT濃度較高,不在實驗濃度范圍內(nèi),有待進一步研究。李雪等[6]實驗顯示,KT(0.1 mg/L)有利于金毛狗孢子體誘導(dǎo);孫曉丹[15]對桂皮紫萁(OsmundacinnamomeaL. var. Asiatica)的研究中顯示,一定濃度的KT有利于桂皮紫萁原葉體增殖和孢子體轉(zhuǎn)化。因此,金毛狗脊原葉體增殖需要低濃度的NAA和6-BA,對KT無明顯需求;孢子體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)同樣需要低濃度的NAA和6-BA,KT或需要更高濃度。