凍存對(duì)復(fù)溶后人粒細(xì)胞刺激因子國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品生物學(xué)活性的影響

朱留強(qiáng)，史新昌，劉蘭，裴德寧，于雷，秦璽，周勇，王軍志

中國(guó)食品藥品檢定研究院國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050

人粒細(xì)胞刺激因子（human granulocyte colonystimulating factor，hG-CSF）是我國(guó)治療性重組生物制品的重要產(chǎn)品，該產(chǎn)品為小容量注射劑，主要用于治療放療、化療及骨髓移植后中性粒細(xì)胞減少癥［1-2］。對(duì)再生障礙性貧血、骨髓再生不良、燒傷和艾滋病也有應(yīng)用［3-4］。另外，近幾年hG-CSF 有了新的應(yīng)用領(lǐng)域，如脊髓損傷［5-6］、生殖領(lǐng)域［7-11］等。

目前治療癌癥的主要手段仍是傳統(tǒng)的放療、化療和手術(shù)治療［12］。hG-CSF 制品是治療放療、化療后中性粒細(xì)胞減少的主要細(xì)胞因子類(lèi)制品［1］。因此，對(duì)于hG-CSF 制品的質(zhì)量控制就顯得尤為重要，特別是其生物學(xué)活性。為了緩解hG-CSF 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的庫(kù)存壓力，提高國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的利用率，探究hG-CSF國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶后的穩(wěn)定性十分必要。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品在統(tǒng)一量值和標(biāo)準(zhǔn)方面發(fā)揮著不可替代的作用。目前，細(xì)胞因子類(lèi)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品基本均采用凍干保存。據(jù)了解，有生產(chǎn)企業(yè)使用復(fù)溶后凍存的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行活性測(cè)定。為評(píng)估凍存對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品是否有影響，本研究對(duì)目前正在使用的第2批hG-CSF 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析。利用Eyrlng 方程擬合出溫度和時(shí)間與活性衰減間的關(guān)系，從而推算復(fù)溶后國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品在不同溫度下的儲(chǔ)存時(shí)間，對(duì)凍融1 次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以期為復(fù)溶后標(biāo)準(zhǔn)品的凍存提供數(shù)據(jù)支持，提高h(yuǎn)G-CSF 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的利用效率，為hG-CSF 制品的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)，也為其他凍干標(biāo)準(zhǔn)品的復(fù)溶后儲(chǔ)存提供參考。

1 材料與方法

1.1標(biāo)準(zhǔn)品 第2批hG-CSF國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品由本院制備，活性值為420萬(wàn)IU／支［13］，批號(hào)：（270031-201601）。該標(biāo)準(zhǔn)品凍干保存于安瓿瓶中，通過(guò)熱加速穩(wěn)定性試驗(yàn)預(yù)測(cè)在-30 ℃儲(chǔ)存時(shí)，活性衰減10%，約417個(gè)月［13］。

1.2細(xì)胞 NFS-60細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3主要試劑及儀器 RPMI1640培養(yǎng)基（22400-089）和HI FBS（16140-071）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；96 孔板（3599）和25 cm2培養(yǎng)瓶（430639）購(gòu)自美國(guó)Corning 公司；Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide（M2128）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；凍存管（BS-05-STL）購(gòu)自中國(guó)蘭杰柯科技有限公司；多功能酶標(biāo)儀Molecular Device PLUS 384購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司。

1.4標(biāo)準(zhǔn)品的復(fù)溶及凍存 取7支hG-CSF國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入1 mL 滅菌注射用水復(fù)溶后合并，于15 mL離心管中混勻，分裝于500μL凍存管中，每管80μL，分3組，分別于-80、-40、-20 ℃保存。

1.5復(fù)溶凍存標(biāo)準(zhǔn)品的預(yù)稀釋 分別于保存第1、2、3、5、6個(gè)月取樣，每次取出各溫度保存的復(fù)溶凍存標(biāo)準(zhǔn)品各3支，在同一塊96孔板中進(jìn)行預(yù)稀釋?zhuān)坎较♂尣荒艹^(guò)10 倍）。每支取出50μL 在96 孔板預(yù)稀釋1 萬(wàn)倍，依據(jù)《中國(guó)藥典》三部（2020 版）通則3525測(cè)定活性［14］。

1.6數(shù)據(jù)分析 以-80 ℃保存的復(fù)溶凍存標(biāo)準(zhǔn)品為100%活性對(duì)照品，分析各溫度間隨時(shí)間變化的關(guān)系。應(yīng)用熱動(dòng)力溫度衰減軟件擬合Eyrlng 方程：ln{k（t）} =A+B／T+ln（T）。

用臨用前復(fù)溶的凍干標(biāo)準(zhǔn)品定量-80 ℃存放不同時(shí)間的復(fù)溶后凍存標(biāo)準(zhǔn)品，用于分析凍融的影響。采用IBM SPSSstatistics 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α = 0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，熱動(dòng)力溫度衰減軟件擬合Eyrlng 方程為：ln{k（t）}=6.75-3 772.20／T+ln（T），R2= 0.969。通過(guò)該公式可推算出，以衰減5%為參考，在-80 ℃可儲(chǔ)存約93.4 個(gè)月，在-40 ℃可儲(chǔ)存約2.7個(gè)月，在-20 ℃可儲(chǔ)存約0.7個(gè)月。

用臨用前復(fù)溶的標(biāo)準(zhǔn)品定量-80 ℃存放不同時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)品，以臨用前復(fù)溶?chē)?guó)家活性標(biāo)準(zhǔn)品420萬(wàn)／IU為1，凍融1 次國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品活性值約下降了24%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.034，P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定復(fù)溶組結(jié)果Tab.2 Standard determination of reconstituted group

3 討論

hG-CSF 活性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品在國(guó)內(nèi)的hG-CSF 制品活性測(cè)定中起到統(tǒng)一和規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的作用，用于定量不同生產(chǎn)企業(yè)、不同規(guī)格hG-CSF 制品的生物學(xué)活性［15］。本研究參考hG-CSF 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品熱加速穩(wěn)定性試驗(yàn)方法［13］，通過(guò)擬合方程推斷出儲(chǔ)存條件與活性衰減的關(guān)系，再結(jié)合臨用前復(fù)溶的標(biāo)準(zhǔn)品定量-80℃存放不同時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

Eyrlng 方程是反映化學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)與溫度之間的關(guān)系式。在不同溫度下發(fā)生的同一反應(yīng)的前提下，僅只有速率不一樣，被廣泛應(yīng)用于貯存壽命預(yù)測(cè)［16-17］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)公式推算出在-80 ℃儲(chǔ)存時(shí)，如僅考慮凍存時(shí)間的影響，生物學(xué)活性衰減5%，約需93.4 個(gè)月，月衰減率為0.054%；但在用臨用前復(fù)溶的標(biāo)準(zhǔn)品考察-80 ℃存放不同時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，發(fā)現(xiàn)-80 ℃存放不同時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)品均衰減顯著，若再繼續(xù)用于活性測(cè)定，將造成測(cè)量不準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，半年以內(nèi)-80 ℃凍存對(duì)活性幾乎不產(chǎn)生影響，但凍融所產(chǎn)生的影響顯著。

在考察凍融對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的影響時(shí)，不能確定凍融時(shí)是否有一個(gè)快速下降期，因此將第1 個(gè)月的時(shí)間節(jié)點(diǎn)設(shè)置為靜止期。通過(guò)比較熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定復(fù)溶組試驗(yàn)結(jié)果，短期凍存對(duì)生物活性影響不大，活性的衰減發(fā)生在凍融時(shí)。

另外，一方面，低溫貯存于螺旋瓶中，升華或揮發(fā)會(huì)對(duì)制品濃度造成影響，從而對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品活性的影響是不可知的；另一方面，運(yùn)用公式推算儲(chǔ)存時(shí)間時(shí)，只考慮溫度和時(shí)間兩個(gè)因素對(duì)反應(yīng)速率的影響，但實(shí)際是多種因素共同作用的結(jié)果，此公式對(duì)結(jié)果的預(yù)測(cè)，只是作為標(biāo)準(zhǔn)品存放溫度的參考。因此，結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，以及對(duì)實(shí)驗(yàn)可能造成影響的不可控因素，為保證測(cè)量數(shù)值的準(zhǔn)確度，仍需在實(shí)驗(yàn)時(shí)取臨用前復(fù)溶的標(biāo)準(zhǔn)品。

此外，為了降低不可控因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，本實(shí)驗(yàn)采用的凍存管為外旋500μL 體積，可防止標(biāo)準(zhǔn)品溶液在短時(shí)間內(nèi)由于升華或揮發(fā)造成標(biāo)準(zhǔn)品溶劑減少，濃度增加，從而活性測(cè)定值的誤差增大。本實(shí)驗(yàn)在生物活性測(cè)定梯度稀釋時(shí)，采用在同一塊96孔板中稀釋?zhuān)俜謩e移液至3塊新的96孔板中，盡可能地降低了由于多次梯度稀釋造成的操作誤差。

通過(guò)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，綜合各種可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素，本研究表明，hG-CSF 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品不適合復(fù)溶后分裝凍存使用。本實(shí)驗(yàn)為hG-CSF 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的使用提供了重要參考。