ELP30-intein標(biāo)簽在重組脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2原核表達(dá)中的作用

阮瑤，丁寧，于軍

1.西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)中心，陜西西安710100；2.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)研究中心，遼寧大連116622

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥，脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（lipoprotein-associated phospholipase A2，LPPL A2）通過釋放促凝因子在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用［1-3］，因此開展對(duì)LP-PL A2的檢測(cè)對(duì)心腦血管疾病的診斷和治療具有重要價(jià)值［4-5］。人血漿中的LP-PL A2蛋白由441 個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約45 400［6］。目前，針對(duì)LP-PL A2的檢測(cè)試劑盒主要依賴于進(jìn)口，這是由于國(guó)內(nèi)LP-PL A2抗原標(biāo)準(zhǔn)品及其抗體的制備技術(shù)尚不成熟［7］。因此，快速生產(chǎn)低成本的LP-PL A2重組蛋白成為影響LPPL A2檢測(cè)試劑盒臨床推廣的一個(gè)重要因素。

鑒于E.coli生產(chǎn)周期短、發(fā)酵成本低及適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)［8-9］，許多研究者開始致力于通過E.coli表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)LP-PL A2重組蛋白［10-11］，但獲得LP-PL A2重組蛋白的純度、產(chǎn)量普遍較低。研究表明，類彈性蛋白（elastin-like polypeptide，ELP）標(biāo)簽不僅可以實(shí)現(xiàn)融合蛋白的非色譜純化，當(dāng)其處在N-末端時(shí)還可增加目標(biāo)蛋白的可溶性表達(dá)，通過特異性酶切或改變條件引發(fā)內(nèi)含肽（intein）的自我剪切以去除ELP 標(biāo)簽，如可通過降低pH 使danB intein發(fā)生自我剪切［12-14］。因此，本研究通過融合表達(dá)ELP30-intein 標(biāo)簽，促進(jìn)重組LP-PL A2于E.coli質(zhì)周腔內(nèi)的可溶性表達(dá)，同時(shí)結(jié)合可逆相變循環(huán)（inverse transition cycling，ITC）技術(shù)及dnaB intein 自身切割特性實(shí)現(xiàn)非色譜快速、低成本純化目標(biāo)蛋白［15］，旨在為快速、低成本、有效生產(chǎn)LP-PL A2重組蛋白提供技術(shù)平臺(tái)，推動(dòng)LP-PL A2臨床診斷劑盒的推廣及應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1菌株及質(zhì)粒 感受態(tài)E.coliW3110由西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)中心保存；重組質(zhì)粒pIG6-LP-PL A2及pIG6-ELP30-intein-LP-PL A2由常州基宇生物科技有限公司構(gòu)建。

1.2主要試劑及儀器 NC 膜、LB 培養(yǎng)基、IPTG、氨芐青霉素、脫脂奶粉、溶菌酶、DNA 溶解酶、顯影液及HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 等均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；小鼠抗FLAG M1 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；脫鹽柱、小鼠抗6-His 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；兔抗人LP-PL A2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基由西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)中心制備。

1.3重組蛋白的表達(dá) 將重組質(zhì)粒pIG6-LP-PL A2轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliW3110 中，采用含100 μg／mL 氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)至A600為0.4～0.6 時(shí)，加入IPTG 至終濃度0.2 mmol／L，于20 ℃，220 r／min誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，每小時(shí)收集A600為1的菌體。將重組質(zhì)粒pIG6-ELP30-intein-LP-PL A2轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliW3110中，分別采用50 mL含100μg／mL氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基及自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。LB液體培養(yǎng)基中的菌液于37 ℃培養(yǎng)至A600為0.4～0.6時(shí)，加入IPTG 至終濃度0.2 mmol／L，分別于20、25、30 ℃，220 r／min誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h；自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的菌液于25 ℃，220 r／min 培養(yǎng)48 h。每小時(shí)收集A600為1 的菌體，用80μL PBS 緩沖液溶解菌體，加入20μL Loading buffer，混勻，取15μL，經(jīng)8%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至NC 膜上，用5%脫脂奶粉于室溫封閉2 h；分別加入小鼠抗FLAG M1（1∶5 000稀釋）及抗6-His單克隆抗體（1∶3 000 稀釋），于常溫孵育2 h；PBST洗滌5次，加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1∶2 000稀釋），室溫孵育1 h；ECL法顯影。將重組質(zhì)粒pIG6-LP-PL A2于20 ℃，IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物分別以小鼠抗6-His和FLAG M1 單克隆抗體為一抗進(jìn)行Western blot 檢測(cè)；重組質(zhì)粒pIG6-ELP30-intein-LP-PL A2于20 ℃，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物以小鼠抗6-His單克隆抗體為一抗，自動(dòng)誘導(dǎo)的產(chǎn)物以小鼠抗FLAG M1 單克隆抗體為一抗，不同溫度時(shí)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物以小鼠抗FLAG M1單克隆抗體為一抗進(jìn)行Western blot法檢測(cè)。

1.4重組蛋白可溶性的檢測(cè) 分別收集20、25、30 ℃條件下IPTG誘導(dǎo)5 h的菌體，用PBS緩沖液重懸，超聲破碎菌體，4 ℃，21 367×g離心10 min，分別取30μL裂解前總蛋白、裂解沉淀及上清，進(jìn)行8%SDS-PAGE分析。

1.5重組蛋白的純化 分別收集20、25、30 ℃條件下IPTG 誘導(dǎo)5 h 的菌體，用15 mL Tris-HCl 緩沖液（20 mmol／L，pH 8.5）重懸；反復(fù)凍融3 次，加入500 μg／mL 的溶菌酶，37 ℃水浴20 min；超聲破碎20 min，4 ℃，21 367×g離心15 min，收集上清液；加入5 μg／mL 的DNA 溶解酶，置冰上20 min；4 ℃，21 367×g離心15 min，收集上清液。上清液中加入終濃度為4 mol／L 的NaCl，37 ℃水浴至可見明顯渾濁，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，再用2 mL 37 ℃預(yù)熱的Tris-HCl緩沖液（含4 mol／L NaCl）洗脫去除雜蛋白；將截取重組蛋白的濾膜置冰上10 min，用2 mL 預(yù)冷的Tris-HCl 緩沖液（含0.5 mol／L NaCl）洗脫。共進(jìn)行3次上述ITC 循環(huán)，其中，第2次ITC 循環(huán)改為用1 mL預(yù)冷的Tris-HCl 緩沖液（含0.5 mol／L NaCl）洗脫。用1 mL預(yù)冷的PBS緩沖液（含0.5 mol／L NaCl，pH 6.5）洗脫，獲得目標(biāo)蛋白ELP30-intein-LP-PL A2，于4 ℃放置24 h，低pH誘導(dǎo)danB intein斷裂，再進(jìn)行1 個(gè)ITC 循環(huán)去除雜蛋白，收集含有單一LP-PLA2重組蛋白的濾液，利用脫鹽柱將濾液由酸性PBS 溶液（pH 6.5）置換為中性PBS 溶液（pH 7.4）。收集各步驟樣品，進(jìn)行8%SDS-PAGE 分析，收集單一LP-PL A2重組蛋白濾液，進(jìn)行Western blot 檢測(cè)（方法同1.3 項(xiàng)，其中一抗為兔抗人LP-PL A2多克隆抗體）。

1.6數(shù)據(jù)采集及分析 應(yīng)用Image J 軟件采集及分析數(shù)據(jù)，Adobe illustrator CC 2019軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1重組蛋白的鑒定 LP-PL A2重組蛋白可與小鼠抗6-His單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，于相對(duì)分子質(zhì)量約55 100 處可見特異性結(jié)合條帶，而以小鼠抗FLAG M1 單克隆抗體為一抗時(shí)未見該條帶，見圖1。表明不攜帶ELP30-intein 標(biāo)簽的LP-PL A2重組蛋白僅于胞內(nèi)表達(dá)，無法定位于質(zhì)周腔。ELP30-intein-LPPL A2重組蛋白與兩種一抗均可發(fā)生特異性結(jié)合，于相對(duì)分子質(zhì)量約87 900處可見特異性結(jié)合條帶。在相同誘導(dǎo)溫度條件下，自動(dòng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)獲得的目標(biāo)蛋白量遠(yuǎn)低于IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。與20 ℃比較，IPTG誘導(dǎo)溫度為25及30 ℃時(shí)，目標(biāo)蛋白總體表達(dá)水平有所提升。見圖2。

圖1 LP-PL A2重組蛋白的Western blot檢測(cè)Fig.1 Western blotting of recombinant protein LP-PL A2

圖2 ELP30-intein-LP-PL A2重組蛋白的Western blot檢測(cè)Fig.2 Western blotting of recombinant protein ELP30-intein-LP-PL A2

2.2重組蛋白的可溶性表達(dá) 誘導(dǎo)表達(dá)后的總蛋白、裂解沉淀、裂解上清樣品經(jīng)8%SDS-PAGE分析，均可見相對(duì)分子質(zhì)量約87 900 的目的蛋白條帶，大小與預(yù)期相符。20、25、30 ℃時(shí)，IPTG誘導(dǎo)獲得ELP30-intein-LP-PL A2重組蛋白的可溶性表達(dá)水平分別為12%、50%、33%，25 ℃時(shí)最高。見圖3。因此，確定采用LB 液體培養(yǎng)基，于25 ℃以IPTG 誘導(dǎo)ELP30-intein-LP-PL A2重組蛋白。

圖3 ELP30-intein-LP-PL A2重組蛋白可溶性表達(dá)的SDSPAGE分析Fig.3 SDS-PAGE profile of soluble expression of recombinant protein ELP30-intein-LP-PL A2

2.3重組蛋白純化產(chǎn)物的鑒定

2.3.1SDS-PAGE分析 純化的ELP30-intein-LP-PL A2重組蛋白經(jīng)8%SDS-PAGE 分析，可見相對(duì)分子質(zhì)量約87 900的目的蛋白條帶，大小與預(yù)期相符，見圖4。且經(jīng)降低pH 誘導(dǎo)danB intein 斷裂，獲得純度較高的LP-PL A2重組蛋白，純度為70%，見圖4。

圖4 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE profile of purified product

2.3.2Western blot 檢測(cè) 純化的LP-PL A2重組蛋白可與人抗兔LP-PL A2多克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，于相對(duì)分子質(zhì)量約87 900 處可見特異性結(jié)合條帶，見圖5。

圖5 純化產(chǎn)物的Western blot檢測(cè)Fig.5 Western blotting of purified LP-PL A2

3 討論

LP-PL A2的升高可能是預(yù)測(cè)冠心病和卒中風(fēng)險(xiǎn)的一種獨(dú)立危險(xiǎn)因子，當(dāng)LP-PL A2水平達(dá)223 ng／mL時(shí)，人體具有高發(fā)心腦血管事件和卒中的風(fēng)險(xiǎn)［16-17］。有報(bào)道表明，由美國(guó)Diadex 公司研發(fā)的placTM檢測(cè)試劑盒獲得美國(guó)食品與藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)上市，該試劑盒采用標(biāo)準(zhǔn)的雙抗體夾心ELISA 方法檢測(cè)血漿中LP-PL A2濃度［7］。LP-PL A2抗原標(biāo)準(zhǔn)品作為診斷試劑盒中的關(guān)鍵組成部分，其研發(fā)生產(chǎn)極其重要。雖然從血漿中純化獲得天然蛋白是最理想的選擇，但該方法操作繁瑣，原材料供給有限，且生產(chǎn)成本高，產(chǎn)量極低［18］。

近年，E.coli表達(dá)系統(tǒng)已成為生產(chǎn)重組蛋白藥物的優(yōu)選系統(tǒng)之一，尤其是E.coli質(zhì)周腔內(nèi)表達(dá)重組蛋白更具備一定優(yōu)勢(shì)，質(zhì)周腔內(nèi)的氧化性環(huán)境能夠促進(jìn)二硫鍵的正確形成，且可避免重組蛋白胞內(nèi)降解，使其穩(wěn)定存在［19-21］。本研究在重組質(zhì)粒pIG6-ELP30-intein-LP-PL A2的上游引入ompA leader信號(hào)肽基因，該信號(hào)肽可將重組蛋白ELP30-intein-LP-PLA2或LPPL A2定位于質(zhì)周腔，并在跨膜過程中脫落，而暴露出DYKD-flag 標(biāo)簽，該標(biāo)簽可與抗FLAG M1 單克隆抗體特異性結(jié)合［22］，從而檢測(cè)質(zhì)周腔蛋白的表達(dá)情況；同時(shí)，在重組蛋白的下游引入了6個(gè)組氨酸（6-His）標(biāo)簽［23］，用于檢測(cè)蛋白在胞內(nèi)的表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)果顯示，于25 ℃，LB液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，可提高ELP30-intein-LP-PL A2重組蛋白的表達(dá)，隨后采用基于ELP 蛋白的ITC 技術(shù)，可有效地從質(zhì)周腔純化獲得LP-PL A2 重組蛋白，表明于N-末端添加ELP30-intein 標(biāo)簽后，不僅利于重組蛋白LP-PL A2在E.coli菌體內(nèi)的低成本分離純化，還可以促進(jìn)其在質(zhì)周腔內(nèi)的定位表達(dá)，這為后續(xù)蛋白的修飾，如質(zhì)周腔內(nèi)糖基化修飾等奠定了基礎(chǔ)。

另外，在蛋白純化過程中還發(fā)現(xiàn)，在去除ELP30-intein 標(biāo)簽后，LP-PL A2重組蛋白的純度有所提高，推測(cè)其原因如下：①水解時(shí)，于4 ℃，酸性溶液（pH 6.5）中放置24 h，該過程可能存在蛋白降解；②水解后又進(jìn)行了1輪ITC 循環(huán)以去除標(biāo)簽及雜蛋白，提高了蛋白純度；③利用脫鹽柱置換緩沖液的過程中，去除了部分雜蛋白。

綜上所述，通過N-末端添加ELP30-intein 標(biāo)簽，確保了LP-PL A2重組蛋白在E.coli質(zhì)周腔中的可溶性表達(dá)，并實(shí)現(xiàn)了低成本、快速非色譜純化，為快速、低成本制備LP-PL A2重組蛋白提供了新方法。但該方法也存在一定的缺陷，如可溶性表達(dá)水平較低、蛋白純度不高，推測(cè)原因如下：①原核系統(tǒng)表達(dá)真核蛋白時(shí)易形成無活性的包涵體［24-25］；②ELP30-intein 標(biāo)簽在蛋白表達(dá)過程中提前發(fā)生脫落［26］。以上問題可通過添加可溶性表達(dá)融合標(biāo)簽、進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件（如提高培養(yǎng)基pH）、純化過程等方法嘗試解決。