豬繁殖與呼吸綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白研究進(jìn)展

陳 旭,湯德元,曾智勇,王 彬,陳閶崢,羅 柳,袁盛林,廖正波

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽 550025)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)為動(dòng)脈病毒科囊膜病毒家族,是一種有囊膜病毒粒子呈球型單股正鏈RNA病毒,PRRSV基因組全長約15 kb,包含10個(gè)以上開放閱讀框,可編碼參與病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的NSP1α、NSP1β、NSP2等至少12種非結(jié)構(gòu)蛋白及GP5、M、N等8種結(jié)構(gòu)蛋白。20世紀(jì)90年代初在歐洲和北美幾乎同時(shí)出現(xiàn)PRRSV,但兩種毒株基因組序列同源性只有約60%,因此PRRSV基因型被分為歐洲型(PRRSV-1)和北美型(PRRSV-2)。PRRSV感染豬群可引起以繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)癥狀為特征的急性、高度傳染性疫病,給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重危害。妊娠母豬染病后主要表現(xiàn)為繁殖障礙,妊娠前期的母豬流產(chǎn),妊娠中期的母豬產(chǎn)下死胎、木乃伊胎、弱胎、畸形胎,哺乳母豬產(chǎn)后無乳。公豬感染后表現(xiàn)為性欲減弱、精液質(zhì)量下降、射精量少等癥狀。仔豬染病后表現(xiàn)為呼吸困難,關(guān)節(jié)腫大,敗血癥等[1]。PRRSV主要感染豬單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞,如豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)和樹突狀細(xì)胞(DC),病毒在增殖過程中利用宿主細(xì)胞的物質(zhì)合成自身結(jié)構(gòu)蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白及核酸,但成熟的病毒顆粒中只含有結(jié)構(gòu)蛋白及核酸,非結(jié)構(gòu)蛋白則與宿主受體結(jié)合參與病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。PRRSV因其自身基因組特性及各種內(nèi)外因素的影響,一直處于持續(xù)不斷的變異中,臨床呈現(xiàn)多毒株并存的局面,增加了疾病的防控難度,文章對從多個(gè)方面對PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行闡述,以期能對PRRSV作進(jìn)一步的研究并制定防控PRRS的策略。

1 結(jié)構(gòu)蛋白

目前已知的PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白由核衣殼蛋白(N)、基質(zhì)蛋白(M)、包膜蛋白(E)和5種糖蛋白構(gòu)成,PRRSV的ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6、ORF7開放閱讀框分別編碼這些結(jié)構(gòu)蛋白。其中ORF5a存在于ORF4和ORF5之間,編碼GP5a 囊膜糖蛋白,ORF2a編碼GP2a蛋白,ORF2b編碼E蛋白,ORF3編碼GP3蛋白,ORF4編碼GP4蛋白,ORF5編碼GP5蛋白,ORF6編碼M蛋白,ORF7編碼N蛋白,這些結(jié)構(gòu)蛋白與宿主細(xì)胞內(nèi)特定細(xì)胞因子相互作用并介導(dǎo)PRRSV侵入易感細(xì)胞。

糖蛋白是病毒主要的表面抗原,它們與細(xì)胞受體相互作用觸發(fā)病毒感染,有些還介導(dǎo)病毒侵入宿主細(xì)胞。并且它還具有重要的受體結(jié)合位點(diǎn)和抗原表位,是疫苗研究的熱點(diǎn),有研究表明,針對GP2a上B細(xì)胞表位的抗體可以抑制豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)中的PRRSV復(fù)制[2]。宿主細(xì)胞表面的CD163蛋白具有介導(dǎo)病原體的內(nèi)吞的作用,有研究開發(fā)了針對PAM CD163受體的單克隆抗體(mAb),使GP2a不能與CD163結(jié)合,從而部分阻斷PRRSV進(jìn)入細(xì)胞,表明PRRSV GP2a在介導(dǎo)PRRSV進(jìn)入易感宿主細(xì)胞時(shí)具有積極作用[3]。E蛋白是一種離子通道包膜蛋白,一方面E蛋白與α微管蛋白(α-tubulin)相互作用使微管解開,損壞細(xì)胞膜完成性,促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞[4],另一方面E蛋白參與降低宿主細(xì)胞中的ATP水平,胞內(nèi)低濃度ATP激活了半胱天冬酶-3(caspase-3)進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞凋亡,在細(xì)胞水平上抵御病毒感染[5]。GP3蛋白與GP2a一樣能促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞,缺失GP3蛋白的病毒顆粒不具有傳染性。GP4蛋白少量存在于PRRSV表面,具有高度可變性,能夠被宿主細(xì)胞的抗體識別誘發(fā)免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),GP4蛋白中抗體識別表位的氨基酸發(fā)生突變可以消除抗體識別,表明PRRSV通過操控GP4蛋白發(fā)生變異從而逃避宿主細(xì)胞的免疫檢測[6]。GP4的另一功能是與GP2a蛋白特異性結(jié)合作為PRRSV的附著蛋白,進(jìn)而與CD163的相互作用,使病毒進(jìn)入易感宿主細(xì)胞。GP5蛋白對于PRRSV在易感細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和組裝是不可或缺的,它參與病毒與宿主受體結(jié)合的過程。研究發(fā)現(xiàn)PRRSV GP5將宿主細(xì)胞中甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)限制在細(xì)胞質(zhì)中,并利用其糖酵解活性促進(jìn)PRRSV復(fù)制[7]。非肌肉肌球蛋白重鏈9(MYH9)在細(xì)胞遷移和黏附中發(fā)揮重要作用,GP5蛋白與MYH9 C端結(jié)構(gòu)域相互作用,使PRRSV病毒粒子被MYH9捕獲,促進(jìn)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞[8]。

M蛋白是PRRSV中最保守的膜基質(zhì)蛋白且具有很強(qiáng)的抗原性,因此M蛋白也成為研發(fā)新型亞單位疫苗的候選蛋白。M蛋白不含已知的信號肽,它需要與GP5蛋白結(jié)合成二聚體,PRRSV依靠GP5/M復(fù)合體與硫酸肝素(HS)相互作用,才能有效黏附在細(xì)胞表面。M蛋白與位于細(xì)胞器及囊泡膜上的跨膜蛋白相互作用,用其在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和膜融合中的作用促進(jìn)病毒粒子的移動(dòng)[9]。

核衣殼(N)蛋白是一種多磷酸化蛋白,N蛋白合成后先磷酸化,再運(yùn)送到細(xì)胞核,在整個(gè)病毒生命周期中表現(xiàn)出多種功能。N蛋白的基本功能是形成病毒衣殼以包裝病毒基因組。在N蛋白78 aa的絲氨酸突變?yōu)楸彼岷罂梢韵抡{(diào)病毒基因組和亞基因組RNA的轉(zhuǎn)錄水平,說明N蛋白突變可以顯著降低病毒在體外的復(fù)制效率[10]。N蛋白同時(shí)與宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上受體結(jié)合,并與許多宿主因子相互作用,影響病毒致病基因表達(dá)。N蛋白1-15aa區(qū)間是一個(gè)新的B細(xì)胞表位,宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗體可以與此抗原表位結(jié)合,從而抑制PRRSV在體內(nèi)的復(fù)制[11]。

2 非結(jié)構(gòu)蛋白

PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白由開放閱讀框ORF1編碼,包括ORF1a和ORF1b,它們分別編碼多聚蛋白pp1a和pp1ab。其中pp1a裂解成9個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1a、NSP1β和NSP2-NSP8,pp1ab裂解成4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NSP9、NSP10、NSP11、NSP12,這些非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和拮抗干擾素等過程中發(fā)揮重要作用。

NSP1蛋白是PRRSV感染期間合成的第1個(gè)病毒蛋白,編碼NSP1的基因序列高度保守,NSP1參與病毒基因組的復(fù)制和亞基因組mRNA的轉(zhuǎn)錄。NSP1蛋白被自身的木瓜蛋白酶樣蛋白酶(PLP)切割成NSP1α和NSP1β兩個(gè)亞基。Nsp1α的鋅指(ZF)結(jié)構(gòu)域刺激白細(xì)胞分化抗原83(CD83)啟動(dòng)子的分泌,CD83抑制了樹突狀細(xì)胞(MoDC)呈遞抗原并激活免疫應(yīng)答的能力,造成宿主細(xì)胞的免疫抑制[12]。為進(jìn)一步探索NSP1對宿主炎癥反應(yīng)的影響,發(fā)現(xiàn)NSP1β蛋白可激活NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)抵御病毒侵染,NLRP3是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)重要的模式識別受體,參與炎性粒子組裝,激活炎癥信號通路,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展,相反,NSP1ɑ蛋白則抑制NLRP3炎癥小體活化,下調(diào)炎癥反應(yīng)的發(fā)生,表明NSP1在促進(jìn)或抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)方面也發(fā)揮作用[13]。NSP2蛋白是PRRSV中分子量最大的非結(jié)構(gòu)蛋白,同時(shí)也是變異最大的非結(jié)構(gòu)蛋白,其中N端木瓜樣蛋白酶(PL2)結(jié)構(gòu)域具有去泛素化和拮抗干擾素功能,并抑制干擾素刺激基因15(ISG15)的抗病毒功能以阻斷先天性抗病毒反應(yīng),中心性高變(HV)結(jié)構(gòu)域是PRRSV感染PAM的重要驅(qū)動(dòng)因子,并有助于宿主產(chǎn)生抗體的識別,C端跨膜區(qū)(TM)結(jié)構(gòu)域能夠抑制細(xì)胞蛋白翻譯。PRRSV NSP2TF能顯著下調(diào)豬白細(xì)胞抗原I類(SLA-I)在感染宿主細(xì)胞中的表達(dá),SLA-I是激活CD8+T細(xì)胞進(jìn)行抗原呈遞的重要因子,下調(diào)SLA-I表達(dá)意味著抑制宿主免疫應(yīng)答,從而上調(diào)病毒感染能力[14]。NSP3、NSP5是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)跨膜蛋白酶,它們誘導(dǎo)PRRSV在易感細(xì)胞內(nèi)形成自噬體,成熟的自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體,然后降解自噬體內(nèi)容物,最后降解的物質(zhì)被釋放到細(xì)胞質(zhì)中,轉(zhuǎn)化為氨基酸和能量完成細(xì)胞質(zhì)內(nèi)代謝過程[15]。此外,NSP5還可作為Janus激酶/轉(zhuǎn)錄活化因子3(JAK/STAT3)通路的抑制因子,影響下游基因的轉(zhuǎn)錄、促炎細(xì)胞增殖、分化、凋亡過程以及先天免疫應(yīng)答[16]。NSP4是一種3C樣絲氨酸蛋白酶(3CLSP),負(fù)責(zé)大多數(shù)非結(jié)構(gòu)蛋白的加工。此外,NSP4與感染細(xì)胞內(nèi)其他成分相互作用,以維持PRRSV在感染細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制存活。研究發(fā)現(xiàn),NSP4激活促凋亡蛋白(Bim)表達(dá)使感染細(xì)胞凋亡,被釋放出來病毒再感染其他易感細(xì)胞,加重宿主感染[17]。豬mRNA脫帽酶1a(pDCP1a)能刺激IFN分泌,PRRSV NSP4可以下調(diào)pDCP1a表達(dá),抑制宿主細(xì)胞對PRRSV的防御[18]。PRRSV NSP6作用于宿主信號通路,并調(diào)控宿主炎癥反應(yīng)的發(fā)生。黏膜相關(guān)淋巴瘤易位基因1(MALT1)是活化NF-κB的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要信號分子,NSP6在轉(zhuǎn)染后24 h可通過泛素化-蛋白酶體途徑抑制MALT1編碼蛋白的表達(dá),進(jìn)而抑制NF-κB信號分子激活,降低下游促炎細(xì)胞因子的表達(dá),部分阻斷炎癥反應(yīng)的發(fā)生[19]。PRRSV NSP7由基因組中相對保守的區(qū)域編碼,具有較強(qiáng)的免疫原性,目前,對它研究的相關(guān)報(bào)道較少,但可以確定的是它確實(shí)影響病毒的復(fù)制周期,而具體作用機(jī)制仍有待探究。NSP8是NSP9的N末端延伸,因此NSP8的功能可能與NSP9的功能有很大關(guān)聯(lián)[20]。

PRRSV NSP9是一種RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp),參與形成病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄復(fù)合物(RTC)。宿主細(xì)胞的其他蛋白能夠與NSP9蛋白相互作用,對病毒復(fù)制產(chǎn)生負(fù)性調(diào)控作用。CCCH型鋅指抗病毒蛋白(ZAP)能抑制PRRSV早期復(fù)制,有研究提出ZAP與NSP9相互作用進(jìn)而發(fā)揮抑制作用[21]。核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體X1(NLRX1)是參與免疫防御和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì),NSP9與NLRX1相互作用來抑制PRRSV的復(fù)制[22]。PRRSV解旋酶(NSP10)是具有易位和解旋活性的多功能蛋白,對病毒RNA合成起著至關(guān)重要的作用。有研究針對PRRSV NSP10設(shè)計(jì)單克隆抗體(mAb 4D9)用來區(qū)分PRRSV-1和PRRSV-2,試驗(yàn)表明mAb 4D9可以識別PRRSV-2 NSP10,但不能識別PRRSV-1 NSP10,表明NSP10可作為PRRSV-2的標(biāo)志性蛋白,以便宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗體與之結(jié)合發(fā)揮免疫效應(yīng)[23]。NSP11具有核糖核酸內(nèi)切酶活性,對于病毒基因組復(fù)制和亞基因組的合成是必需的。此外,NSP11的過度表達(dá)可以提高PRRSV的滴度,具有抑制受感染宿主先天免疫系統(tǒng)等功能[24]。宿主p21基因編碼的內(nèi)源性蛋白能抑制PRRSV復(fù)制,PRRSV感染后NSP11可引起p21降解并促進(jìn)病毒在MARC-145細(xì)胞中的復(fù)制[25],PRRSV 感染后NSP11被宿主細(xì)胞干擾素調(diào)節(jié)因子9(IRF9)識別并被抑制表達(dá),同時(shí)激活轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物IFN刺激基因因子3(ISGF3)的形成和核易位,從而阻斷IFN-I信號傳導(dǎo)以拮抗宿主先天性抗病毒反應(yīng)[26]。PRRSV NSP12參與PRRSV亞基因組mRNA(sgmRNA)的合成,若是NSP12中35位與79位半胱氨酸發(fā)生聯(lián)合突變則影響NSP12參與病毒sgmRNA的合成[27]。此外,PRRSV NSP12通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子參與病毒感染,RING指蛋白114(RNF114)可作為PRRSV復(fù)制的抑制因子,RNF114通過介導(dǎo)NSP12的K27多聚泛素化修飾,促進(jìn)NSP12經(jīng)蛋白酶體途徑降解,使病毒復(fù)制受到抑制[28]。核細(xì)胞素α 6(KPNA6)的降解不利于PRRSV復(fù)制,PRRSV感染后NSP12阻斷了KPNA6的泛素-蛋白酶體降解,使KPNA6的半衰期延長,為宿主細(xì)胞中PRRSV復(fù)制提供保障[29]。

3 PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白對宿主信號通路的影響

為了在宿主細(xì)胞中成功存活并持續(xù)性感染,PRRSV利用復(fù)雜的信號通路抑制或逃避宿主的先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng),并改變宿主某些基因表達(dá)從而更好的實(shí)現(xiàn)病毒侵入的過程。PRRSV感染其結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白能夠激活許多信號通路,觸發(fā)下游的趨化因子、轉(zhuǎn)錄因子和炎性細(xì)胞因子的激活,以調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制和增殖,例如抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá),調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-10(IL-10)的生成以抑制免疫反應(yīng);干擾免疫細(xì)胞的功能,抑制IFN-Ⅰ的生成,最終導(dǎo)致受感染者出現(xiàn)病毒血癥和持續(xù)感染。

屬于絲裂原活化蛋白激酶家族的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)介導(dǎo)PRRSV感染期間炎癥反應(yīng)的發(fā)生。研究表明,PRRSV-2 NSP1能夠阻斷ERK信號傳導(dǎo),下調(diào)ERK下游轉(zhuǎn)錄因子血清核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(AP-1),進(jìn)一步抑制能增加促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)因子1和結(jié)締組織生長因子2(ccn1和ccn2)的轉(zhuǎn)錄,抑制宿主的炎癥反應(yīng)的發(fā)生[30]。免疫系統(tǒng)中淋巴細(xì)胞的生長和分化依賴于細(xì)胞因子,酪氨酸蛋白激酶(JAK)/ 轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號通路激活多數(shù)細(xì)胞因子以發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng),IFN通過激活JAK/STAT信號通路誘導(dǎo)多種基因的表達(dá),在宿主抗病毒反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用,而STAT2在JAK/ STAT信號傳導(dǎo)中是必不可少的。研究發(fā)現(xiàn)NSP11的N端域負(fù)責(zé)誘導(dǎo)STAT2降解,從而拮抗干擾素誘導(dǎo)其下游信號傳導(dǎo)的發(fā)生,抑制宿主的先天免疫反應(yīng)。另外,STAT3蛋白在細(xì)胞生長,增殖,分化,免疫和炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用,研究發(fā)現(xiàn),PRRSV感染會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞中STAT3蛋白表達(dá)水平顯著降低,PRRSV NSP5通過提高STAT3多泛素化水平并將其半衰期從24 h縮短到3.5 h來加速STAT3降解,導(dǎo)致免疫細(xì)胞因子和炎癥因子被抑制,從而實(shí)現(xiàn)病毒在宿主細(xì)胞中復(fù)制和傳播[31]。CD83是樹突狀細(xì)胞(DC)分泌的可負(fù)反饋調(diào)節(jié)DC免疫功能的細(xì)胞因子,因此CD83是一種抗炎和免疫抑制介質(zhì),研究發(fā)現(xiàn)PRRSV NSP10和E蛋白通過核因子kappa B(NF-κB)和特異性糖蛋白1(Sp1)信號通路強(qiáng)烈刺激DC中的CD83的表達(dá),進(jìn)而造成宿主免疫抑制,利于病毒的存活[32]。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是單核細(xì)胞分泌的一種促炎細(xì)胞因子,可被蛋白激酶C(PKC)活化,PRRSV E蛋白可激活 PKCδ,促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生[33]。PRRSV N蛋白被發(fā)現(xiàn)能夠通過NF-κB和p38 MAPK途徑參與上調(diào)IL-10的表達(dá),使免疫細(xì)胞介導(dǎo)的抗原呈遞和免疫反應(yīng)受到抑制,對感染機(jī)體內(nèi)的PRRSV起到保護(hù)作用[34]。近年來,高致病性豬藍(lán)耳病受到廣泛關(guān)注,豬感染了高致病性藍(lán)耳病病毒(HP-PRRSV)后發(fā)生高熱,有研究提出這是因?yàn)闄C(jī)體產(chǎn)生的前列腺素E2(PGE2)增加從而使豬發(fā)生高熱,而PGE2的產(chǎn)生與環(huán)氧合酶2(COX-2)的表達(dá)密切相關(guān)。NSP2與14-3-3蛋白(GRF)家族相互作用激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶1(MEK1)-ERK1/2-CAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(C/EBPβ)信號通路以增強(qiáng)COX-2表達(dá),從而促進(jìn)PGE2的產(chǎn)生,使患病豬發(fā)生高熱[35]。無論是PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白還是非結(jié)構(gòu)蛋白,都能影響宿主信號傳導(dǎo),對宿主免疫機(jī)制發(fā)揮正性或負(fù)性調(diào)控作用。

4 PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白檢測技術(shù)

PRRSV感染的豬康復(fù)后可長期帶毒,且不定期排毒,若引種了帶毒豬可導(dǎo)致PRRSV在豬群中的傳播和流行,因此必須加強(qiáng)引種豬的快速篩查,避免引進(jìn)陽性豬造成PRRSV的擴(kuò)大和流行。當(dāng)前商品化疫苗對PRRSV的預(yù)防作用有限,仍需通過生物安全措施進(jìn)行防控,早期檢測,及時(shí)淘汰陽性豬,降低規(guī)模化豬場感染PRRSV的幾率。近年來,以PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白作為抗原開發(fā)的檢測方法層出不窮,其中報(bào)道最多的當(dāng)屬核衣殼蛋白(N)作為標(biāo)記抗原以此來檢測PRRSV特異性抗體。

N蛋白是構(gòu)成PRRSV病毒粒子的3種主要結(jié)構(gòu)蛋白之一,具有強(qiáng)抗原性,是診斷或監(jiān)測機(jī)體產(chǎn)生病毒特異性抗體的合適靶標(biāo)。豬感染PRRSV后最早產(chǎn)生的是針對N蛋白的抗體,有研究建立一種基于N 蛋白的間接ELISA 方法,該方法與美國賽默飛世爾科技ELISA試劑盒相比,其特異性和靈敏度分別為 76.18%和82.61%,可用于大型血清學(xué)調(diào)查[36]。20世紀(jì)80年代開發(fā)的免疫層析試紙(ICST),因其簡單易行、操作快捷、成本低廉等優(yōu)點(diǎn),已被用于各種動(dòng)物疾病的快速監(jiān)測。有研究開發(fā)一種以膠體金納米顆粒標(biāo)記的PRRSV-1和PRRSV-2 N蛋白作為捕獲抗原,在PRRSV感染早期檢測機(jī)體中PRRSV特異性抗體的ICST檢測方法,該方法用兩種類型的N蛋白作為抗原可提高PRRSV的診斷性能[37]?；谌槟z微球的ICS測試,用乳膠微球標(biāo)記的PRRSV N蛋白特異性單克隆抗體作為標(biāo)記探針,檢測宿主體內(nèi)PRRSV病毒粒子,可用于在現(xiàn)場進(jìn)行PRRSV的快速診斷[38]。除了用結(jié)構(gòu)蛋白N作為標(biāo)記抗原建立的檢測方法外,用PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1α開發(fā)了一種基于熒光素酶連接的抗體捕獲測定(LACA),將NSP1α與Rellina熒光素酶底物結(jié)合并轉(zhuǎn)入基因克隆的質(zhì)粒中,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到T細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)后裂解細(xì)胞,將細(xì)胞裂解物與豬血清形成的抗原-抗體復(fù)合物加入包被有蛋白質(zhì)G的微孔板上,通過測量熒光亮度值,檢測PRRSV特異性抗體,開發(fā)了一種熒光素酶免疫沉淀系統(tǒng),用于快速檢測臨床樣品是否被PRRSV感染[39]。

5 小結(jié)

PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白主要作用在于與宿主膜蛋白互作,其中GP2a、E、GP3、GP4參與病毒進(jìn)入細(xì)胞的過程;GP5不僅參與病毒侵入細(xì)胞還促進(jìn)對病毒的復(fù)制;M蛋白則參與病毒粒子的移動(dòng),將病毒粒子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸?shù)礁郀柣w,參與病毒釋放;N蛋白與宿主細(xì)胞因子結(jié)合調(diào)控病毒的復(fù)制和宿主炎癥反應(yīng)。PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白主要影響病毒的復(fù)制,其中NSP1、NSP4、NSP11通過與宿主細(xì)胞因子相互作用抑制細(xì)胞內(nèi)IFN-I的產(chǎn)生,下調(diào)宿主炎癥反應(yīng)的發(fā)生;NSP2能抑制ISG15的抗病毒功能;NSP9和NSP10都作為病毒感染后宿主識別的靶標(biāo),參與抑制PRRSV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,另外NSP11與NSP12與宿主細(xì)胞因子作用,抑制免疫反應(yīng)促進(jìn)病毒復(fù)制,然而NSP12通過阻斷KPNA6降解過程對病毒復(fù)制產(chǎn)生抑制作用,因此這些非結(jié)構(gòu)蛋白的存在對病毒的復(fù)制增殖并不是絕對有利的。此外,PRRSV某些結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白作用于宿主信號通路,同樣能對病毒感染產(chǎn)生影響。如ERK-Ap-1信號通路、JAK/STAT信號通路、MEK1-ERK1/2-C/EBPβ信號通路。PRRSV 的N蛋白、NSP1α蛋白、NSP7蛋白也作為特異性抗原被用來檢測PRRSV特異性抗體,開發(fā)了以ELISA、免疫層析檢測為代表的檢測方法,為實(shí)現(xiàn)臨床疑似PRRSV感染豬的樣品鑒定及提前防控提供參考方法。隨著分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)的飛速發(fā)展,我們需要對PRRSV的基因組結(jié)構(gòu)及其編碼的蛋白有更加全面的認(rèn)識,了解PRRSV的免疫機(jī)制,研制更有效安全的疫苗仍是防控PRRS的主要目標(biāo)。