• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    核黃素參與水稻非生物脅迫的響應分析

    2023-09-21 01:09:24夏清珊周正琨譚炎寧劉選明秦迪嵐林建中
    西北植物學報 2023年8期
    關(guān)鍵詞:核黃素秈稻粳稻

    夏清珊,周正琨,譚炎寧,劉選明,秦迪嵐,林建中*

    (1 湖南大學 生物學院 植物功能基因組學和發(fā)育調(diào)控湖南省重點實驗室/國家耐鹽堿水稻技術(shù)創(chuàng)新中心,長沙 410082;2 湖南雜交水稻研究中心,長沙,410125;3 湖南省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心 國家環(huán)境保護重金屬污染監(jiān)測重點實驗室,長沙 410019)

    水稻是中國的第一大糧食作物,隨著人口的增加和耕地面積的減少,提高糧食的產(chǎn)量是現(xiàn)代水稻研究的重中之重[1]。水稻在生長過程中,常會受到自然界各種不利環(huán)境的影響,如高溫、干旱、高鹽、低溫、氧化脅迫、大氣污染等非生物因素,病原微生物、害蟲等生物因素[2-3]。

    這些逆境脅迫會引起水稻一系列形態(tài)和生理生化上的變化,影響水稻的正常生長發(fā)育,尤其會對產(chǎn)量和品質(zhì)帶來損失,嚴重時甚至可導致死亡[4-5]。水稻在生長過程中不能主動避開逆境脅迫帶來的危害,但在漫長的進化過程中已經(jīng)形成了一系列復雜且有序的機制來感知環(huán)境的變化、抵御環(huán)境帶來的不利影響[6-7]。

    核黃素(riboflavin)又稱維生素B2(VB2),因其結(jié)構(gòu)中含有核糖且呈黃色,故取名核黃素[8-9]。核黃素是酶輔因子黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的前體,FAD和FMN是許多氧化還原酶的輔基,參與許多生物過程,如生物鐘調(diào)節(jié)[10]、固氮[11]和激素代謝[12-13]。所有的植物和真菌以及大多數(shù)細菌都能產(chǎn)生核黃素[14],核黃素的基本功能就是以FMN或FAD的形式作黃素酶的輔基,與黃素蛋白或金屬黃素蛋白組成復酶,參與動植物、微生物以氧化還原反應為特征(包括氨基酸去氨基化作用、嘌呤降解、醛類物質(zhì)的降解、呼吸電子傳遞鏈等)的50多個生理生化過程,與機體的糖、脂類及蛋白質(zhì)的生物氧化有密切關(guān)系。植物體外施用核黃素可以促進許多生理代謝過程、減輕病害;同時,核黃素在植物體內(nèi)可以與各種多糖結(jié)合,形成糖基化核黃素。這些研究結(jié)果表明,植物可能有一種機制對核黃素在體內(nèi)進行重新分配,調(diào)控環(huán)境脅迫反應[15-17]。已有研究發(fā)現(xiàn),核黃素能夠增加植物的抗病性。例如,董漢松等[18]發(fā)現(xiàn)核黃素能作為植物抗病性激發(fā)子而激活免疫信號轉(zhuǎn)導通路,誘導植物對多種病害產(chǎn)生抗性。

    最近,Hu等[19]發(fā)現(xiàn)核黃素影響水稻體內(nèi)活性氧的代謝平衡和葉綠體的發(fā)育。Tian等[20]在玉米中發(fā)現(xiàn),核黃素通過協(xié)同線粒體能量代謝和細胞周期來調(diào)控胚乳發(fā)育;異源過表達核黃素合成酶基因ZmRIBA1能顯著提高擬南芥的滲透脅迫耐受性。盡管有跡象顯示核黃素參與了植物非生物脅迫響應,但關(guān)于核黃素緩解非生物脅迫傷害的機制仍知之甚少。

    因此,在高溫、鹽、堿、干旱等非生物逆境脅迫條件下,本研究測定了粳稻品種Kitaake和秈稻品種T98B的核黃素含量及其合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,并分析了施加外源核黃素后水稻對不同逆境脅迫的響應特征,以證實核黃素是否參與了調(diào)控植物非生物逆境響應的調(diào)控,為后續(xù)分子機制研究提供重要線索和啟示。

    1 材料和方法

    1.1 試驗材料

    選擇粳稻品種Kitaake(Oryzasativassp.japonicavar. Kitaake)和秈稻品種T98B(Oryzasativassp.indicavar. T98B)進行模擬逆境處理、核黃素含量測定、RNA提取、生理指標測定等。水稻種子保存于4 ℃冰箱,而幼苗均在人工氣候箱(Conviron,加拿大)中培養(yǎng)。

    1.2 水稻逆境處理

    選用在水培溶液[21]中正常生長14 d的Kitaake和T98B幼苗進行逆境脅迫處理。其中,逆境脅迫處理參考本課題組方法[22],包括:(1)鹽脅迫處理,140 mmol/L NaCl的水培營養(yǎng)液培養(yǎng)幼苗;(2)滲透脅迫處理(模擬干旱脅迫),20% PEG的水培營養(yǎng)液培養(yǎng)幼苗;(3)氧化脅迫處理,4 μmol/L甲基紫精(MV) 的水培營養(yǎng)液培養(yǎng)幼苗;(4)堿脅迫處理,50 mmol/L 的NaHCO3+Na2CO3水培營養(yǎng)液處理幼苗;(5)高溫脅迫處理,將生長于正常水培溶液中的幼苗置于45 ℃的高溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。另外,在各逆境脅迫處理培養(yǎng)溶液中添加核黃素[15](10 μmol/L)作為平行處理,用于考察施加外源核黃素對逆境脅迫響應的影響。處理時間為6~12 d,直至出現(xiàn)明顯的逆境脅迫表型為止,然后進行相關(guān)指標觀測。

    1.3 觀測指標及方法

    1.3.1 表型和生長指標

    脅迫處理結(jié)束后,觀察植株表型、測量株高和鮮重并統(tǒng)計存活率[21]。(1)株高:分別取脅迫處理前后的水稻幼苗(選取時間與逆境處理時間保持一致),測量從根部到莖葉頂部的高度。(2)鮮重:分別取脅迫處理前后的水稻幼苗(選取時間與逆境處理時間一致),擦干根和葉表面水分,稱取單株幼苗重量。

    1.3.2 核黃素含量

    參照Hiltunen等[23]的方法并加以改進,進行核黃素含量測定。主要步驟如下:稱取0.1 g植物材料,用液氮研磨,然后懸浮于0.5 mL甲醇/二氯甲烷(9∶10)中,在4 ℃溫和攪拌下孵育2 h,離心取上清待測。樣品在高效液相色譜系統(tǒng)1100(安捷倫,美國)上進行分析,使用Agilent HC-C18柱(高250 mm,直徑4.6 mm),以1 mL/min的速度在27 min內(nèi)以水和甲醇(5%~90%)的線性梯度洗脫。用熒光法(λex= 265 nm,λem= 530 nm)檢測核黃素并用正品標準確認。

    1.3.3 實時熒光定量PCR (QRT-PCR)分析

    按照引物設(shè)計原則,利用軟件Premier 5.0設(shè)計核黃素合成相關(guān)基因的特異性引物(表1)。采用Trizol試劑(No.9109,TaKaRa)提取水稻幼苗的總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后參照文獻[24]采用qRT-PCR分析核黃素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。

    表1 PCR引物序列

    1.3.4 生理指標

    生長14 d的水稻幼苗用鹽和高溫脅迫處理0,3,5,7 d,取幼苗地上部分用于后續(xù)生理指標檢測。其中,參照 Cao等[25]的電導儀法測定水稻葉片相對電導率;采用丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒 (BC0025;Solarbio)、過氧化氫(H2O2)含量檢測試劑盒(BC3590;Solarbio)和過氧化氫酶檢測試劑盒(S0051;Beyotime)分別測定鹽和高溫脅迫處理幼苗中的MDA和H2O2含量,以及過氧化氫酶活性。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    所有數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示,采用SPSS23.0統(tǒng)計分析軟件,顯著性水平為0.05,采用GraphPad Prism 8計算機軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 外源核黃素對水稻非生物脅迫響應的影響

    Kitaake 和T98B水稻幼苗在鹽、高溫、滲透、堿和氧化等5種非生物脅迫處理6~12 d后的生長情況如圖1所示。其中,在鹽脅迫處理8 d后,Kitaake和T98B均表現(xiàn)出了生長受到抑制和葉片壞死等明顯的脅迫表型;施加外源核黃素(10 μmol/L)則顯著提高了T98B的耐鹽性,其幼苗存活率、高度和鮮重比鹽脅迫分別顯著提升了約75%、9%和11%,而Kitaake的改善效果不明顯(圖1,A、F);在高溫(45 ℃)處理8 d后,Kitaake 和T98B均表現(xiàn)出了葉片卷曲和干枯的脅迫表型,而施加外源核黃素則小幅度提高了Kitaake的高溫耐受性,而對T98B的改善效果不明顯,但是Kitaake 和T98B幼苗的鮮重均顯著增加(圖1,B、F)。在滲透脅迫處理6 d后,Kitaake 和T98B均表現(xiàn)出了明顯的脅迫表型,且Kitaake受傷害更嚴重;施加外源核黃素則使T98B則對滲透脅迫更敏感,尤其是幼苗存活率和鮮重顯著降低,而對Kitaake的滲透脅迫響應沒有明顯影響(圖 1,C、F)。

    A~E. 生長14 d的粳稻Kitaake和秈稻T98B施加或不施加外源核黃素時分別進行鹽(140 mmol/L的NaCl處理8 d)、高溫(45 ℃處理8 d)、滲透(20% PEG處理6 d)、堿(50 mmol/L的NaHCO3+Na2CO3處理10 d)和氧化脅迫處理(4 μmol/L甲基紫精處理12 d)的表型分析;F. 秈稻和粳稻幼苗在不同脅迫處理下的存活率、幼苗高度和鮮重,其中的數(shù)值代表平均值±標準方差(n=40,t檢驗,*和**分別表示施加與不施加外源核黃素處理間在0.05和0.01水平存在顯著性差異)。

    在堿脅迫處理10 d后,Kitaake 和T98B均表現(xiàn)出脅迫表型,且施加外源核黃素對脅迫表型均沒有影響(圖1,D、F)。在氧化脅迫處理12 d后,Kitaake和T98B才表現(xiàn)出脅迫表型,且Kitaake受傷害更嚴重;施加外源核黃素對2個材料幼苗的脅迫表型均沒有明顯影響(圖1,E、F)。這些結(jié)果說明,核黃素能明顯改善水稻對鹽和高溫的耐受性,而對氧化和堿脅迫響應沒有影響,反而提高了水稻對滲透脅迫的敏感性;同時,在逆境脅迫響應和外源核黃素作用效果方面,秈稻和粳稻亞種之間也存在一定程度的差異??傊?核黃素不同程度地參與了水稻非生物脅迫響應的調(diào)控。

    2.2 非生物脅迫處理下水稻幼苗核黃素含量的變化

    Kitaake和T98B水稻幼苗在鹽、滲透、高溫、氧化和堿等5種非生物脅迫處理后,分別在處理0,3,7 d取樣檢測各脅迫處理前后幼苗中核黃素的含量。檢測結(jié)果表明在遭受5種非生物逆境脅迫后,粳稻Kitaake幼苗體內(nèi)的核黃素含量均不同程度升高,尤其是在鹽、滲透和高溫脅迫下核黃素含量升高最為明顯,在處理7 d時分別為未處理時的9,5,7倍(圖2)。同樣,秈稻品種T98B在遭受5種非生物脅迫后體內(nèi)核黃素含量也呈不同程度的升高,但是在滲透和堿脅迫下的升高不顯著(圖 3)。以上結(jié)果說明,鹽、高溫和氧化等非生物脅迫均能顯著促進水稻體內(nèi)核黃素的合成和積累,滲透和堿脅迫也能不同程度促進核黃素的合成和積累,但是在秈稻和粳稻亞種間存在較大差異。值得說明的是,粳稻Kitaake的核黃素合成受逆境脅迫促進程度較秈稻T98B更為顯著。因此,筆者猜測核黃素參與了水稻對這些非生物脅迫響應的調(diào)控。為了進一步研究核黃素參與脅迫響應的調(diào)控,后續(xù)研究主要聚焦于對促進核黃素合成最為顯著的鹽和高溫脅迫。

    A~E. 鹽(140 mmol/L的NaCl)、滲透(20% PEG)、高溫(45 ℃)、氧化脅迫處理(4 μmol/L甲基紫精)和堿(50 mmol/L的NaHCO3+Na2CO3)處理下水稻幼苗體內(nèi)核黃素熒光強度;F. 各個脅迫處理前后幼苗核黃素含量,其中的數(shù)值代表平均值±標準方差(n=3,t檢驗,* P <0.05,** P <0.01)。下同。

    圖3 秈稻T98B幼苗在不同非生物脅迫下核黃素熒光強度和含量變化

    2.3 鹽和高溫脅迫對水稻核黃素合成相關(guān)基因表達的影響

    通過生物信息學和序列同源性分析,筆者從水稻基因組中找到與核黃素合成代謝相關(guān)的8個基因(Os05g0460600、Os02g0572400、Os08g0481950、Os03g0117200、Os04g0177400、Os12g0541000、Os04g0497400、Os03g0801700)。其中,Os05g0460600、Os02g0572400和Os08g0481950編碼ribA(鳥苷三磷酸合成酶);Os03g0117200和Os04g0177400編碼ribD(5-氨基-6-核糖氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮);Os12g0541000編碼ribE(5-氨基-6-核糖氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5′-磷酸);Os04g0497400編碼ribH(6,7二甲基-8-核糖二羥基蝶啶);Os03g0801700編碼FADs(FAD合成酶)。將Kitaake和T98B幼苗進行鹽和高溫處理7 d,然后測定8個核黃素合成相關(guān)基因在脅迫處理前后的轉(zhuǎn)錄水平。qRT-PCR結(jié)果表明,在鹽和高溫脅迫下水稻大部分核黃素合成相關(guān)基因的表達量均不同程度上調(diào)(圖4)。

    *和**分別表示處理前后在0.05和0.01水平有顯著性差異。

    其中,在高溫脅迫下,Kitaake中8個基因均顯著上調(diào),而T98B中僅3個基因顯著上調(diào);在鹽脅迫下,Kitaake和T98B中的上述基因表達變化趨勢基本類似。這些結(jié)果說明,鹽和高溫脅迫能誘導核黃素合成基因的表達,從而促進核黃素在水稻體內(nèi)的合成和積累。同時也可以看出,秈稻和粳稻在響應高溫脅迫時,其核黃素合成基因的表達有明顯差別,粳稻的上調(diào)幅度更大,說明粳稻對高溫脅迫較秈稻更敏感。

    2.4 核黃素對鹽和高溫脅迫下水稻幼苗生理變化的影響

    水稻受到非生物脅迫后,體內(nèi)一些基本的生理指標如相對電導率、MDA、H2O2含量以及過氧化氫酶(CAT)的活性等會出現(xiàn)紊亂,并能反映出植物體所受的傷害程度。Kitaake和T98B幼苗在鹽和高溫脅迫下這些生理指標測定結(jié)果(圖5)表明,在未進行鹽和高溫處理時,水稻幼苗的相對電導率沒有明顯的差異;施加外源核黃素后,除了在T98B的高溫脅迫中沒有效果外,均能有效降低其余處理、水稻幼苗相對電導率(圖 5,A、B)。同樣,核黃素除了在T98B的鹽脅迫中沒有明顯效果外,均能有效降低其余處理、材料幼苗的MDA含量(圖 5,C、D)。這些結(jié)果說明,核黃素能有效降低鹽和高溫脅迫對細胞膜的傷害,提高水稻的逆境耐受性,且該結(jié)果與前面的幼苗存活率測定結(jié)果(圖1,A、B和F)一致。

    圖5 水稻幼苗在140 mmol/L NaCl(C,E,G)和45 ℃高溫(D,F,H)脅迫下生理指標的變化

    另外,植物在逆境下會積累活性氧如H2O2,若不及時清除會導致嚴重的氧化損傷。過氧化氫酶在逆境H2O2的清除中起著重要作用。Kitaake和T98B幼苗過氧化氫酶活性和H2O2含量測定顯示,核黃素能有效提高鹽和高溫脅迫下水稻體內(nèi)的過氧化氫酶活性,并降低其體內(nèi)H2O2含量(圖 5,E~H)。

    該結(jié)果說明,核黃素能提高水稻體內(nèi)活性氧清除酶的活性,降低體內(nèi)活性氧的積累,減輕或消除因鹽和高溫脅迫而導致的氧化損傷??傊?在鹽和高溫等逆境脅迫下,水稻通過促進體內(nèi)核黃素的合成和積累來改善逆境脅迫的耐受性。

    3 討 論

    植物本身可以合成核黃素,且主要以酶輔因子FMN和FAD的形式參與許多體內(nèi)的生化過程[12-13]。Ouyang等[26]和Hedtke等[27]發(fā)現(xiàn)核黃素缺乏會導致擬南芥的葉色異常。最近,Hu等[19]發(fā)現(xiàn)核黃素影響水稻細胞分裂素的穩(wěn)態(tài)和葉綠素的合成,進而調(diào)控葉綠體和葉色的形成。Tian等[20]發(fā)現(xiàn)核黃素通過協(xié)同線粒體能量代謝和細胞周期來調(diào)控玉米胚乳發(fā)育。本研究分析了外源核黃素對秈稻和粳稻響應鹽、滲透、高溫、氧化和堿等5種非生物脅迫的影響,同時分析了這些逆境脅迫對水稻體內(nèi)核黃素合成的影響。研究發(fā)現(xiàn),施加外源核黃素能夠提高水稻對鹽和高溫脅迫的耐受性,且5種逆境脅迫均能不同程度地促進核黃素在水稻中的積累,尤其鹽和高溫脅迫的促進效果最明顯。隨后的qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),鹽和高溫脅迫能顯著誘導水稻幼苗中大部分核黃素合成相關(guān)基因的表達,進一步證實鹽和高溫脅迫能促進核黃素在水稻體內(nèi)的合成和積累。值得指出的是,高溫脅迫下核黃素合成基因的表達在粳稻中上調(diào)幅度更大,說明粳稻對高溫脅迫較秈稻更敏感。在生產(chǎn)中,粳稻適于在北方溫帶地區(qū)栽培,而秈稻適于南方熱帶和亞熱帶地區(qū)栽培,就已說明粳稻較秈稻對高溫更敏感,這與本研究結(jié)果高度一致。進一步的生理指標檢測發(fā)現(xiàn),核黃素能提高鹽和高溫脅迫下水稻體內(nèi)的過氧化氫酶活性,并降低其體內(nèi)H2O2含量。Hu等[19]最近也發(fā)現(xiàn)核黃素合成關(guān)鍵酶之一的二氧四氫喋啶合成酶的缺失,會導致水稻體內(nèi)核黃素合成下降和活性氧積累。這些結(jié)果均說明,核黃素能通過促進體內(nèi)活性氧的清除,消除氧化損傷,提高植物的逆境脅迫耐受性。

    同時,核黃素對植物脅迫響應的影響存在較大差異。在研究中發(fā)現(xiàn),核黃素能顯著提高水稻的耐鹽性,而對耐堿性沒有影響。雖然在粳稻Kitaake中,堿脅迫也能一定程度提高核黃素合成基因的表達,但是外源核黃素并沒有改良其耐堿性。筆者認為可能的原因與核黃素自身的理化性質(zhì)有關(guān)。核黃素微溶于水且溶液易變質(zhì)[28],在堿性溶液中或遇光變質(zhì),在鹽溶液中溶解性提高。在鹽脅迫下,由于核黃素溶解度提高,使其能充分參與調(diào)控鹽脅迫響應,提高水稻耐鹽性。在堿脅迫條件下,由于溶解度低或結(jié)構(gòu)被破壞,從而無法參與調(diào)控堿脅迫響應。另外,筆者也推測在氧化脅迫條件下,可能造成了核黃素的結(jié)構(gòu)破壞,使其無法在氧化脅迫響應中發(fā)揮作用。本研究中核黃素除了在鹽脅迫下能改善T98B的幼苗高度外,對于其余處理幼苗高度的影響不明顯,可能是核黃素的濃度還沒有達到促進幼苗生長的程度。當然,這些猜測還有待進一步研究和證實。雖然滲透脅迫(模擬干旱)能促進核黃素在水稻體內(nèi)的合成,但是外源施加核黃素卻提高了水稻對滲透脅迫的敏感性,意味著核黃素負調(diào)控水稻的滲透或干旱脅迫耐受性。最近,Tian等[20]將玉米核黃素合成酶基因ZmRIBA1異源過表達于擬南芥,發(fā)現(xiàn)核黃素合成增加,并改善了轉(zhuǎn)基因植株的滲透脅迫耐受性。這些結(jié)果說明,核黃素參與滲透或干旱脅迫響應的機制與其他非生物脅迫響應不同,而且在不同物種間還存在差異,但其背后的分子機制尚不清楚,仍需要進一步研究。

    總之,本研究初步證實核黃素在水稻的非生物脅迫響應中發(fā)揮著重要作用。特別是發(fā)現(xiàn),核黃素正調(diào)控水稻鹽和高溫脅迫的耐受性,而負調(diào)控滲透或干旱脅迫耐受性。該研究結(jié)果為進一步探究核黃素參與非生物脅迫響應的分子機制提供了線索,也為耐逆水稻的培育提供了啟示。

    猜你喜歡
    核黃素秈稻粳稻
    從稻名演變看秈稻的起源
    2021年無為市優(yōu)質(zhì)中秈稻品種比較試驗
    我國雙季早粳稻實現(xiàn)“零的突破”
    解讀粳稻品種南方種植播期
    豫南粳稻機械化適應品種篩選及利用研究
    治療口腔炎的核黃素
    雜交秈稻花藥基部開裂性狀的遺傳研究
    播期播量對晚粳稻寧84農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量的影響
    亞硫酸氫鈉-過氧化氫超微弱化學發(fā)光體系用于核黃素檢測
    江西省粳稻種植面積突破6 666 hm2
    99国产精品99久久久久| 亚洲国产日韩一区二区| 成人手机av| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲国产精品一区三区| 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美在线黄色| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 男女国产视频网站| 麻豆乱淫一区二区| 黄片小视频在线播放| 亚洲av欧美aⅴ国产| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美 日韩 精品 国产| 热99久久久久精品小说推荐| 日韩人妻精品一区2区三区| 爱豆传媒免费全集在线观看| av电影中文网址| 久久精品国产a三级三级三级| 在线天堂中文资源库| 青草久久国产| 人人澡人人妻人| 国产亚洲av高清不卡| 一区福利在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 交换朋友夫妻互换小说| www.熟女人妻精品国产| 激情视频va一区二区三区| 久久久欧美国产精品| 美女大奶头黄色视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产成人av教育| 两个人看的免费小视频| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美黑人欧美精品刺激| 嫁个100分男人电影在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 12—13女人毛片做爰片一| 国产在线视频一区二区| 午夜老司机福利片| 亚洲专区字幕在线| avwww免费| 永久免费av网站大全| 欧美一级毛片孕妇| 97精品久久久久久久久久精品| 少妇被粗大的猛进出69影院| 中文欧美无线码| 中国国产av一级| 99热全是精品| 老汉色av国产亚洲站长工具| 精品国产一区二区久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 日本91视频免费播放| 成在线人永久免费视频| 欧美一级毛片孕妇| 国产精品久久久久久精品电影小说| 欧美97在线视频| 51午夜福利影视在线观看| 久久久久视频综合| 丝袜脚勾引网站| 精品国产一区二区三区四区第35| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 欧美激情久久久久久爽电影 | 精品人妻在线不人妻| 欧美在线一区亚洲| 老司机福利观看| 成年人午夜在线观看视频| 日本欧美视频一区| 最新的欧美精品一区二区| 久久影院123| 另类精品久久| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 两人在一起打扑克的视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产福利在线免费观看视频| 老司机福利观看| a 毛片基地| av视频免费观看在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 国产一区二区 视频在线| 性色av一级| 啦啦啦 在线观看视频| bbb黄色大片| 中文字幕高清在线视频| 国产又爽黄色视频| 国产精品偷伦视频观看了| 国产成人av激情在线播放| 老司机靠b影院| 国产在线免费精品| av片东京热男人的天堂| 色老头精品视频在线观看| 成年动漫av网址| 视频在线观看一区二区三区| 久久久久久久精品精品| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产伦人伦偷精品视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 婷婷色av中文字幕| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 欧美一级毛片孕妇| 欧美日韩精品网址| 亚洲精品粉嫩美女一区| 各种免费的搞黄视频| 美女国产高潮福利片在线看| 一二三四社区在线视频社区8| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 亚洲av电影在线进入| a级毛片在线看网站| 国产亚洲欧美精品永久| 精品少妇内射三级| 久久精品国产a三级三级三级| 香蕉丝袜av| 婷婷丁香在线五月| 丝袜脚勾引网站| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 99久久精品国产亚洲精品| 老司机影院成人| 亚洲视频免费观看视频| 久久这里只有精品19| 一区二区三区乱码不卡18| 欧美在线黄色| 欧美日韩一级在线毛片| 岛国在线观看网站| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 波多野结衣一区麻豆| 黑人欧美特级aaaaaa片| 婷婷成人精品国产| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 精品国内亚洲2022精品成人 | 99九九在线精品视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲情色 制服丝袜| 久久久久久久国产电影| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 一本色道久久久久久精品综合| 欧美日韩精品网址| 亚洲人成77777在线视频| 老司机午夜福利在线观看视频 | 999久久久国产精品视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久热在线av| 欧美精品高潮呻吟av久久| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产一区二区 视频在线| 成人国产一区最新在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 午夜久久久在线观看| 亚洲精品国产区一区二| 国产福利在线免费观看视频| 真人做人爱边吃奶动态| 啦啦啦免费观看视频1| 国产成人影院久久av| 国产精品 欧美亚洲| 精品国产国语对白av| 欧美一级毛片孕妇| 久久 成人 亚洲| 国产精品1区2区在线观看. | 一二三四社区在线视频社区8| 国产福利在线免费观看视频| 国产麻豆69| 久久青草综合色| 动漫黄色视频在线观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产免费福利视频在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产视频一区二区在线看| avwww免费| 91av网站免费观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| av在线播放精品| 一区二区三区激情视频| av视频免费观看在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 99九九在线精品视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产成人免费无遮挡视频| 搡老岳熟女国产| 欧美xxⅹ黑人| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久影院123| 亚洲精品第二区| www.av在线官网国产| 操美女的视频在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 精品一品国产午夜福利视频| 麻豆av在线久日| 国产99久久九九免费精品| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产有黄有色有爽视频| √禁漫天堂资源中文www| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 老汉色av国产亚洲站长工具| 99久久精品国产亚洲精品| 老司机深夜福利视频在线观看 | 高清av免费在线| 老司机在亚洲福利影院| 日韩视频在线欧美| 午夜福利免费观看在线| 黄色片一级片一级黄色片| 午夜免费鲁丝| 蜜桃国产av成人99| 国产xxxxx性猛交| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区91| 国产熟女午夜一区二区三区| 少妇的丰满在线观看| 国产99久久九九免费精品| 欧美日韩av久久| 日本五十路高清| 91av网站免费观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 丝袜美足系列| 一区二区三区乱码不卡18| 欧美国产精品va在线观看不卡| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 欧美激情久久久久久爽电影 | 久久ye,这里只有精品| 欧美国产精品va在线观看不卡| 99国产极品粉嫩在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 一区二区三区激情视频| 一区福利在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 一本色道久久久久久精品综合| 一本综合久久免费| 国产亚洲精品第一综合不卡| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 成人国语在线视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 日韩电影二区| 国产黄色免费在线视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲视频免费观看视频| 国产成人影院久久av| 黄片播放在线免费| 久久久久久人人人人人| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产成人免费观看mmmm| 动漫黄色视频在线观看| 国产黄色免费在线视频| 水蜜桃什么品种好| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲情色 制服丝袜| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 人人妻人人澡人人看| 97精品久久久久久久久久精品| 久久中文字幕一级| 9191精品国产免费久久| 成人免费观看视频高清| 久久久久久久精品精品| 欧美黄色片欧美黄色片| 男女国产视频网站| 久热这里只有精品99| 成人国产av品久久久| 国产日韩欧美在线精品| 国产一区二区在线观看av| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av | 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 免费高清在线观看视频在线观看| 一级a爱视频在线免费观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 在线精品无人区一区二区三| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产真人三级小视频在线观看| 一进一出抽搐动态| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 美女国产高潮福利片在线看| 高清黄色对白视频在线免费看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 午夜福利,免费看| 午夜成年电影在线免费观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 91麻豆av在线| 亚洲第一av免费看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 久久亚洲精品不卡| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产在视频线精品| 成在线人永久免费视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产精品九九99| 国产高清国产精品国产三级| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产一区二区在线观看av| 成人av一区二区三区在线看 | 亚洲精品一区蜜桃| 国产av又大| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲欧美精品自产自拍| 99国产精品一区二区三区| 久久久国产精品麻豆| 国产成人av激情在线播放| 国产精品国产av在线观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久性视频一级片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产精品偷伦视频观看了| 少妇 在线观看| 日本a在线网址| 99九九在线精品视频| 成人免费观看视频高清| 热re99久久国产66热| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 制服人妻中文乱码| 在线观看免费视频网站a站| 精品久久蜜臀av无| 国产xxxxx性猛交| 成人国语在线视频| 在线观看一区二区三区激情| 少妇的丰满在线观看| 国产在线一区二区三区精| 最黄视频免费看| 不卡一级毛片| 青草久久国产| 九色亚洲精品在线播放| 免费观看人在逋| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 久久人妻福利社区极品人妻图片| 少妇人妻久久综合中文| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 99热全是精品| 中文欧美无线码| 亚洲五月色婷婷综合| 黄频高清免费视频| 欧美性长视频在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| av国产精品久久久久影院| 亚洲,欧美精品.| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 精品视频人人做人人爽| 91麻豆av在线| 国产精品久久久av美女十八| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产日韩欧美亚洲二区| 免费不卡黄色视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 大香蕉久久成人网| 性色av一级| 一区二区三区精品91| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产黄频视频在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 美女视频免费永久观看网站| av福利片在线| 精品人妻1区二区| 99热国产这里只有精品6| 亚洲精品在线美女| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久久精品区二区三区| 国产av又大| 久久久久国产精品人妻一区二区| 在线看a的网站| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产伦人伦偷精品视频| av不卡在线播放| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美性长视频在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美国产精品va在线观看不卡| 性色av乱码一区二区三区2| 国产成人精品久久二区二区免费| 午夜福利在线免费观看网站| 日韩免费高清中文字幕av| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 亚洲情色 制服丝袜| a级片在线免费高清观看视频| 精品一区在线观看国产| 1024香蕉在线观看| 免费在线观看日本一区| 美女高潮到喷水免费观看| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲精品美女久久av网站| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 午夜福利,免费看| xxxhd国产人妻xxx| 岛国毛片在线播放| 99国产精品99久久久久| 免费观看人在逋| 一本综合久久免费| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 午夜91福利影院| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲av片天天在线观看| 在线看a的网站| 久久精品国产综合久久久| 国产精品一区二区在线观看99| 久久精品国产综合久久久| 俄罗斯特黄特色一大片| 高清欧美精品videossex| 男女下面插进去视频免费观看| 五月天丁香电影| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲国产欧美网| 亚洲av电影在线进入| 又黄又粗又硬又大视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 97人妻天天添夜夜摸| 最新的欧美精品一区二区| 国产一级毛片在线| 三级毛片av免费| 丁香六月天网| svipshipincom国产片| 国产av一区二区精品久久| 大片电影免费在线观看免费| 丁香六月天网| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产精品久久久久成人av| 国产成人av教育| 亚洲熟女毛片儿| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| a级毛片黄视频| 日韩欧美免费精品| 在线av久久热| 又紧又爽又黄一区二区| 九色亚洲精品在线播放| avwww免费| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| av在线播放精品| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 欧美久久黑人一区二区| 一区二区三区激情视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 另类精品久久| 亚洲精华国产精华精| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 五月开心婷婷网| 高潮久久久久久久久久久不卡| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产激情久久老熟女| 秋霞在线观看毛片| 久久99一区二区三区| 人妻久久中文字幕网| 午夜福利视频在线观看免费| 视频区图区小说| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲五月婷婷丁香| 五月天丁香电影| 黄色视频不卡| 正在播放国产对白刺激| 12—13女人毛片做爰片一| 美女主播在线视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲精华国产精华精| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产成人精品无人区| 老司机亚洲免费影院| 丝袜美腿诱惑在线| 99九九在线精品视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 91老司机精品| 精品一区二区三卡| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲熟女精品中文字幕| 老汉色∧v一级毛片| 最近最新免费中文字幕在线| 黄色毛片三级朝国网站| 91成年电影在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产在线免费精品| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲久久久国产精品| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 桃红色精品国产亚洲av| 精品少妇久久久久久888优播| 日本黄色日本黄色录像| 高清在线国产一区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产一区二区三区av在线| 人人澡人人妻人| 亚洲中文字幕日韩| 精品国产乱码久久久久久男人| 99久久综合免费| 国产在线免费精品| 人人澡人人妻人| 久久久久久久国产电影| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产精品 欧美亚洲| 韩国精品一区二区三区| 后天国语完整版免费观看| 欧美日韩精品网址| 精品国产乱码久久久久久男人| 大片免费播放器 马上看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产三级黄色录像| 国产亚洲精品久久久久5区| 91九色精品人成在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 伦理电影免费视频| 热re99久久精品国产66热6| 又大又爽又粗| 一二三四在线观看免费中文在| 国产一区二区激情短视频 | 一本综合久久免费| 91精品三级在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产精品 欧美亚洲| 精品人妻在线不人妻| 久久久国产一区二区| 少妇精品久久久久久久| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 成年av动漫网址| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲欧美激情在线| tocl精华| 不卡一级毛片| 后天国语完整版免费观看| 另类精品久久| 在线观看免费午夜福利视频| 成人av一区二区三区在线看 | 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久精品成人免费网站| 欧美精品亚洲一区二区| 免费看十八禁软件| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲熟女毛片儿| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲精华国产精华精| 午夜两性在线视频| 美女主播在线视频| 午夜视频精品福利| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久国产精品男人的天堂亚洲| av国产精品久久久久影院| 大型av网站在线播放| 亚洲三区欧美一区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲国产看品久久| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 老司机午夜福利在线观看视频 | 一个人免费在线观看的高清视频 | 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 深夜精品福利| 热99国产精品久久久久久7| 免费观看a级毛片全部| 日韩欧美一区视频在线观看| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲七黄色美女视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 亚洲精品久久午夜乱码| 啦啦啦 在线观看视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 久久ye,这里只有精品| 黄色视频不卡| 黄色毛片三级朝国网站| 久久国产精品大桥未久av| 一本综合久久免费| cao死你这个sao货| 久久国产精品影院| 欧美日韩成人在线一区二区| 另类精品久久| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 丁香六月天网| 一级片'在线观看视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 欧美日韩成人在线一区二区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 久久久久久久国产电影| 日韩有码中文字幕| 亚洲 国产 在线| 热99re8久久精品国产| 国产在线观看jvid| 亚洲avbb在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久久精品94久久精品| 国产欧美亚洲国产| 欧美精品啪啪一区二区三区 |