上皮性卵巢癌患者血清miR-200a、miR-200b水平變化及意義

王麗雯，李靜芳，李曉紅，余鑫，楊偉，高艷章

昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明650118

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均較高，并呈現(xiàn)年輕化趨勢，嚴(yán)重危害女性生命健康。由于其潛伏期長，早期缺乏臨床癥狀，多數(shù)確診時(shí)已至中晚期，預(yù)后極差。卵巢癌中超過80%的病理類型是上皮性卵巢癌（EOC），CA125是目前診斷EOC最常用的生物標(biāo)志物，但其早期診斷的敏感性僅為40%［1］。因此，發(fā)現(xiàn)新的EOC診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物對于提高早期診斷的敏感性和特異性、優(yōu)化治療靶點(diǎn)、改善預(yù)后具有重要的臨床意義。miRNA參與了人類30%以上基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控，不僅與細(xì)胞的發(fā)育、分化、代謝、衰老、免疫等生命活動(dòng)有關(guān)，而且與腫瘤也有密切聯(lián)系［2］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-200家族在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)［3-4］。目前關(guān)于miR-200a和miR-200b在EOC患者血清中的水平變化少見報(bào)道，本研究通過檢測miR-200a和miR-200b在EOC患者血清中的水平變化，分析其對EOC診斷和預(yù)后評估的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2019年6月—2020年6月收治的EOC患者80例（EOC組），年齡（51.6 ±12.5）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：首診于本院，經(jīng)病理檢查確診；手術(shù)、診斷和治療均參照《卵巢惡性腫瘤診斷與治療指南》［5］中的標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)前未進(jìn)行過激素治療、放射治療、化學(xué)藥物治療；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；EOC為轉(zhuǎn)移癌和（或）復(fù)發(fā)癌；合并其他系統(tǒng)的重大疾病或存在重要臟器的嚴(yán)重功能損傷。另選擇卵巢良性病變80例（良性對照組），年齡（49.3 ± 11.4）歲，其中囊腺瘤36例、巧克力囊腫44例；體檢健康女性80例（正常對照組），年齡（50.6 ± 13.4）歲。三組年齡具有可比性。本研究由我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批號：YLJS2022-017），獲得受試者或其家屬知情同意。

1.2 血清miR-200a、miR-200b水平檢測 采集受試者空腹靜脈血，分離血清，-80 ℃保存。加入TRIzol試劑提取miRNA，濃度和純度由美國Thermo核酸蛋白定量儀測定。將分離的miRNA逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA，以cDNA為模板、U6為參照物，應(yīng)用美國ABI 7500 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，引物序列見表1。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)；退火/延伸60 ℃ 30 s。最后記錄Ct值，以U6為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對水平。

表1 miR-200a、miR-200b及內(nèi)參基因PCR擴(kuò)增引物序列

1.3 EOC治療與預(yù)后觀察方法 EOC患者均接受手術(shù)+紫杉醇+順鉑治療方案。完成手術(shù)和6個(gè)及以上化療周期后，患者達(dá)到臨床緩解。門診隨訪2年，記錄復(fù)發(fā)情況。以?；?個(gè)月以上，血清腫瘤標(biāo)志物出現(xiàn)持續(xù)進(jìn)行性增高，影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)異常包塊或結(jié)節(jié)，臨床出現(xiàn)腹脹、腹痛或腹水中有癌細(xì)胞為復(fù)發(fā)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用偏度和峰度系數(shù)法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以表示，組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用F檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（ROC）曲線評估血清miR-200a和miR-200b對EOC的診斷價(jià)值，ROC曲線下面積（AUC）比較采用Delong非參數(shù)法；生存曲線采用Kaplan-Meier法進(jìn)行Log-Rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清miR-200a、miR-200b水平比較 EOC組血清miR-200a、miR-200b水平高于正常對照組和良性對照組，正常對照組高于良性對照組（P均＜0.01）。見表2。

表2 三組血清miR-200a、miR-200b水平比較（）

表2 三組血清miR-200a、miR-200b水平比較（）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與良性對照組比較，△P＜0.01。

組別EOC組良性對照組正常對照組miR-200b 4.28 ± 1.95*△0.59 ± 0.35*1.05 ± 0.24 n 80 80 80 miR-200a 6.02 ± 3.33*△0.62 ± 0.41*1.14 ± 0.39

2.2 不同臨床病理特征EOC患者血清miR-200a、miR-200b水平比較 EOCⅢ～Ⅳ期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹水、腹水/腹腔灌洗液檢出惡細(xì)胞患者的血清miR-200a、miR-200b水平分別高于Ⅰ～Ⅱ期、未合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無腹水、腹水/腹腔灌洗液未檢出惡細(xì)胞患者（P＜0.05或＜0.01）。見表3。

表3 不同臨床病理特征EOC患者血清miR-200a、miR-200b水平比較（）

表3 不同臨床病理特征EOC患者血清miR-200a、miR-200b水平比較（）

臨床病理特征年齡＜50歲≥50歲FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期病理類型子宮內(nèi)膜樣癌透明細(xì)胞癌漿液性癌組織分化程度中/低分化高分化淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無腹水有無腹水/腹腔灌洗液檢出惡細(xì)胞有無CA125＜300 U/mL≥300 U/mL n miR-200a P miR-200b P 1.6201.951 29 51 5.99 ± 3.49 5.61 ± 3.13 4.35 ± 2.03 4.31 ± 1.89 0.0000.000 16 64 4.17 ± 2.16 6.53 ± 2.86 3.61 ± 1.45 5.01 ± 1.59 1.5821.019 27 34 19 5.81 ± 3.62 5.22 ± 2.83 5.74 ± 3.05 3.98 ± 1.64 4.47 ± 1.23 4.32 ± 1.48 1.4420.853 21 59 5.86 ± 3.50 5.54 ± 3.11 4.33 ± 1.93 4.21 ± 1.90 0.0330.030 60 20 5.68 ± 3.44 3.75 ± 1.61 4.45 ± 2.13 3.22 ± 1.90 0.0210.022 52 28 5.63 ± 3.39 3.37 ± 2.91 4.49 ± 1.96 3.18 ± 1.34 0.0150.017 50 30 5.79 ± 3.37 3.35 ± 2.21 4.42 ± 1.84 3.09 ± 1.98 0.9540.895 42 38 5.89 ± 3.71 6.01 ± 3.84 4.35 ± 2.11 4.62 ± 1.99

2.3 血清miR-200a和miR-200b對EOC的診斷效能 將血清miR-200a和miR-200b水平作為檢驗(yàn)變量、確診為EOC作為狀態(tài)變量（1=是，0=否），以正常女性和良性患者為對照，繪制ROC曲線，結(jié)果顯示血清miR-200a和miR-200b有助于EOC的診斷（AUC分別為0.890和0.912），二者聯(lián)合診斷EOC的AUC為0.962，優(yōu)于單獨(dú)指標(biāo)，其靈敏度和特異度均顯著提高。見表4。

表4 血清miR-200a、miR-200b對EOC的診斷效能

2.4 不同血清miR-200a、miR-200b水平的EOC患者的預(yù)后比較 對EOC患者隨訪6～24（16.6 ±7.1）個(gè)月，其中復(fù)發(fā)54例，死亡0例，復(fù)發(fā)率為67.5%，復(fù)發(fā)時(shí)間（12.7 ± 5.4）個(gè)月。以中位數(shù)將EOC患者分為低水平和高水平，Kaplan-Meier分析顯示，血清miR-200a高水平患者的復(fù)發(fā)時(shí)間為±6.7）個(gè)月縮短（P＜0.05）；血清miR-200b高水平患者的復(fù)發(fā)時(shí)間為（14.7 ± 6.9）個(gè)月，較低水平患者的復(fù)發(fā)時(shí)間（18.2 ± 7.0）個(gè)月縮短（P＜0.05）。

3 討論

卵巢癌是女性病死率最高的惡性腫瘤，由于早期診斷困難、手術(shù)治療后復(fù)發(fā)率高、缺乏特異性理想的治療藥物，多數(shù)EOC患者因腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移而復(fù)發(fā)，最終導(dǎo)致死亡。積極尋找有效的生物標(biāo)志物對卵巢癌的診斷和預(yù)后判斷具有重要意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA調(diào)控腫瘤相關(guān)基因，參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲以及血管生成，與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6］。miR-200家族在EOC、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)［7］。有研究者對320例卵巢癌患者和2 759例健康婦女體液和血液中可能用于卵巢癌早期診斷的RNA標(biāo)志物miR-21、miR-200家族、miR-205、miR-10a、miR-346進(jìn)行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)miR-200家族在EOC中的上調(diào)倍數(shù)最高，提示miR-200家族在EOC的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用［8］。miR-200a和miR-200b屬于miR-200家族，位于1號染色體（1p33.36），通過5'種子序列與DCAMKL-1靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)配對，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）［9-10］。EMT可使癌細(xì)胞獲得干細(xì)胞特性，是惡性腫瘤進(jìn)展、復(fù)發(fā)和化療耐藥的主要原因［11］。EMT是EOC發(fā)生的關(guān)鍵，miR-200表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致E-鈣黏蛋白表達(dá)增加，E-鈣黏蛋白表達(dá)增加可維持上皮表型和抑制EMT［12］。有研究表明，卵巢表面上皮細(xì)胞中E-鈣黏蛋白表達(dá)增加，可抑制EMT，使上皮細(xì)胞表面發(fā)生內(nèi)陷。在免疫缺陷小鼠中，E-鈣黏蛋白表達(dá)降低可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞形成腫瘤［13］。miR-200家族在健康人群中正常表達(dá)，原發(fā)性腫瘤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者表達(dá)上調(diào)，但在遷移和侵襲過程中表達(dá)下調(diào)［14］，卵巢良性病變可能具有惡性腫瘤的特征，如高浸潤性、高增殖率和高轉(zhuǎn)移性，在EMT過程中上皮細(xì)胞向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)變后，才能夠突破基底膜到達(dá)遠(yuǎn)處。本研究結(jié)果顯示，EOC組血清miR-200a、miR-200b水平均高于正常對照組，而良性對照組血清miR-200a、miR-200b水平低于正常對照組，提示miR-200家族表達(dá)水平升高有助于提示發(fā)生癌變的風(fēng)險(xiǎn)，這些抑癌基因的改變可能是卵巢良性病變向EOC轉(zhuǎn)化的早期步驟。

miR-200家族在卵巢癌中的表達(dá)失調(diào)是miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵性的機(jī)制。miR-200家族主要靶向調(diào)控兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子鋅指蛋白1/2（ZEB1/2）對癌細(xì)胞進(jìn)行重編程，從而發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移［8］。miR-200家族直接或間接結(jié)合 ZEB1/2使mRNA 降解，導(dǎo)致E-鈣黏蛋白、波形蛋白和β-連環(huán)蛋白等上調(diào)，從而獲得間充質(zhì)標(biāo)記物，使癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增加，進(jìn)而發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移［8-14］。本研究結(jié)果顯示，EOC晚期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹水或腹腔灌洗液檢出惡細(xì)胞患者的血清miR-200a、miR-200b水平分別高于晚期、未合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹水或腹腔灌洗液檢出惡細(xì)胞患者，表明miR-200a和miR-200b高水平與EOC腫瘤進(jìn)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

傳統(tǒng)的血清腫瘤標(biāo)志物CA125等對于早期EOC的診斷存在敏感度較低、特異度不足等問題，血清miRNA比CA125更能反映機(jī)體的變化過程，并且取樣方便，創(chuàng)傷性小。本研究結(jié)果顯示，血清miR-200a和miR-200b用于EOC診斷的AUC為0.890和0.912，敏感度和特異度均良好，其聯(lián)合診斷價(jià)值更高，提示血清miR-200a和miR-200b是一種潛在的生物標(biāo)志物，對EOC的診斷有一定的作用。

EOC患者癌癥復(fù)發(fā)的主要由癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、化學(xué)藥物耐藥和癌癥干細(xì)胞特性增強(qiáng)所引起。miR-200家族具有通過抑制EMT、抑制干細(xì)胞更新和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來介導(dǎo)的腫瘤抑制功能［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌中miR-200a、miR-200b過度表達(dá)提示預(yù)后較差［15］。本研究結(jié)果顯示，血清miR-200a、miR-200b高水平患者的復(fù)發(fā)時(shí)間較低水平患者縮短，表明血清miR-200a、miR-200b高水平的EOC患者術(shù)后易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差。

綜上所述，EOC患者血清miR-200a、miR-200b水平高于正常人群，其可能作為EOC診斷和預(yù)測復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物，miR-200a、miR-200b水平升高者預(yù)后較差。未來隨著相關(guān)研究的不斷開展，miR-200a和miR-200b有望成為EOC診斷及預(yù)后評估的潛在生物標(biāo)志物。