靜脈注射咪達(dá)唑侖對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠腦神經(jīng)炎癥和損傷的改善作用及其機(jī)制

孟元元，劉艷，張華強(qiáng)，周民，姚玲玲

1 武漢科技大學(xué)附屬普仁醫(yī)院麻醉科，武漢430000；2 湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院 襄陽(yáng)市中心醫(yī)院疼痛科

研究表明，蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）發(fā)病后72 h內(nèi)發(fā)生的早期腦損傷是導(dǎo)致患者高病死率和高致殘率的主要原因，其發(fā)生與多種病理機(jī)制相關(guān)，而神經(jīng)炎癥被認(rèn)為在SAH后早期腦損傷中發(fā)揮重要作用［1-2］。環(huán)腺苷酸（cAMP）作為重要的第二信使，介導(dǎo)許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括蛋白激酶A（PKA）/環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（CREB）信號(hào)通路。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路與抑郁癥及認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)［3］。已有研究發(fā)現(xiàn)，TGR5激動(dòng)劑INT-777通過(guò)激活cAMP/PKA信號(hào)通路減弱SAH發(fā)病后腦損傷中神經(jīng)炎癥，改善SAH后的短期神經(jīng)行為功能［4］。咪達(dá)唑侖（MDZ）作為一種常用的麻醉劑，具有水溶性、起效快、作用時(shí)間短等特點(diǎn)，并對(duì)人腦的神經(jīng)基礎(chǔ)產(chǎn)生藥理學(xué)作用［5］，但目前尚無(wú)研究報(bào)道MDZ對(duì)SAH發(fā)病后的神經(jīng)保護(hù)作用。2022年3月—12月，我們對(duì)SAH大鼠給予MDZ進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)神經(jīng)炎癥的影響，探討其作用機(jī)制與cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡健康雄性Wistar大鼠65只，體質(zhì)量280～320 g，購(gòu)自廣州檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)有限公司，許可證號(hào)：SYXK（粵）2022-0299。飼養(yǎng)條件：室溫（22 ± 1）℃，濕度60% ± 5%，12 h晝夜循環(huán)。自由飲食飲水。本研究經(jīng)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)，并按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。

1.1.2 主要試劑與儀器 MDZ購(gòu)自浙江恩華藥業(yè)股份有限公司；PKA抑制劑H-89購(gòu)自美國(guó)MedChemexpress公司；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6蛋白質(zhì)提取試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；ECL試劑購(gòu)自美國(guó)Amersham Biosciences公司；cAMP、p-PKA、p-CREB、PKA、CREB一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。Synergy LX多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司；BX61光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 動(dòng)物分組與SAH模型制備 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組10只和造模組55只，參照文獻(xiàn)［6］方法制備SAH模型。腹腔注射4%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，俯臥位固定。在枕外隆凸附近切開，剪開淺層肌肉，顯露頸夾肌間隙，對(duì)環(huán)枕膜、枕骨進(jìn)行初步定位。抽取股動(dòng)脈血3.5 mL，在2 min內(nèi)注入枕大池，注入后保持30°低頭30 min，使血液沉積在腦底血管。間隔48 h后，同樣方法抽取另一側(cè)股動(dòng)脈血注入枕大池。當(dāng)觀察到大鼠腦底基底池部位有明顯的血液存在，并有腦脊液漏出，表明SAH造模成功。假手術(shù)組進(jìn)行上述同樣操作，向枕大池注入等體積生理鹽水。

1.3 藥物干預(yù)方法 取SAH造模成功的50只大鼠，隨機(jī)分為SAH組、MDZ低劑量組、MDZ中劑量組、MDZ高劑量組、MDZ高劑量+H-89組，每組各10只。MDZ高、中、低劑量組分別經(jīng)頸靜脈注射0.30、0.15、0.05 mg/kg MDZ，同時(shí)腹腔注射等體積生理鹽水；MDZ高劑量+H-89組經(jīng)頸靜脈注射0.3 mg/kg MDZ，同時(shí)腹腔注射5 mg/kg H-89；SAH組、假手術(shù)組頸靜脈及腹腔注射等體積生理鹽水。每天1次，連續(xù)3 d。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)估 末次給藥2 h后，參照改良的Garcia神經(jīng)功能評(píng)分系統(tǒng)［7］，從自主活動(dòng)、四肢運(yùn)動(dòng)對(duì)稱性、前肢伸展、攀爬抓握、雙側(cè)軀干觸覺反應(yīng)、觸角反應(yīng)6個(gè)方面評(píng)估各組大鼠的神經(jīng)功能，最低3分，最高18分，評(píng)分越低表示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.5 血清炎癥因子檢測(cè) 采用ELISA法。采集大鼠靜脈血，使用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β、TNF-α、IL-6含量，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明。

1.6 腦含水量檢測(cè) 采用干/濕法。各組隨機(jī)取3只大鼠，在深度麻醉下將大鼠斬首，摘除大腦，取出同側(cè)腦組織，立即使用電子天平稱取濕重。將腦組織置于100 ℃恒溫烘箱中48 h至恒重，使用電子天平稱取干重。以（濕重－干重）/濕重×100%計(jì)算腦含水量。

1.7 SAH等級(jí)評(píng)分 取各組剩余的7只大鼠，對(duì)大腦基底表面的6個(gè)區(qū)域進(jìn)行SAH等級(jí)評(píng)估。0級(jí)：無(wú)蛛網(wǎng)膜下腔血液；1級(jí)：少量蛛網(wǎng)膜下腔血液；2級(jí)：具有肉眼可見的中度血塊；3級(jí)：血塊阻塞了所有動(dòng)脈。

1.8 腦組織形態(tài)學(xué)觀察 采用HE染色。SAH等級(jí)評(píng)分結(jié)束后，取部分海馬區(qū)腦組織，加入4%多聚甲醛固定，脫水、石蠟包埋、切成4 μm厚的切片。石蠟切片脫蠟、復(fù)水、蘇木精染色60 s，1%鹽酸乙醇染色3 s，最后伊紅染色1 min。使用中性樹膠將切片密封到載玻片上，光學(xué)顯微鏡400倍視野下觀察組織形態(tài)學(xué)損傷情況。

1.9 腦組織cAMP/PKA/CREB通路相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取剩余部分腦組織，使用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取蛋白質(zhì)。通過(guò)SDSPAGE分離樣品中的蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，4 ℃下與cAMP、p-PKA、p-CREB、PKA、CREB一抗（稀釋濃度均為1∶1 000）孵育24 h。用Tris緩沖鹽水洗滌后，加入二抗，室溫孵育1 h。加入ECL試劑使印跡條帶可視化，用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS27.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性通過(guò)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)進(jìn)行分析，呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 假手術(shù)組、SAH組、MDZ低劑量組、MDZ中劑量組、MDZ高劑量組、MDZ高劑量+H-89組神經(jīng)功能評(píng)分分別為（21.23 ±2.14）、（5.55 ± 0.56）、（8.92 ± 0.90）、（14.24 ±1.44）、（18.42 ± 1.85）、（9.25 ± 0.93）分。與假手術(shù)組比較，SAH組神經(jīng)功能評(píng)分降低（P＜0.05）；與SAH組比較，MDZ低、中、高劑量組評(píng)分均升高，其中高劑量組高于中、低劑量組，中劑量組高于低劑量組（P均＜0.05）；MDZ高劑量+H-89組評(píng)分較MDZ高劑量組降低（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平比較與假手術(shù)組比較，SAH組血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平升高（P均＜0.05）；與SAH組比較，MDZ低、中、高劑量組IL-1β、TNF-α、IL-6水平降低，且高劑量組低于中、低劑量組，中劑量組低于低劑量組（P均＜0.05）；MDZ高劑量+H-89組血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平較MDZ高劑量組升高（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（ng/mL，）

表1 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（ng/mL，）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與SAH組比較，bP＜0.05；與MDZ低劑量組比較，cP＜0.05；與MDZ中劑量組比較，dP＜0.05；與MDZ高劑量組比較，eP＜0.05。

TNF-α 0.72 ± 0.08 6.72 ± 0.68a 4.21 ± 0.43b 2.16 ± 0.23bc 1.15 ± 0.12bcd 4.33 ± 0.45e組別假手術(shù)組SAH組MDZ低劑量組MDZ中劑量組MDZ高劑量組MDZ高劑量+H-89組n 10 10 10 10 10 10 IL-1β 0.88 ± 0.09 6.82 ± 0.69a 4.62 ± 0.47b 2.55 ± 0.26bc 1.04 ± 0.11bcd 4.72 ± 0.48e IL-6 0.38 ± 0.04 42.15 ± 4.23a 27.82 ± 2.79b 12.35 ± 1.24bc 4.62 ± 0.48bcd 25.46 ± 2.55e

2.3 各組大鼠腦含水量比較 假手術(shù)組、SAH組、MDZ低劑量組、MDZ中劑量組、MDZ高劑量組、MDZ高劑量+H-89組腦含水量分別為58.15% ± 2.06%、82.77% ± 3.11%、72.88% ± 2.61%、67.88% ±2.39%、60.21% ± 2.09%、76.08% ± 2.47%。與假手術(shù)組比較，SAH組腦含水量升高（P＜0.05）；與SAH組比較，MDZ低、中、高劑量組腦含水量降低，且高劑量組低于中、低劑量組，中劑量組低于低劑量組（P均＜0.05）；MDZ高劑量+H-89組腦含水量較MDZ高劑量組增加（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠SAH等級(jí)評(píng)分比較 假手術(shù)組、SAH組、MDZ低劑量組、MDZ中劑量組、MDZ高劑量組、MDZ高劑量+H-89組大鼠SAH等級(jí)評(píng)分分別為（0.00 ± 0.00）、（17.11 ± 1.72）、（11.34 ± 1.14）、（7.24 ± 0.73）、（4.26 ± 0.43）、（11.83 ± 1.19）分。與假手術(shù)組比較，SAH組評(píng)分升高（P＜0.05）；與SAH組比較，MDZ低、中、高劑量組評(píng)分均降低，且高劑量組低于中、低劑量組，中劑量組低于低劑量組（P均＜0.05）；MDZ高劑量+H-89組評(píng)分較MDZ高劑量組增加（P＜0.05）。

2.5 各組大鼠腦組織海馬區(qū)形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組海馬組織神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常；SAH組神經(jīng)元細(xì)胞核碎裂，出現(xiàn)細(xì)胞壞死現(xiàn)象，MDZ低劑量組、MDZ中劑量組、MDZ高劑量組神經(jīng)元細(xì)胞損傷逐漸減輕，MDZ高劑量組趨于正常化；MDZ高劑量+H-89組較MDZ高劑量組神經(jīng)元細(xì)胞損傷加重。見OSID碼圖1。

2.6 各組大鼠腦組織cAMP/PKA/CREB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 SAH組cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB表達(dá)水平較假手術(shù)組降低（P均＜0.05）；MDZ低、中、高劑量組較SAH組增加（P均＜0.05）；MDZ高劑量+H-89組較MDZ高劑量降低（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腦組織cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表達(dá)比較（）

表2 各組大鼠腦組織cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表達(dá)比較（）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與SAH組比較，bP＜0.05；與MDZ低劑量組比較，cP＜0.05；與MDZ中劑量組比較，dP＜0.05；與MDZ高劑量組比較，eP＜0.05。

p-CREB/CREB 0.94 ± 0.10 0.11 ± 0.02a 0.33 ± 0.04b 0.65 ± 0.07bc 0.89 ± 0.10bcd 0.36 ± 0.04e組別p-PKA/PKA假手術(shù)組SAH組MDZ低劑量組MDZ中劑量組MDZ高劑量組MDZ高劑量+H-89組n7 7 7 7 7 7 cAMP/β-actin 1.08 ± 0.11 0.25 ± 0.03a 0.44 ± 0.05b 0.69 ± 0.07bc 0.93 ± 0.10bcd 0.43 ± 0.05e 0.99 ± 0.10 0.18 ± 0.02a 0.39 ± 0.04b 0.62 ± 0.07bc 0.92 ± 0.10bcd 0.38 ± 0.04e

3 討論

早期腦損傷是SAH后不良結(jié)局的主要原因，包括SAH后腦水腫、血腦屏障破壞、神經(jīng)細(xì)胞的凋亡等病理變化［8］。神經(jīng)炎癥是SAH誘導(dǎo)的早期腦損傷中關(guān)鍵的病理過(guò)程之一［9］。研究顯示，抑制神經(jīng)炎癥可減輕大鼠SAH后的腦水腫和神經(jīng)元損傷，緩解早期腦損傷，進(jìn)而改善SAH的預(yù)后［10-11］。因此，在SAH的情況下，針對(duì)神經(jīng)炎癥的治療將減弱早期腦損傷并有利于改善神經(jīng)系統(tǒng)預(yù)后。MDZ是一種苯二氮?類藥物，主要通過(guò)苯二氮?受體作用于腦干和邊緣系統(tǒng)，屬于新型神經(jīng)毒劑抗驚厥藥。除了抗癲癇作用外，MDZ還具有抗炎作用，可以抑制神經(jīng)炎癥因子釋放［12］。研究發(fā)現(xiàn)，MDZ可通過(guò)減少BV-3小膠質(zhì)細(xì)胞中的NLRP3炎癥小體活化和促炎細(xì)胞因子釋放來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［13］。TANG等［14］報(bào)道，MDZ對(duì)缺氧/復(fù)氧引起的腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。此外，臨床研究顯示，咪達(dá)唑侖聯(lián)合芬太尼的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛能夠改善重癥SAH患者的腦代謝，具有較好的治療效果［15］。二次枕大池注血是目前構(gòu)建SAH模型較為理想且最為認(rèn)可的造模方式，具有操作簡(jiǎn)單、成功率高、動(dòng)物病死率低等優(yōu)點(diǎn)。腦水腫是SAH后的重要早期病理生理改變，也是導(dǎo)致SAH患者神經(jīng)功能障礙的重要因素；神經(jīng)炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞功能損傷和線粒體功能異常，是SAH后腦水腫發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制。本研究采用二次枕大池注血法構(gòu)建SAH大鼠模型，通過(guò)Garcia評(píng)分、腦含水量、SAH等級(jí)評(píng)分等評(píng)估MDZ對(duì)大鼠神經(jīng)功能及早期腦損傷的影響。結(jié)果顯示，SAH大鼠神經(jīng)功能評(píng)分降低，腦含水量、SAH等級(jí)評(píng)分以及神經(jīng)炎癥因子均增加，表明SAH大鼠神經(jīng)功能受損；MDZ干預(yù)能夠降低SAH大鼠腦含水量、SAH等級(jí)評(píng)分以及神經(jīng)炎癥因子水平，減輕SAH后的神經(jīng)功能損傷，改善腦水腫，表明MDZ是一種有效的抗SAH后早期腦損傷的神經(jīng)保護(hù)藥物。

cAMP作為重要的第二信使，參與學(xué)習(xí)記憶過(guò)程和突觸長(zhǎng)期可塑性的改變；CREB是cAMP胞核內(nèi)核蛋白，海馬區(qū)磷酸化的CREB是調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，具有多種生物學(xué)功能，包括參與調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)、記憶能力、改善認(rèn)知功能等，是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)成分［16］。CREB主要對(duì)PKA等信號(hào)發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)，cAMP激活PKA后，活化的PKA進(jìn)入細(xì)胞核，可磷酸化激活CREB［17］。JIN等［18］報(bào)道，在膿毒癥大鼠模型中，激活cAMP/PKA/CREB信號(hào)軸可通過(guò)減少海馬體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥因子（如IL-1β、IL-6和TNF-α）的表達(dá)，抑制神經(jīng)炎癥來(lái)預(yù)防認(rèn)知障礙。XIN等［19］報(bào)道，抑制SAH后的cAMP-CREB途徑可誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化和髓磷脂損傷。HU等［4］報(bào)道，在SAH大鼠模型中，INT-777可通過(guò)激活cAMP/PKA信號(hào)通路，抑制神經(jīng)炎癥，減輕腦水腫和SAH后的神經(jīng)功能缺損；而PKA抑制劑H-89可逆轉(zhuǎn)INT-777對(duì)SAH后神經(jīng)行為結(jié)局的神經(jīng)保護(hù)作用。以上研究表明cAMP/PKA/CREB通路是改善SAH后腦損傷和神經(jīng)功能障礙的重要治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，SAH后大鼠腦組織cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB表達(dá)顯著下降，說(shuō)明cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路被抑制；伴隨著神經(jīng)炎癥因子水平IL-1β、TNF-α、IL-6和腦組織含水量的增加以及嚴(yán)重的神經(jīng)元損傷，再次證實(shí)cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路抑制與SAH后早期腦損傷的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。給予不同劑量MDZ干預(yù)后，大鼠海馬組織中cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB表達(dá)上調(diào)，神經(jīng)炎癥因子水平降低，神經(jīng)元損傷得到緩解，推測(cè)MDZ可以通過(guò)激活cAMP/PKA/CREB通路抑制炎癥反應(yīng)，改善SAH大鼠神經(jīng)元損傷。為驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)推測(cè)，本研究在MDZ干預(yù)的基礎(chǔ)上應(yīng)用PKA抑制劑H-89進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H-89明顯減弱了MDZ對(duì)SAH大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，提示MDZ抑制神經(jīng)炎癥、緩解早期腦損傷的作用可能是通過(guò)激活cAMP/PKA/CREB通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，MDZ能夠抑制神經(jīng)炎癥，減輕SAH大鼠早期腦損傷，改善其神經(jīng)功能，其機(jī)制可能與激活cAMP/PKA/CREB通路有關(guān)。本研究?jī)H從動(dòng)物水平進(jìn)行了初步探究，后續(xù)可考慮從體外細(xì)胞水平進(jìn)行深入研究。此外，SAH的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，MDZ能否通過(guò)其他信號(hào)通路對(duì)SAH發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用仍需進(jìn)一步探討。