檳榔新擬盤多毛孢葉斑病菌的鑒定及生物學特性

李晶 謝開澤 張超 謝昌平

關鍵詞：檳榔；葉斑??；新擬盤多毛孢；鑒定；生物學特性

檳榔（ArecacatechuLinnaeus）是棕櫚科、檳榔屬的多年生常綠喬木。它含有豐富的藥理功能，對人體的多種系統(tǒng)具有一定調(diào)理作用，與益智仁、砂仁和巴戟天統(tǒng)稱為中國四大南藥，且檳榔居于首位。檳榔是濕熱型陽性植物，喜高溫、多雨，原產(chǎn)于熱帶太平洋地區(qū)和東南亞地區(qū)。2020年海南省的檳榔種植面積約12.47萬hm2[1]。近年來，隨著檳榔種植面積的逐漸擴大，檳榔的病害發(fā)生率也越來越高，嚴重影響檳榔的生長，制約著檳榔產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前，國內(nèi)外已報道的檳榔葉片上的病害有Colletotrichumgloeosporioides、C.cordylinicola、C.fructicola、C.siamense、C.tropicale、C.arecicola和C.karstii引起的炭疽病[2-5]、由Capnodiumsp.、Meliolacamelliae和Acroconidiellaarecae引起的煤煙病[6-7]、由Phomopsispalmicolaf.arecae、Macrophomasp.、Phyllosticaaecae、Pestalotiapalmarum、Diaporthelimonicola和Curvulariapseudobrachyspora引起的葉斑病[8]、由Corynesporaelaeidicola和Cercosporaarecacearum引起的褐斑病[9]，由Cuignardiaarecae引起的灰斑病[5]，由Cephaleurosvirescens引起的藻斑病[10]，由Xanthomonascampestrispv.arecae引起的細菌性條斑病[11]，由Burkholderiaandropogonis引起的細菌性葉斑病[12]等。

在海南省儋州市檳榔種植基地病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)一種為害檳榔葉片的葉斑病，該病害發(fā)生初期葉片上產(chǎn)生黑褐色小病斑，發(fā)病后病斑中央白褐色，病斑上散生眾多黑色小點，最終葉片干枯、倒垂，嚴重時導致葉片枯死，影響植株的光合作用，嚴重影響檳榔的產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，本研究結(jié)合形態(tài)學特征和多基因聯(lián)合建樹分析對該病原菌進行鑒定，并系統(tǒng)研究該病原菌的生物學特性，為檳榔葉斑病的準確診斷及田間防控措施的制定提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病株采集2021年3月，在海南省儋州市那大鎮(zhèn)大星大隊農(nóng)場檳榔種植基地（109°4567.02N，19°6077.54E）采集具有典型癥狀的病葉，并對檳榔發(fā)病植株的癥狀進行描述和拍攝。

1.1.2主要試劑DNA快速抽提試劑盒（OMEGABIO-TEK）、DNA片段回收試劑盒、Taq酶、DNAMarker和通用引物[13]（表1）。參照《植病研究方法》和《植物病理學實驗技術(shù)》[14]制備試驗所需培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)（PDA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)（PSA）、麥芽浸膏培養(yǎng)基（MEA）、胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（CA）、察氏培養(yǎng)基（Czapek）、大豆瓊脂培養(yǎng)基（SGA）、玉米粉培養(yǎng)基（CMA）和水瓊脂培養(yǎng)基（WA）8種培養(yǎng)基（表2）。

1.2方法

1.2.1菌株的分離與純化采用組織分離法對采集的病害標本進行菌株分離。用自來水將具有典型癥狀的發(fā)病葉片清洗干凈，于病健交界處剪取5mm×5mm的組織塊，先用75%酒精消毒30s，再用2%NaClO消毒1min，最后用無菌水沖洗30s（重復3次），晾干，置于PDA培養(yǎng)基上，28℃光照培養(yǎng)，待菌落產(chǎn)孢后，制備孢子懸浮液，挑取單孢獲得純化菌株，純化后的菌株轉(zhuǎn)入PDA斜面試管，于4℃保存，備用。

1.2.2致病性測定用無菌接種針刺傷和無傷在健康檳榔葉片進行致病性測定。分離菌株在PDA培養(yǎng)基上28℃、24h光照培養(yǎng)7d后，將直徑為5mm的菌餅接種到刺傷的檳榔葉片上，以直徑為5mm的無菌瓊脂塊作為對照，表面覆蓋吸水的滅菌紙，保濕培養(yǎng)7d，每個處理3片葉，3次重復。

觀察并記錄發(fā)病情況，待葉片發(fā)病，再次對發(fā)病部位進行菌株分離純化和鑒定[15]。

1.2.3病原菌形態(tài)學鑒定將純化后的菌株轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)7d，觀察記錄菌落的形態(tài)、顏色、大小及氣生菌絲發(fā)達程度。待菌落產(chǎn)孢后，顯微鏡下觀察分生孢子的形態(tài)特征，測量記錄分生孢子的長寬、有色胞的長度、各個分隔細胞長度、頂端附屬絲的數(shù)量以及頂端附屬絲和基部附屬絲長度。

1.2.4病原菌分子生物學鑒定將分離純化的菌株置于28℃、24h光照培養(yǎng)7d，刮取氣生菌絲100mg，按照真菌基因組DNA快速抽提試劑盒（OMEGABIO-TEK）說明書提取菌株DNA，選擇通用引物[13]（表1）進行PCR擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，產(chǎn)物經(jīng)純化后委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序[16]，將所得序列在NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，并提交序列至GenBank。下載GenBank中已報道的其他相關病原菌序列，以ITS-TUB-TEF順序用SequenceMatrix程序?qū)π蛄羞M行首尾拼接，并通過MEGA7.0軟件采用Maximumlikelihood法以NeopestalotiopsisclavisporaBRIP70210作為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5生物學特性分析（1）培養(yǎng)基對菌絲生長的影響。將直徑為5mm的菌餅接種于上述8種培養(yǎng)基平板上，于28℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每個處理3次重復。5d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

（2）溫度對菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的影響。①菌絲生長。將直徑為5mm的菌餅接種于PDA平板上，分別置于10、15、20、25、28、30、32、35℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每個處理3次重復。5d后采用十字交叉法測量菌落直徑。②分生孢子萌發(fā)。采用懸滴法，將分生孢子制成濃度為1×105個/mL的孢子懸浮液，滴于涂有PDA培養(yǎng)基的載玻片上，分別置于10、15、20、25、28、30、32、35℃培養(yǎng)箱，保濕黑暗培養(yǎng)，每個處理3次重復。7h后鏡檢并計算孢子萌發(fā)率。

（3）pH對菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的影響。①菌絲生長。用1mol/LHCl和1mol/LNaOH溶液調(diào)配pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的PDA培養(yǎng)基，將直徑為5mm的菌餅接種于PDA培養(yǎng)基平板上，于28℃黑暗培養(yǎng)，每個處理3次重復。5d后采用十字交叉法測量菌落直徑。②分生孢子萌發(fā)。用1mol/LHCl和1mol/LNaOH溶液調(diào)配pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的PDA培養(yǎng)基，將孢子懸浮液滴于涂有調(diào)好pH的PDA培養(yǎng)基的載玻片上，置于28℃培養(yǎng)箱黑暗保濕培養(yǎng)，每個處理3次重復。7h后鏡檢并計算孢子萌發(fā)率。

（4）光照對菌絲生長的影響。將直徑為5mm的菌餅接種于PDA培養(yǎng)基平板，分別置于24h光照、12h光暗交替和24h黑暗3個光周期的28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)5d，采用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理3次重復。

1.3數(shù)據(jù)處理

使用SPSS和Excel軟件分析試驗數(shù)據(jù)，使用AdobePhotoshopCS6軟件處理拍攝的圖片。

2結(jié)果與分析

2.1田間癥狀

2021年3月，在海南省儋州市檳榔種植基地發(fā)現(xiàn)檳榔葉斑病病株，該病害發(fā)病于檳榔葉片。發(fā)病初期，葉片上產(chǎn)生黑褐色小病斑，病斑近圓形或不規(guī)則形，病斑略有凹陷，環(huán)繞淡黃色暈圈（圖1A）；發(fā)病中期，小病斑增多且不斷向葉片兩端擴展，病斑中央黑褐色，邊緣淺褐色并帶有黃色暈圈（圖1B，圖1C）；后期病斑中央淺褐色，其上散生眾多黑色小點，即分生孢子堆，病部邊緣深褐色（圖1D），最終導致葉片干枯、倒垂。

2.2菌株的致病性測定

從采自海南省儋州市那大鎮(zhèn)大星大隊農(nóng)場檳榔種植基地的10份具典型葉斑病的檳榔葉片上分離出3種不同的真菌菌株，經(jīng)純化后得到菌株HNDZAC-1、HNDZAC-2和HNDZAC-3。

采用刺傷和無傷接種的方法將這3株菌株分別接種到活體健康的檳榔葉片上。刺傷接種HNDZAC-1菌株的葉片3d后，檳榔葉片開始發(fā)病，接種部位出現(xiàn)淺棕色病斑，邊緣具黃色暈圈，并逐漸向四周擴展；接種5d后，病斑中央壞死，邊緣呈棕色并帶有黃色暈圈；7d后，發(fā)病部位產(chǎn)生大量黑色分生孢子堆，與田間癥狀相同（圖2A，圖2B），發(fā)病率均為100%。無傷接種和對照組均未發(fā)?。▓D2C，圖2D）。從病斑處再次分離純化的菌株與接種菌株菌落形態(tài)特征相同，符合柯赫氏法則。而接種HNDZAC-2和HNDZAC-3菌株的葉片均未發(fā)病。結(jié)果表明菌株HNDZAC-1是檳榔葉斑病的致病菌。

2.3病原菌的形態(tài)學觀察

菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后菌落白色，邊緣不整齊，菌落直徑8.5～8.7cm（x=8.6cm），菌株的菌絲濃密，氣生菌絲發(fā)達，菌落背面有淺黃色色素沉積，且菌落具環(huán)狀同心輪紋（圖3A）。30d后在PDA培養(yǎng)基上菌株的分生孢子堆產(chǎn)生于菌絲層表面或埋生于培養(yǎng)基底層，呈黑色墨汁狀，單生或成簇聚集（圖3B，圖3C）。分生孢子梗退化為產(chǎn)孢細胞，產(chǎn)孢細胞無色透明，光滑，壁薄，圓筒形至安瓿瓶形（圖3D，3E）。分生孢子4分隔，分隔處縊縮，擬紡錘形，直立，18.3～28.6μm×5.1～7.6μm（x=23.1μm×6.4μm）；基部細胞倒圓錐形或倒三角形，壁薄，光滑，長2.5～6.1μm（x=3.6μm）；中間3個有色胞異色，長12.1～17.8μm（x=14.4μm），似甕形，隔膜及周壁顏色較其他部分深，基部向上第二細胞淺棕色，長3.0～5.7μm（x=4.3μm）；第三細胞深棕色，長3.8～5.0μm（x=4.4μm）；第四細胞淡棕色，長3.6～5.4μm（x=4.5μm）；頂端細胞無色透明，鈍三角形，壁薄而光滑，長3.9～5.2μm（x=4.4μm）；有2～3根管狀頂端附屬絲，從頂端脊處產(chǎn)生，不分枝，15.9～29.2μm（x=22.8μm）；具1根基部附屬絲，中生式，絲狀，不分枝，長2.4～7.0μm（x=4.6μm）（圖3F～圖3I）。根據(jù)上述形態(tài)特征，可初步判斷引起檳榔葉斑病的病原菌為新擬盤多毛孢屬（Neopestalotiopsissp.）。

2.4病原菌的分子鑒定

提取病原菌HNDZAC-1的DNA，進行PCR擴增病原菌ITS、TUB和TEF的基因序列，經(jīng)PCR反應并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，經(jīng)測序后得到基因長度分別為527、453、275bp的序列（圖4）（GenBank登錄號分別為ON323485、ON323486、ON323487）。將得到的序列在GenBank中進行比對，并對3個基因序列聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示：菌株HNDZAC-1與N.sonnerataeMFLUCC17-1745聚為一個進化分支，自舉支持率為98%（圖5）。因此，根據(jù)形態(tài)學鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，將引起檳榔葉斑病的病原菌鑒定為N.sonneratae。

2.5病原菌生物學特性

2.5.1培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響病原菌在8種不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落均為白色，邊緣整齊。在PDA、PSA和MEA三種培養(yǎng)基上的氣生菌絲發(fā)達，CA和Czapek培養(yǎng)基上的氣生菌絲較發(fā)達，SGA和CMA培養(yǎng)基上的氣生菌絲不發(fā)達，在WA培養(yǎng)基上的氣生菌絲極不發(fā)達；病原菌在8種培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d均無分生孢子產(chǎn)生（圖6）。菌絲在CA培養(yǎng)基上生長速度最快，其次是PDA培養(yǎng)基，生長最慢的是Czapek培養(yǎng)基（圖7）。

2.5.2溫度對菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的影響病原菌的菌絲在10～35℃下均能生長，當溫度為10～28℃時，菌絲生長速率隨溫度升高而增大，其中，在28℃時菌落生長速度最快，菌落直徑達6.49cm。當溫度為28～35℃時，隨溫度的增加菌落生長速度明顯減緩（圖8）。

病原菌分生孢子萌發(fā)的適宜溫度為20～32℃；在10～28℃范圍內(nèi)，分生孢子萌發(fā)率隨溫度升高而升高；當溫度為28℃時，分生孢子萌發(fā)率最高，可達97%；在28～35℃范圍內(nèi)，分生孢子萌發(fā)率隨溫度升高而降低；溫度高于35℃時，分生孢子不能萌發(fā)（圖8）。

2.5.3pH對菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的影響在pH為3～10時病原菌菌絲均可生長，菌絲適宜生長pH為5～8，且各pH下菌絲生長速率無顯著差異，當pH為5時，菌落生長速度最快，直徑達7.14cm，pH為11時，菌落停止生長（圖9）。因此偏酸性生長條件更適合該病原菌生長。

分生孢子在pH為3～11時均能萌發(fā)。當pH≤2時，孢子不能萌發(fā)；pH為2～6時，隨著pH的增大孢子萌發(fā)率逐漸增高；pH為6時，分生孢子萌發(fā)率達到最大，可達99%；pH為6～11時，隨著pH的增大孢子萌發(fā)率逐漸降低（圖9）。結(jié)果表明弱酸性至中性的條件更適合孢子的萌發(fā)。

2.5.4光照對病原菌菌絲生長的影響在24h光照條件下菌落生長速度最快，菌落直徑為7.20cm；光暗交替次之，菌落直徑為6.86cm；24h黑暗條件下菌落生長速度最慢，菌落直徑為6.51cm（圖10）。由此可見，光照有利于菌絲的生長。

3討論

MARARACHCHIKUMBURA等[17]通過形態(tài)學和多基因分析將類擬盤多毛孢真菌分為Pestalotiopsis、Neopestalotiopsis和Pseudopestalotiopsis三個不同屬，Neopestalotiopsis與其他2個屬的主要區(qū)別是中間3個有色胞異色，然而，通過形態(tài)學特征無法準確鑒定病原菌，需要結(jié)合ITS、TUB和TEF多個核苷酸序列建樹將病原菌進行準確分類。本研究通過病害田間癥狀觀察、致病性測定、病原菌形態(tài)學及分子生物學鑒定，將引起檳榔葉斑病的病原菌鑒定為N.sonneratae。由N.sonneratae引起植物病害的報道較少，目前僅有在杯萼海桑（Sonneratiaalba）的葉片上引起葉斑病的報道[18]。本研究中病原菌株的分生孢子長度和寬度小于NORPHANPHOUN等[18]的研究結(jié)果；而且本研究中頂端附屬絲只有2～3根，NORPHANPHOUN等[18]的研究有1～3根；但本研究中分生孢子的頂端附屬絲和基部附屬絲的長度均長于NORPHANPHOUN等[18]的研究結(jié)果。二者的分生孢子大小、頂端附屬絲和基部附屬絲的長度及頂端附屬絲的數(shù)量存在差異，其原因可能是寄主和采集地不同，導致病原菌的分生孢子形態(tài)產(chǎn)生差異。

研究N.sonneratae真菌的生物學特性，對于該病原菌的田間防治策略的制定、藥劑對真菌靶向抑制機理的研究及殺菌劑對該病原菌的抑制效果及作用機制的研究等有著重要的意義。本研究表明，該病原菌菌絲生長的溫度范圍廣，在10～35℃下菌絲均能生長，最適生長溫度為28℃，菌絲生長適宜pH為5～8，最適pH為5；分生孢子萌發(fā)的適宜溫度為20～32℃，在28℃時，分生孢子萌發(fā)率最高，分生孢子萌發(fā)的適宜pH為4～8，最適pH為6；光照條件有利于病原菌菌絲的生長。通過生物學特性研究可知，病原菌的生長和分生孢子萌發(fā)的適宜pH均在5～8之間，高溫高濕、強光照有利于該病的發(fā)生及傳播，此外，夏季高溫是引起檳榔病害的一個主要原因，因此，在種植檳榔時，可以適當調(diào)整土壤的pH，選擇靠近水源的區(qū)域，并留有適當?shù)臉淠颈邮a，減少因高溫引起的日灼，以減輕病原菌的侵入。另外，長期施用單一農(nóng)藥也會引起病原菌產(chǎn)生耐藥性，所以在化學防治時，要注意根據(jù)田間實際情況混用或交替使用或不使用農(nóng)藥，才能取得最佳的防治效果。本研究明確了N.sonneratae菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的最適條件，有利于認識該病害的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，為防治檳榔葉斑病提供一定的理論依據(jù)。