流式細(xì)胞儀檢測香花油茶、越南油茶基因組大小方法的建立及應(yīng)用

吳方圓 蔡婭 郝丙青 賈艷霞 葉航 張照遠(yuǎn) 馬錦林

關(guān)鍵詞：油茶；基因組大?。涣魇郊?xì)胞儀

油茶（Camelliaoleifera）是世界四大木本食用油料植物、我國四大木本油料植物、我國最重要的食用油料樹種。經(jīng)濟(jì)價值高、用途廣、綜合開發(fā)范圍廣、利用潛力大，被農(nóng)戶稱為“鐵桿莊稼”“綠色油庫”。發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)，對于緩解我國耕地資源剛性不足，保障食用植物油供給安全，優(yōu)化食用植物油結(jié)構(gòu)，促進(jìn)國民健康和推進(jìn)丘陵山區(qū)農(nóng)民精準(zhǔn)扶貧等都具有非常重要的意義。油茶產(chǎn)業(yè)受到國家和各級地方政府的高度重視，正處于快速發(fā)展期。2022年中央一號文件中明確提出“支持?jǐn)U大油茶種植面積，改造提升低產(chǎn)林”。作為我國油茶三大主產(chǎn)區(qū)的廣西，油茶是廣西九大農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)和五大林業(yè)優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)之一，是長期鞏固精準(zhǔn)脫貧成效的壓艙石。廣西實(shí)施千萬畝油茶、千億元產(chǎn)業(yè)的“雙千計劃”，根據(jù)廣西壯族自治區(qū)林業(yè)局統(tǒng)計資料，截至2021年底，全區(qū)油茶種植面積達(dá)57.07萬hm2。

廣西長期以來以普通油茶岑軟2號、岑軟3號等品種為主，種植品種較為單一。廣西擁有豐富的油茶特色種質(zhì)資源[1]，其中香花油茶和越南油茶是廣西地區(qū)今后大力發(fā)展的油茶物種。廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院自2005年開始香花油茶選育的研究，獲得160多份優(yōu)良種質(zhì)。近年來香花油茶生長快、適應(yīng)性抗逆性強(qiáng)、結(jié)果多等優(yōu)良特性得到廣大種植戶、企事業(yè)單位的認(rèn)可，正在大力推廣中。越南油茶是南亞熱帶分布的重要物種，研究相對薄弱，經(jīng)過十多年的研究獲得30多份優(yōu)良種質(zhì)，其大果特性適合應(yīng)對今后勞動力短缺價格昂貴、摘果費(fèi)時費(fèi)力等生產(chǎn)實(shí)際問題。目前這些優(yōu)良品系均保存在廣西國家油茶種質(zhì)資源庫中，圍繞這些種質(zhì)已開展新品種良種審（認(rèn)）定工作，截至2022年9月，獲得香花油茶新品種10個、良種6個，越南油茶新品種3個；已開展雜交育種、家系繁育工作，已開展植物學(xué)性狀、經(jīng)濟(jì)性狀及少量分子標(biāo)記等方面多樣性研究，但關(guān)于基因組大小遺傳多樣性方面的研究尚未開展。檢測其基因組大小，為今后基因組測序模式種質(zhì)篩選提供方便，為今后分子研究提供鋪墊，有助于初步推測其倍性及物種間自然雜交可能性，為今后多倍體授粉可配性研究、多倍體種質(zhì)創(chuàng)制提供基礎(chǔ)，以減少育種的工作量及盲目性。開展基因組大小多樣性方面的研究，有助于克服環(huán)境帶來的表型差異影響，從遺傳物質(zhì)的角度更深一步篩選特異種質(zhì)。

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測定薔薇、茉莉花、山竹、甘蔗、火龍果、葡萄、棗、蘿芙木、橡膠、柳樹、桑樹、茶樹等植物構(gòu)建的流式細(xì)胞術(shù)基因組大小檢測技術(shù)體系均不盡相同[2-5]。龔倩穎[6]針對海南油茶分別以根、葉片、花瓣3個部位的材料進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以花瓣為材料獲得的效果最好，嫩葉次之，以扦插苗的根為材料很難得到理想的結(jié)果，以成熟葉片為材料在加入染色劑后出現(xiàn)嚴(yán)重褐化現(xiàn)象，容易堵塞儀器，致使試驗(yàn)無法進(jìn)行；楊曉蘭等[7]針對江西15個油茶品種用水稻（389Mb）為內(nèi)標(biāo)，從常規(guī)Gal、WPB、Tris-MgCl2、OTTO等4種解離液中篩選出適合油茶的流式細(xì)胞術(shù)的解離液為改良的OTTO。由于試材種類狀態(tài)、試驗(yàn)平臺條件、試驗(yàn)人員技術(shù)操作水平與測定結(jié)果準(zhǔn)確性要求程度等方面的不同，各地科技人員都在因地制宜構(gòu)建適合的流式細(xì)胞術(shù)基因組大小檢測技術(shù)體系。

基因組大小是指生物體的單倍體基因組所含的DNA含量[8]。流式細(xì)胞術(shù)可以用來測定植物DNA的絕對含量，是近年發(fā)展起來的測定方法，通過比較熒光強(qiáng)度，從而計算出待測樣品DNA含量。該方法不受植物體取材部位和細(xì)胞所處時期限制，取材部位可以是葉片、莖、根、花、果皮、種子等。特別是在離體培養(yǎng)過程中，植株或芽很小和很嫩時，此方法僅用1cm2的樣品就很容易決定其材料倍性。該方法簡便快速易行，檢測結(jié)果較為準(zhǔn)確穩(wěn)定可靠[9]。流式細(xì)胞術(shù)也存在一定的缺陷，流式細(xì)胞儀設(shè)備較昂貴，并且維護(hù)人員需較高的專業(yè)水平進(jìn)行復(fù)雜的儀器操作和樣品前處理，限制了其在植物領(lǐng)域中的應(yīng)用。其原理為：有絲分裂中期細(xì)胞去細(xì)胞壁后制成特異性熒光染色的核懸浮液，作為樣品加入到流式細(xì)胞儀并形成狹窄的液流高速通過光學(xué)檢測系統(tǒng)的高強(qiáng)度光束，已染色的染色體產(chǎn)生的熒光被量化，進(jìn)而根據(jù)相對熒光強(qiáng)度經(jīng)儀器附設(shè)計算機(jī)自動統(tǒng)計，根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果計算DNA含量[10]。碘化丙啶是一種熒光染料，能均勻嵌入到雙鏈核酸堿基對中，因此可以對DNA進(jìn)行特異性染色[11]。在488nm激發(fā)光下，碘化丙啶發(fā)出的熒光可被流式細(xì)胞儀檢測。并且碘化丙啶在著色過程中的嵌入量與DNA量呈正比關(guān)系，故熒光強(qiáng)度可以表示出基因組DNA的相對含量[12]。觀察待測樣品和內(nèi)參碘化丙啶-DNA復(fù)合體的熒光峰值，即可得出2種植物DNA含量的比值，再乘以內(nèi)參植物的基因組大小，即可計算出待測植物的基因組大小。即計算公式：待測樣品DNA含量=內(nèi)參DNA含量×待測樣品的熒光強(qiáng)度/內(nèi)參樣品的熒光強(qiáng)度[13]。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料選用香花油茶良種義祿及越南油茶優(yōu)良品系鴻鴣23，組織部位選擇嫩葉、成葉、根尖組織進(jìn)行試驗(yàn)。內(nèi)參植物為番茄（0.92Gb）、玉米（2.30Gb）、豌豆（4.45Gb），以種子萌發(fā)后1個月的嫩葉為試驗(yàn)材料，其種子取自中國科學(xué)院昆明植物研究所。

1.2方法

1.2.1基于香花油茶、越南油茶為試材的流式細(xì)胞術(shù)基因組大小檢測技術(shù)體系構(gòu)建針對檢測中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，分別研究解離液種類、內(nèi)參植物、試驗(yàn)材料組織部位對檢測效果的影響，每個處理重復(fù)3次。選取4種常見的解離液WPB、Tris-MgCl2、OTTO、mGb，具體配方見表1。

1.2.2香花油茶、越南油茶優(yōu)良品系基因組大小檢測基于香花油茶、越南油茶為試材構(gòu)建的流式細(xì)胞術(shù)基因組大小檢測技術(shù)體系：解離液為改良后的mGb解離液；內(nèi)參植物豌豆為優(yōu)先，若出現(xiàn)重峰時，以玉米為內(nèi)參；試驗(yàn)材料組織部位為嫩葉。采用以上技術(shù)體系，以香花油茶、越南油茶優(yōu)良品系為試材，檢測其基因組大小。

（1）細(xì)胞懸浮液制備。將樣品置于0.8mL預(yù)冷的mGb解離液中，用鋒利的刀片將組織迅速垂直切碎，使其在解離液中冰上靜置10min，將制備好的細(xì)胞核懸液用300目尼龍網(wǎng)過濾至5mL聚苯乙烯無帽圓底未滅菌流式管，即得到細(xì)胞核懸浮液。

（2）DNA特異性染色。在細(xì)胞核懸液加入預(yù)冷的碘化丙啶和RNAase溶液，置于冰上避光染色0.5～1.0h。碘化丙啶染液和RNAase溶液的工作濃度均為50μg/mL。

（3）流式細(xì)胞儀檢測。以豌豆為內(nèi)參（當(dāng)出現(xiàn)重峰時，內(nèi)參替換為玉米），將待測樣品的懸液和內(nèi)參樣品的懸液混合。利用美國BectonDickinson公司生產(chǎn)的FACScalibur流式細(xì)胞儀對染色后的細(xì)胞核懸浮液樣品上機(jī)檢測，設(shè)置參數(shù)碘化丙啶激發(fā)波長為488nm藍(lán)光，上機(jī)后收集通道FL2的熒光、檢測碘化丙啶發(fā)射的熒光強(qiáng)度，每次檢測收集10000個顆粒。收集數(shù)據(jù)使用Modifit3.0分析軟件作圖分析，變異系數(shù)控制在5%以內(nèi)。

（4）基因組大小計算。根據(jù)公式：待測樣品DNA含量=內(nèi)參DNA含量×待測樣品的熒光強(qiáng)度/內(nèi)參樣品的熒光強(qiáng)度，計算待測樣品的基因組大小值。

2結(jié)果與分析

2.1基于香花油茶、越南油茶為試材的流式細(xì)胞術(shù)基因組大小檢測技術(shù)體系構(gòu)建

2.1.1不同解離液對出峰的影響流式細(xì)胞儀之所以可以準(zhǔn)確檢測植株倍性的關(guān)鍵是用適宜的細(xì)胞核解離液制備擁有單個的、完整的細(xì)胞核懸浮液[14]。目前雖然有多種提取細(xì)胞核的解離液，但不同植株因遺傳基礎(chǔ)不同，導(dǎo)致在組織和結(jié)構(gòu)成分、含量等方面均有差異，因此降解各種成分所需的化學(xué)物質(zhì)含量也不同，至今還未發(fā)現(xiàn)適合于所有物種的通用提取液[15]。

為篩選適用于香花油茶、越南油茶基因組大小測定的最佳解離液，選取香花油茶和越南油茶的幼嫩葉片為試材，應(yīng)用6種常用解離液來解離細(xì)胞核。如圖1所示，WPB和mGb這2種解離液主峰清晰、主雜峰分離程度高且mGb解離液的效果最佳。但是，由于標(biāo)準(zhǔn)的mGb解離液中加入了高濃度的β-巰基乙醇，而β-巰基乙醇對人體的呼吸系統(tǒng)有強(qiáng)烈刺激并有接觸性毒性，二硫蘇糖醇和巰基乙醇相比，作用相似，但二硫蘇糖醇的刺激性氣味要小很多，毒性也比巰基乙醇低很多。β-巰基乙醇作為還原劑的主要作用是保護(hù)染色質(zhì)蛋白，消除酚類化合物對DNA染色的影響。發(fā)現(xiàn)去掉二硫蘇糖醇替代標(biāo)準(zhǔn)mGb中的β-巰基乙醇并不影響細(xì)胞核解離效果，因此在后期實(shí)驗(yàn)中均選擇改良后的mGb解離液。

2.1.2不同內(nèi)參對待測植物基因組大小的影響

目前雖然有研究證明許多組織可用于流式細(xì)胞儀檢測，但是相比其他材料，葉片組織不僅可以產(chǎn)生較好的試驗(yàn)效果，而且取材容易、成本較低、耗時短，因此在流式細(xì)胞儀選材中，葉片被廣泛使用。本研究中選用成葉為材料，以番茄、玉米、豌豆3種植物作為內(nèi)參。

內(nèi)參應(yīng)滿足以下3個條件：（1）內(nèi)參DNA含量同待測樣品DNA含量相近，從而降低儀器非線性引起的誤差風(fēng)險，減少零位偏移；（2）參照樣本峰不能與目標(biāo)樣本峰重疊，最好也不能與目標(biāo)樣本的G2或M期峰值重疊[15]；（3）內(nèi)參植物的DNA含量均已知且穩(wěn)定。從圖2可以看出，以此3種植物為內(nèi)參也均未出現(xiàn)重峰現(xiàn)象，獲得較好的細(xì)胞峰出峰效果，但是相較而言豌豆同目標(biāo)樣本的DNA含量最為相近。

由表2可知，以玉米和豌豆為內(nèi)參計算的樣品基因組大小接近，在誤差范圍內(nèi)，說明這2種內(nèi)參均比較合適。但是以番茄為內(nèi)參的測定結(jié)果顯著小于其他2種內(nèi)參的測定結(jié)果，可能是因?yàn)榉训幕蚪M與待測樣品的基因組大小相差較遠(yuǎn)，所以造成的誤差更大。因此在后續(xù)試驗(yàn)中選擇以豌豆為內(nèi)參來計算其他待測植物的基因組大小。

2.1.3不同組織部位對待測植物基因組大小的影響流式細(xì)胞儀對植物材料也有嚴(yán)格要求，選取的材料太老或者太嫩時，會影響峰值的形成。材料的選擇是用流式細(xì)胞儀測定基因組大小成功的首要因素。在本研究中分別使用植株的嫩葉、成葉和根尖來驗(yàn)證不同組織器官對基因組大小檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。從圖3可以看出，以主峰清晰程度、主雜峰分離程度、細(xì)胞碎片多少等方面綜合考慮，無論是香花油茶還是越南油茶，細(xì)胞峰出峰效果：嫩葉優(yōu)于根尖優(yōu)于成葉。

由表3可知，所選用的3種植物材料中嫩葉的變異系數(shù)均小于5，而成葉和根尖的變異系數(shù)大于5，說明嫩葉效果最佳；另外，發(fā)現(xiàn)成葉中的基因組大小顯著小于嫩葉和根；香花油茶嫩葉和根尖的檢測結(jié)果接近，而越南油茶根尖測定結(jié)果顯著大于葉片。在后續(xù)試驗(yàn)中選擇以嫩葉為材料來開展流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)。

2.2香花油茶、越南油茶優(yōu)良品系基因組大小檢測

采用基于香花油茶良種義祿、越南油茶優(yōu)良品系鴻鴣23為試材構(gòu)建的流式細(xì)胞術(shù)基因組大小檢測技術(shù)體系測定香花油茶、越南油茶優(yōu)良品系山茶屬植物基因組大小時，其細(xì)胞峰出峰穩(wěn)定情況、峰形、CV值等均較好，但在測定表4中香花油茶1號、45號優(yōu)良品系，由于待測樣品與內(nèi)參基因組大小接近出現(xiàn)重峰的情況，因此將內(nèi)參替換為玉米。

由表4可知，1～45號來自于香花油茶優(yōu)良品系，基因組大小在5.12～9.31Gb之間變化，均值為7.60Gb。1～38號來自于香花油茶優(yōu)樹選育，其中1～36號及38號基因組大小在7.07～8.56Gb之間變化，均值為7.72Gb，1號基因組大小為5.12Gb，明顯低于其他品系基因組大小；37號基因組大小為9.31Gb，明顯高于其他品系基因組大小。39～45號均來自于香花油茶優(yōu)樹家系，其中39～44號基因組大小在6.32～8.94Gb之間變化，均值為7.66Gb，45號基因組大小為5.14Gb，明顯低于其他品系基因組大小。46～51號來自于越南油茶優(yōu)樹選育，其基因組大小在9.17～9.85Gb之間變化，均值為9.47Gb，與絕大多數(shù)的香花油茶優(yōu)良品系相比，在基因組大小上存在數(shù)量級的明顯差異。1號、37號、45號種質(zhì)在基因組大小分布上存在極端性，日常觀察中發(fā)現(xiàn)1號、37號、45號品系在種質(zhì)長勢形態(tài)上存在明顯的特異性，由此可推斷其長勢形態(tài)上的差異并非是環(huán)境的影響而是遺傳基礎(chǔ)不同造成的，推測其存在倍性差異或其親本間存在種間雜交。

3結(jié)論與討論

以香花油茶、越南油茶為研究對象，針對檢測中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，分別研究解離液種類、內(nèi)參植物、試驗(yàn)材料組織部位對檢測效果的影響，以細(xì)胞核解離情況、次生代謝物質(zhì)降解情況、細(xì)胞峰出峰穩(wěn)定情況、主峰清晰程度、主雜峰分離程度、取材容易程度、內(nèi)參與待測樣品基因組大小差異情況、基因組大小測定準(zhǔn)確性及變異系數(shù)等方面為評價指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)4種常見的解離液WPB、Tris-MgCl2、OTTO、mGb中WPB、mGb解離效果較好，內(nèi)參植物以豌豆或玉米為佳，試驗(yàn)材料組織部位以嫩葉或者根尖為宜。綜合各方面情況，最佳體系參數(shù)設(shè)置為：解離液為改良后的mGb解離液；內(nèi)參植物豌豆為優(yōu)先，若出現(xiàn)重峰時，以玉米為內(nèi)參；試驗(yàn)材料組織部位為嫩葉。香花油茶優(yōu)良品系基因組大小在5.12～9.31Gb之間變化，均值為7.60Gb，1號、37號、45號種質(zhì)在基因組大小分布上存在極端性，推測其存在倍性差異或其親本間存在種間雜交；越南油茶優(yōu)良品系基因組大小在9.17～9.85Gb之間變化，均值為9.47Gb。香花油茶與越南油茶優(yōu)良品系群體間在基因組大小上存在明顯差異，推測其物種間存在倍性差異。

在基因組大小體系構(gòu)建摸索過程中發(fā)現(xiàn)，任何一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)的改變，都可能會造成流式細(xì)胞術(shù)測定基因組大小的改變，比如無論是香花油茶義祿還是越南油茶鴻鴣23，均以成葉為試材，以改良后的mGb溶液為解離液，選用不同內(nèi)參得到的基因組大小存在差異。任何一個小環(huán)節(jié)的改變，都可能會造成基因組大小的輕微改變。比如在內(nèi)參也相同的情況下，選擇不同成熟度的成葉也會造成基因組大小檢測結(jié)果的不同。在取材時選擇相同成熟度的成葉，但材料來源于母樹還是后期繁育的無性系幼苗，也會造成差異。離體保存不同時間下的測定結(jié)果也不盡相同。其造成差異的原因來自于多方面，有可能是因?yàn)樽陨頂y帶次生代謝物質(zhì)差異造成，也有可能是自身材料狀態(tài)差異造成，也有可能是細(xì)胞群人為選取范圍主觀性差異。因此種質(zhì)間基因組大小未產(chǎn)生明顯差異時，二者應(yīng)盡可能置于同等的流式細(xì)胞術(shù)基因組大小檢測技術(shù)體系下方可比較基因組大小。由此可說明，本研究中優(yōu)良品系間基因組大小具有可比性。

但值得慶幸的是，在關(guān)鍵環(huán)節(jié)等同的條件下大多數(shù)測定基因組大小變化不大，而流式細(xì)胞術(shù)只是用于估測基因組大小的大概值，微小的差異對測定結(jié)果的應(yīng)用意義影響較小。要想準(zhǔn)確得知一份種質(zhì)的基因組大小，還是需要測序技術(shù)才得以實(shí)現(xiàn)。然而基因組測序費(fèi)用昂貴，在油茶方面應(yīng)用技術(shù)并不成熟，不適宜針對每一份種質(zhì)開展。