超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定葵花籽中4種交鏈孢霉毒素的含量

畢 珊,吳玉田,楊紹群,劉貴榮,王穎怡,趙正雨

(貴州省疾病預(yù)防控制中心,貴陽 550004)

交鏈孢霉又稱鏈格孢霉菌,普遍分布于自然界中,是一種極為常見的腐生菌和植物病原菌[1-2],其產(chǎn)生的毒素種類達70 余種,主要包括交鏈孢酚(AOH)、交鏈孢酚單甲醚(AME)、細交鏈孢菌酮酸(TeA)和騰毒素(TEN)[3-4]。交鏈孢霉毒素對人體具有一定的致癌、致畸等慢性或急性毒性作用,如果多種交鏈孢霉毒素同時存在可產(chǎn)生協(xié)同作用,導(dǎo)致毒性增強[5-6]。葵花籽是備受歡迎的大眾休閑食品,亦可作為食用油原料?？ㄗ言趦Σ剡^程中會出現(xiàn)發(fā)熱、發(fā)霉、變質(zhì)等現(xiàn)象,易受到交鏈孢霉毒素的污染,其營養(yǎng)價值大大降低甚至?xí)θ梭w造成傷害。因此,監(jiān)測葵花籽中交鏈孢霉毒素的含量具有重要意義。

近年來,國內(nèi)外已有較多關(guān)于食品中交鏈孢霉毒素檢測技術(shù)方面的文獻報道[7-13],其中高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法由于具有靈敏度高、定性準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的特點,已經(jīng)成為主流方法,但我國尚未建立食品中交鏈孢霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn),同時也鮮有關(guān)于測定葵花籽中交鏈孢霉毒素含量的報道。本工作針對葵花籽基質(zhì)樣品,提出了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)測定葵花籽中交鏈孢霉毒素含量的方法,并用于實際樣品檢測,以期了解葵花籽中交鏈孢霉毒素污染狀況,同時為葵花籽中交鏈孢霉毒素標(biāo)準(zhǔn)方法的研究開發(fā)提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

SCIEX QTRAP 6500＋型超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀;MPW-352R 型高速冷凍離心機;TTC-DC11型氮吹儀;Milli-Q 型超純水機;Waters Oasis HLB固相萃取柱。

單標(biāo)準(zhǔn)溶液:100.0 mg·L－1,準(zhǔn)確稱取1.0 mg AOH、AME、TeA、TEN 標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解、稀釋,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成質(zhì)量濃度均為100.0 mg·L－1的單標(biāo)準(zhǔn)溶液。同法制備交鏈孢酚-d2(AOH-d2)、交鏈孢酚單甲醚-d3(AME-d3)、細交鏈孢菌酮酸-d13(TeA-d13)、滕毒素-d3(TEN-d3)的單內(nèi)標(biāo)溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:移取適量的單標(biāo)準(zhǔn)溶液,用甲醇逐級稀釋,配制成AME質(zhì)量濃度為10.0μg·L－1、TEN 和AOH 質(zhì)量濃度為100.0μg·L－1、TeA 質(zhì)量濃度為500.0μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

混合內(nèi)標(biāo)溶液:移取適量的單內(nèi)標(biāo)溶液,用甲醇逐級稀釋,配制成AME-d3質(zhì)量濃度為100.0μg·L－1、TEN-d3和 AOH-d2的質(zhì)量濃度為1 000.0μg·L－1、TeA-d13的質(zhì)量濃度為5 000.0μg·L－1的混合內(nèi)標(biāo)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)品:AOH,10 mg/瓶;AME,10 mg/瓶;TeA,10 mg/瓶;TEN,1 mg/瓶;AOH-d2,1 mg/瓶;AME-d3,1 mg/瓶;TeA-d13,1 mg/瓶;TEN-d3,0.25 mg/瓶。

乙腈、甲醇均為色譜純;其他試劑均為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100.0 mm×2.1 mm,1.7μm);柱溫40 ℃;進樣體積3.0 μL;流量0.2 mL·min－1;流動相A 為1.0 mmol·L－1碳酸氫銨溶液,B 為甲醇。梯度洗脫程序:0～2.0 min時,B為5%;2.0～4.0 min時,B由5%升至90%,保持2.0 min;6.0～6.5 min時,B由90%降至5%,保持3.5 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子(ESI)源,負離子(ESI－)掃描模式;噴霧電壓4 500 V;離子源溫度500 ℃;霧化氣1壓力0.4 MPa,霧化氣2 壓力0.4 MPa,氣簾氣壓力0.2 MPa,碰撞氣壓力0.1 MPa;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“*”代表定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

用高速粉碎機粉碎葵花籽樣品,取2.5 g,置于50 mL聚丙烯刻度離心管中,加入500.0μL混合內(nèi)標(biāo)溶液,混勻,放置過夜,加入25.0 mL 體積比為45∶10∶45的乙腈-甲醇-0.05 mol·L－1磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0)混合液,以轉(zhuǎn)速2 500 r·min－1振蕩提取10 min,以轉(zhuǎn)速10 000 r·min－1離心10 min,轉(zhuǎn)移上清液,并用水定容至30.0 mL,搖勻。取6.0 mL提取液,加入15.0 mL 0.05 mol·L－1磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0),搖勻,過Waters Oasis HLB固相萃取柱(預(yù)先用5.0 mL甲醇和5.0 mL水活化),用20%(體積分數(shù))甲醇溶液淋洗,抽干固相萃取柱,用10 mL體積比為1∶1的含1%(體積分數(shù),下同)氨水的甲醇-乙腈混合液進行洗脫,收集洗脫液,在水浴40 ℃下氮吹至近干,殘渣用200.0μL甲醇復(fù)溶,并用水定容至2.0 mL,渦旋后按照儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

4種交鏈孢霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和實際葵花籽樣品的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms

2.2 固相萃取柱的選擇

Waters Oasis HLB固相萃取柱是一種適用于酸性、中性和堿性化合物的通用性凈化小柱,其良好的化學(xué)穩(wěn)定性、高而穩(wěn)定的回收率備受研究者的青睞。為驗證Waters Oasis HLB固相萃取柱在葵花籽基質(zhì)凈化中的應(yīng)用優(yōu)勢,采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方式,在相同加標(biāo)量(AME 的質(zhì)量分數(shù)為2.0μg·kg－1,AOH 和TEN 的質(zhì)量分數(shù)為20.0μg·kg－1,TeA 的質(zhì)量分數(shù)為100.0μg·kg－1)條件下制備6個平行樣,將Waters Oasis HLB柱(簡稱HLB柱)與實驗室常用的Hypersep Retain PEP柱(簡稱PEP柱)、Hypersep C18柱(簡稱C18柱)的凈化效果進行對比(除不加混合內(nèi)標(biāo)溶液外,樣品提取與凈化同1.3節(jié))。

3種固相萃取柱凈化下葵花籽基質(zhì)樣品中4種交鏈孢霉毒素的回收率結(jié)果見圖2。

圖2 3種固相萃取柱凈化下目標(biāo)物的回收率Fig.2 Recovery of targets purified by three solid phase extraction columns

由圖2可知:固相萃取柱凈化下葵花籽基質(zhì)樣品中4種交鏈孢霉毒素的回收率為46.3%～114%,HLB柱對葵花籽基質(zhì)樣品中目標(biāo)物的回收率最好,其次是PEP柱、C18柱。原因在于HLB柱的吸附劑是水脂平衡的水可浸潤的反相吸附劑,由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物,其吸附容量較高,吸附性較強,與C18柱鍵合了硅膠相比,吸附劑的表面積增大2～3倍,凈化效果較好;PEP 柱采用高純度、高滲透率的苯乙烯二乙烯基聚合物,鍵合脲功能團使它對極性和非極性分析物均有保留,其表面同時具有親水性和憎水性基團,吸附能力也遠高于C18柱,4種毒素在PEP柱上仍有較好的回收率;C18柱鍵合硅膠,適用于高保留性烷基鍵合相化合物,吸附能力弱,對含油脂的葵花籽基質(zhì)中目標(biāo)物的保留能力較差,且雜質(zhì)干擾較大,不建議在含油性基質(zhì)的凈化過程中使用。因此,試驗選擇Waters Oasis HLB固相萃取柱為凈化柱。

2.3 洗脫劑的選擇

保證其他條件不變,試驗考察了不同洗脫劑(5.0 mL甲醇＋5.0 mL乙腈、10 mL體積比為1∶1的含1%氨水的甲醇-乙腈混合液)的洗脫效果。結(jié)果顯示:使用兩種洗脫劑時,目標(biāo)物的回收率無太大差別,但洗脫劑中有氨水時目標(biāo)物峰形更為尖銳、信號更強,同時基線也更平滑。因此,試驗選擇10 mL體積比為1∶1的含1%氨水的甲醇-乙腈混合液作為洗脫劑。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定下限

取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0,20,50,100,200,400,800,1 000μL置于不同的10 mL容量瓶中,均加入適量的混合內(nèi)標(biāo)溶液,依次加入甲醇500,480,450,400,300,100,0,0μL,用水定容,配制成AME 的質(zhì)量濃度分別為0,0.02,0.05,0.10,0.20,0.40,0.80,1.00μg·L－1,TEN 和AOH 的質(zhì)量濃度分別為0,0.20,0.50,1.00,2.00,4.00,8.00,10.0μg·L－1,TeA 的質(zhì)量濃度分別為0,1.00,2.50,5.00,10.0,20.0,40.0,50.0μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,其中同位素內(nèi)標(biāo)TeA-d13的質(zhì)量濃度均為25.0μg·L－1,AOH-d2和 TEN-d3的質(zhì)量濃度均為5.00μg·L－1,AME-d3的質(zhì)量濃度均為0.50μg·L－1。按照儀器工作條件測定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以峰面積與各自內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 線性參數(shù)和測定下限Tab.2 Linearity parameters and lower limits of determination

以10倍信噪比(S/N)計算測定下限(10S/N),結(jié)果見表2。

2.5 精密度試驗

隨機選取3份陽性樣品,每份樣品制備7組平行樣,按照試驗方法測定,計算測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗結(jié)果(n＝7)Tab.3 Results of test for precision(n＝7)

由表3 可知,各目標(biāo)物測定值的RSD 為3.9%～12%,表明方法重現(xiàn)性良好,該檢測方法的建立具有實際可操作性。

2.6 回收試驗

對空白葵花籽樣品進行低、中、高等3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗,每個濃度水平同時設(shè)計6組平行試驗,按照試驗方法進行測定,計算回收率和測定值的RSD,結(jié)果見表4。

表4 回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.4 Results of test for recovery(n＝6)

由表4可知,目標(biāo)物的回收率為75.0%～112%,測定值的RSD 為4.3%～12%,說明該方法的準(zhǔn)確度良好,并進一步驗證了方法的精密度良好。

2.7 樣品分析

隨機抽取市售散裝、袋裝葵花籽樣品19份,按照試驗方法測定4種交鏈孢霉毒素的含量,測定結(jié)果見表5。

表5 樣品分析結(jié)果Tab.5 Analytical results of the samples

由表5可知:AOH、AME、TeA 和TEN 檢出率分別為36.8%,52.6%,89.5%,84.2%。檢出率和檢出量最高的是TeA,平均值為1 890.16μg·kg－1,主要源于葵花籽在加工、運輸和儲藏期間發(fā)生霉變;TEN 的檢出率次之,平均值為20.26μg·kg－1。可見,葵花籽中4種交鏈孢霉毒素均有不同程度檢出,其中受TeA 毒素污染的風(fēng)險最大,其次是TEN。

本工作提出了UHPLC-MS/MS測定葵花籽中交鏈孢霉毒素含量的方法,同時對3種常見的固相萃取柱進行了對比,對洗脫劑進行了考察,采用內(nèi)標(biāo)法定量,提高了定量結(jié)果的準(zhǔn)確度。本方法具有操作簡便、準(zhǔn)確度好、靈敏度高等特點,適用于葵花籽中4種交鏈孢霉毒素含量的測定。對實際樣品檢測時發(fā)現(xiàn),葵花籽中4種交鏈孢霉毒素的暴露水平高,污染情況嚴重,其中,TeA 和TEN 檢出率高,且以TeA 污染情況最為嚴重。若經(jīng)常食用受毒素污染的葵花籽或葵花籽油會對人體健康造成一定影響,相關(guān)部門應(yīng)加強對交鏈孢霉毒素污染水平的監(jiān)測與調(diào)查,保障人民的身體健康,同時為制定國家標(biāo)準(zhǔn)提供相關(guān)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。