補(bǔ)陽(yáng)還五湯調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路對(duì)2型糖尿病大鼠糖脂代謝的影響

林莉嫻 龍邦盛 王寶愛(ài)

(1.海南省海口市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)五科,海南 ?？?570000;2.海南省?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,海南 ?？?570000;3.海南省?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院內(nèi)一科,海南 ?？?570000)

糖尿病是一種以高血糖、胰島素分泌障礙或其生物作用受損為主要臨床表現(xiàn)的進(jìn)展性疾病,2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是其最常見的類型,占所有糖尿病的90%以上[1-3]。抑制肝臟異常糖異生是治療該病的關(guān)鍵所在[4]。T2DM屬中醫(yī)學(xué)消渴范疇,病機(jī)為氣陰兩虛、血行瘀滯等,以益氣活血治療。補(bǔ)陽(yáng)還五湯有效成分是芍藥苷、黃芪甲苷等,具有益氣養(yǎng)血、活血通絡(luò)的作用[5]。該方有改善高血糖、高血脂、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[6],但其機(jī)制并未確定。有研究認(rèn)為,絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路在糖脂代謝異常中有重要作用,可作為糖脂代謝異常人工干預(yù)及藥物研發(fā)的新方向[7-8]。但補(bǔ)陽(yáng)還五湯是否可通過(guò)調(diào)控該通路對(duì)T2DM大鼠產(chǎn)生作用,還不明確。因此,本研究通過(guò)T2DM大鼠模型,探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯調(diào)控MAPK通路改善糖脂代謝的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選取60只Wistar雄性大鼠,體質(zhì)量(180±20) g,飼養(yǎng)于無(wú)菌環(huán)境中,溫度27 ℃左右;濕度55%左右,自由進(jìn)食,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組,即空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中、高劑量組,每組10只。

1.1.2 藥物制備 補(bǔ)陽(yáng)還五湯(藥物組成:黃芪120 g,當(dāng)歸6 g,赤芍5 g,川芎3 g,紅花3 g,桃仁3 g,地龍3 g)所需藥材均購(gòu)自湖北省中藥材公司,以上藥材均為顆粒劑,各1袋溶于溫水(30～40 ℃)11.3 mL中,配制成質(zhì)量濃度約為12.8 g/mL(以顆粒劑總質(zhì)量計(jì))的藥液,再用溫水分別稀釋成1.6、3.2、6.4 g/mL藥液備用。二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20023371),稱取二甲雙胍片2 g并粉碎,用蒸餾水配成濃度為20 mg/mL的二甲雙胍混懸液,4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?用時(shí)室溫放置60 min,振搖使其混勻,每周配置1次。

1.1.3 儀器與試劑 磷酸鹽緩沖液(PBS,成都中仕石化有限公司),石蠟(瑞沃德生命科技有限公司),乙醇、0.9%氯化鈉注射液(南京化學(xué)試劑有限公司),空腹胰島素(FINS)、糖化血紅蛋白(HbA1c)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司),鏈脲佐菌素(STZ,美國(guó)Sigma公司),RNA提取液(Invitrogen TRIzol,Thermo公司),離心機(jī)(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),凝膠成像儀(上海無(wú)陌光學(xué)儀器有限公司),AT1303002型酶標(biāo)儀(上海元析儀器有限公司),實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司),電泳儀(北京六一儀器廠),組織勻漿機(jī)(深圳欣博盛生物科技有限公司),MAPK、磷酸化MAPK(p-MAPK)、β-actin抗體(美國(guó)Thermo Fisher公司),全自動(dòng)生化分析儀(上?？迫A生物工程股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及給藥 空白組予基礎(chǔ)飼料,其余大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)6周,禁食12 h,腹腔注射100 mg/kg的STZ試劑,然后繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)4周,剪尾采血,以連續(xù)2天空腹血糖(FPG)≥13.9 mmol/L為造模成功。造模成功后予藥物干預(yù),補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中、高劑量組分別給予1.6、3.2、6.4 g/kg生藥灌胃,陽(yáng)性對(duì)照組予二甲雙胍混懸液0.2 g/kg灌胃,空白組、模型組均予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃,每日1次,持續(xù)給藥12周。

1.2.2 記錄大鼠體質(zhì)量和生存狀態(tài) 于藥物干預(yù)第12周末次給藥后測(cè)定各組大鼠體質(zhì)量,上代謝籠監(jiān)測(cè)各組大鼠12 h的飲水量、攝食量和尿量。

1.2.3 測(cè)定大鼠血糖水平 于藥物干預(yù)第12周末次給藥后先對(duì)大鼠禁食12 h,末次給藥后抽取其尾靜脈血2 mL,檢測(cè)空腹血糖(FPG),采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)FINS、HbA1c。

1.2.4 測(cè)定大鼠血脂水平 于藥物干預(yù)第12周末次給藥后麻醉大鼠,抽取其腹主動(dòng)脈血,離心后于-20 ℃環(huán)境中保存,全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

1.2.5 蘇木素-伊紅染色(HE)觀察大鼠肝臟病理學(xué)組織 于藥物干預(yù)第12周末次給藥后麻醉大鼠,打開腹部暴露臟器,小心摘取肝臟,用0.9%氯化鈉注射液充分沖洗后再用多聚甲醛固定,脫水,待石蠟完全浸入組織塊后包埋,連續(xù)4 μm切片,進(jìn)行HE染色,放大200倍后觀察各組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化。

1.2.6 蛋白免疫印跡(western blot,WB)法檢測(cè)MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá) 肝臟組織勻漿后提取總蛋白,加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE,上海信裕生物科技有限公司)后進(jìn)行電泳,分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜用牛血清白蛋白(BSA,上海麥克林生化科技股份有限公司)封閉聚偏二氟乙烯膜(PVDF,碧云天生物有限公司)1 h,然后洗脫5 min,孵育一抗:加入MAPK、p-MAPK一抗,4 ℃冷室孵育過(guò)夜。洗膜后加入二抗孵育,再次搖動(dòng)洗滌,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng),然后浸入顯影液中顯色,最后凝膠成像,計(jì)算蛋白表達(dá)。

1.2.7 qRT-PCR檢測(cè)MAPK、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF21)mRNA表達(dá) 提取肝臟組織于勻漿器中,加入TRIzol試劑提取總RNA,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)說(shuō)明書要求,將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后再進(jìn)行擴(kuò)增,以β-actin為內(nèi)參,采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。見表1。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、飲水量、攝食量和尿量比較 與空白組比較,模型組大鼠體質(zhì)量降低(P<0.05),12 h飲水量、攝食量及尿量均升高(P<0.05);陽(yáng)性對(duì)照組及補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中、高劑量組體質(zhì)量均高于模型組(P<0.05),12 h飲水量、攝食量、尿量均低于模型組(P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較,補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組體質(zhì)量較低(P<0.05),補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組體質(zhì)量明顯較高(P<0.05);與陽(yáng)性對(duì)照組比較,補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中劑量組12 h飲水量、尿量較高(P<0.05);與陽(yáng)性對(duì)照組比較,補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組攝食量較高(P<0.05),補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組攝食量較低(P<0.05);與陽(yáng)性對(duì)照組比較,補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中劑量組尿量較高(P<0.05)。隨著補(bǔ)陽(yáng)還五湯劑量增加,大鼠體質(zhì)量呈遞增趨勢(shì),12 h飲水量及攝食量呈遞減趨勢(shì),且各組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);隨著補(bǔ)陽(yáng)還五湯劑量增加,大鼠尿量遞減(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量、飲水量、攝食量和尿量比較

2.2 各組大鼠FPG、FINS、HbA1c水平比較 與空白組比較,模型組FPG、FINS、HbA1c水平均升高(P<0.05);陽(yáng)性對(duì)照組及補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中、高劑量組FPG、FINS、HbA1c水平均低于模型組(P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較,補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組FPG、FINS、HbA1c水平均升高(P<0.05),補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組FINS、HbA1c水平均升高(P<0.05),補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組FINS水平降低(P<0.05)。隨著補(bǔ)陽(yáng)還五湯劑量增加,FINS、HbA1c、FPG水平均逐漸降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠FPG、FINS、HbA1c水平比較

2.3 各組大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較 與空白組比較,模型組TC、TG、LDL-C水平均升高(P<0.05),HDL-C水平降低(P<0.05);陽(yáng)性對(duì)照組及補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中、高劑量組TC、TG、LDL-C水平均低于模型組(P<0.05),HDL-C水平高于模型組(P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較,補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組TC、TG、LDL-C水平均升高(P<0.05),HDL-C水平降低(P<0.05)。與補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組比較,補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組TC水平降低(P<0.05),補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組TC、TG、LDL-C水平均降低(P<0.05),HDL-C水平升高(P<0.05);與補(bǔ)陽(yáng)還五湯中劑量組比較,補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組TG、LDL-C水平均降低(P<0.05),HDL-C水平升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較

2.4 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化 空白組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞狀態(tài)均無(wú)異常,排列整齊,脂質(zhì)染色無(wú)空泡;模型組大鼠肝臟組織出現(xiàn)明顯的病理改變:組織結(jié)構(gòu)紊亂,細(xì)胞形態(tài)異常,體積發(fā)生變化,出現(xiàn)脂質(zhì)空泡;陽(yáng)性對(duì)照組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組大鼠肝臟組織均在不同程度上有明顯改善,且高劑量組效果最顯著。見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化(HE,×200)

2.5 各組大鼠MAPK、p-MAPK蛋白表達(dá)比較 與空白組比較,模型組MAPK、p-MAPK蛋白表達(dá)降低(P<0.05);陽(yáng)性對(duì)照組及補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中、高劑量組MAPK、p-MAPK蛋白表達(dá)均高于模型組(P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較,補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中劑量組MAPK、p-MAPK蛋白表達(dá)降低(P<0.05),補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組MAPK、p-MAPK蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。隨著補(bǔ)陽(yáng)還五湯劑量增加,MAPK、p-MAPK蛋白表達(dá)均逐漸升高,兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5,圖2。

圖2 各組大鼠MAPK、p-MAPK蛋白表達(dá)比較

表5 各組大鼠MAPK、p-MAPK蛋白表達(dá)比較

2.6 各組大鼠肝臟組織MAPK mRNA、FGF21 mRNA表達(dá)比較 與空白組比較,模型組MAPK mRNA、FGF21 mRNA表達(dá)降低(P<0.05);陽(yáng)性對(duì)照組及補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中、高劑量組MAPK mRNA、FGF21 mRNA均高于模型組(P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較,補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中劑量組MAPK mRNA、FGF21 mRNA表達(dá)均降低(P<0.05)。隨著補(bǔ)陽(yáng)還五湯劑量增加,MAPK mRNA、FGF21 mRNA表達(dá)差異逐漸升高,且補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中、高劑量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 各組大鼠肝臟組織MAPK mRNA、FGF21 mRNA表達(dá)比較

3 討論

T2DM可由多種原因引起,其病機(jī)十分復(fù)雜[9]。臨床上常以口服藥物或注射胰島素的方法控制病情,但效果并不明顯,且具有毒副作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,T2DM多為“氣虛”“血瘀”[10]。因此,本研究使用補(bǔ)氣活血、祛瘀通絡(luò)的補(bǔ)陽(yáng)還五湯來(lái)干預(yù)。

本研究中,模型組大鼠體質(zhì)量明顯減輕,且出現(xiàn)多飲、多食、多尿的癥狀,此為T2DM的臨床特征,表明造模成功。補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組大鼠較模型組體質(zhì)量升高,12 h飲水量、攝食量、尿量有所降低,這說(shuō)明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可有效改善臨床癥狀。T2DM患者會(huì)伴隨不同程度的糖脂代謝紊亂,臨床上血糖、血脂水平是監(jiān)測(cè)糖脂代謝的重要指標(biāo)。本研究中,模型組FPG、FINS、HbA1c和TC、TG、LDL-C水平較高,HDL-C水平較低;補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療后各指標(biāo)均改善。說(shuō)明補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)T2DM大鼠的糖脂代謝有調(diào)節(jié)作用,臨床效果明顯。有學(xué)者研究的補(bǔ)陽(yáng)還五湯的作用效果與本研究基本一致[11-12]。HE結(jié)果也顯示造模后大鼠肝臟組織出現(xiàn)了非常明顯的病變,但經(jīng)補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療后,出現(xiàn)了明顯的改善,與藥物劑量呈正相關(guān),進(jìn)一步提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以減輕甚至是逆轉(zhuǎn)T2DM大鼠肝臟病理?yè)p傷,為該藥調(diào)節(jié)糖脂代謝提供了有力依據(jù)。

MAPK信號(hào)通路對(duì)T2DM胰島素細(xì)胞功能、糖脂代謝及炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥因子等均有調(diào)控作用[13-14]。FGF21是一種新的可以調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝的因子,還參與體內(nèi)糖脂代謝,調(diào)節(jié)能量、血脂等[15-16],而肝臟是FGF21最主要的表達(dá)器官[17-18],FGF21表達(dá)增加可以顯著降低T2DM大鼠體質(zhì)量和血糖,促進(jìn)糖的再吸收。FGF21可以通過(guò)激活下游的信號(hào)通路進(jìn)一步參與機(jī)體生物學(xué)功能的過(guò)程,而MAPK就是其下游的一個(gè)關(guān)鍵分子。MAPK可通過(guò)靶蛋白的磷酸化調(diào)節(jié)通路,調(diào)節(jié)糖的吸收與利用、控制肝糖的輸出、降低脂肪以及TG的合成,從而調(diào)節(jié)能量代謝[19-20]。因此,本研究進(jìn)一步對(duì)MAPK通路的相關(guān)蛋白及mRNA及FGF21的mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。研究顯示,與空白組比較,模型組MAPK、p-MAPK蛋白及MAPK、FGF21 mRNA表達(dá)較低,補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療后其表達(dá)明顯升高。這說(shuō)明,補(bǔ)陽(yáng)還五湯可增加MAPK的表達(dá)并促進(jìn)MAPK磷酸化,從而改善糖脂代謝。

綜上所述,補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)T2DM大鼠糖脂代謝有調(diào)節(jié)作用,其作用機(jī)制可能與激活MAPK信號(hào)通路有關(guān),這為該病的臨床治療提供了新思路,不過(guò)補(bǔ)陽(yáng)還五湯調(diào)控T2DM大鼠糖脂代謝的作用是否涉及其他通路還需進(jìn)一步研究。