溫針灸對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3表達(dá)的影響※

李益軍 梁興森 方細(xì)霞 肖文良 陳璟昆 謝美玲 王華軍 高彥平 李 嘉 李 玲▲

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變、軟骨下骨重塑、骨贅形成、滑膜炎癥反應(yīng)和血管生成為特征的慢性退行性疾病[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查表明，全球195 個(gè)國家中約有30310.68 萬人患有髖、膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎，同時(shí)KOA 也對社會經(jīng)濟(jì)造成了巨大的負(fù)擔(dān)，美國每年膝關(guān)節(jié)炎患者的醫(yī)療消耗約為8000萬美元[3]。在我國，KOA的發(fā)病率也常年居高不下，60 歲以上人群患病率可達(dá)50%，75 歲以上人群則達(dá)80%[4]。對于骨關(guān)節(jié)炎晚期的患者只能行全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)，但有10%～20%的患者在手術(shù)后因疼痛、僵硬、日?；顒邮芟薜仍蚋械讲粷M[5]，因此，早期KOA 的保守治療方案越來越受到重視?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于早期KOA 的治療主要以控制體質(zhì)量、運(yùn)動、藥物等為主[6]，但無法有效阻止疾病的進(jìn)展，達(dá)不到預(yù)期效果[7-8]。KOA在中醫(yī)學(xué)屬于“骨痹”范疇，溫針灸作為中醫(yī)學(xué)的重要組成部分，被廣泛應(yīng)用于早期骨關(guān)節(jié)炎的治療，但對其有效性與優(yōu)勢，也有研究提出了保留意見[9-10]，尤其是其治療機(jī)制的研究仍較少。本研究從動物實(shí)驗(yàn)的角度探究溫針灸治療KOA 的有效性及作用機(jī)制，以期為臨床方案的制定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組健康雌性清潔級SD 大鼠20只，體質(zhì)量（210±10）g，所有大鼠分籠飼養(yǎng)，由專人負(fù)責(zé)管理。實(shí)驗(yàn)室定期消毒，環(huán)境溫度（23±2）℃，相對濕度50%～70%。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后開始實(shí)驗(yàn)。按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為模型組與溫針灸組，每組10 只。本研究符合中國倫理委員會有關(guān)動物研究指導(dǎo)原則。

1.2 主要材料艾粒（10 mm×15 mm，0.7±0.07 g/粒，南陽市臥龍漢醫(yī)艾絨廠）；一次性無菌針灸針（0.30 mm×13 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；IL-1β ELISA試劑盒（Mreda，批號：M149213-48T）；MMP-3 ELISA 試 劑 盒（Mreda，批 號：MF16171-48T）；ADAMTS-7 ELISA 試劑盒（Zokeyo，批號：Y-97285-96T）；IL-1β 抗 體（Abcam，批 號：ab254360）；ADAMTS-7抗體（Abcam，批號：ab201083）；MMP-3抗體（Abcam，批 號：ab52915）；RIPA 裂 解 液（Elabscience，批號：E-BC-R327）。

圖2 ELISA檢測兩組大鼠膝關(guān)節(jié)液IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的表達(dá)情況

圖3 Western blot檢測兩組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的表達(dá)情況

圖4 RT qPCR檢測兩組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的mRNA 表達(dá)情況

1.3 模型制備采用改良Hulth法建立KOA模型[11]。造模方法：腹腔注射2 mL/kg 戊巴比妥鈉（30 g/L）麻醉大鼠，于無菌條件下切除大鼠右膝內(nèi)側(cè)半月板及內(nèi)側(cè)副韌帶，術(shù)后向大鼠肌內(nèi)注射20 U 青霉素以預(yù)防感染，每天1次，連續(xù)3 d。模型制備后需等待2 w形成大鼠KOA模型，造模成功后再進(jìn)行干預(yù)。

1.4.1 模型組 正常抓取、捆綁固定，每天1 次，連續(xù)20 d。

1.4.2 溫針灸組 參照《實(shí)驗(yàn)動物針灸穴位圖譜》[12]，取膝前穴，一次性針灸針針刺深度約5 mm，上下提插3次后，將艾粒置于針柄處后點(diǎn)燃，燃完起針，每天1次，連續(xù)20 d。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 行為學(xué)評分 由同一位經(jīng)過培訓(xùn)的醫(yī)師，從疼痛程度、步態(tài)改變、關(guān)節(jié)活動范圍、關(guān)節(jié)腫脹度四個(gè)方面，分別于模型制備前、模型制備后2 w、治療20 d后對大鼠進(jìn)行行為學(xué)評測，根據(jù)膝骨關(guān)節(jié)炎功能指數(shù)Leauesne MG 量表[13]進(jìn)行評分，分?jǐn)?shù)越高說明癥狀越嚴(yán)重。

1.5.2 影像學(xué)指標(biāo) 干預(yù)20 d 后，對兩組大鼠做右側(cè)膝關(guān)節(jié)micro-CT 掃描。將大鼠麻醉固定于micro-CT 床進(jìn)行掃描，之后借助micro-CT 系統(tǒng)配套的軟件對掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)重建，利用三維旋轉(zhuǎn)功能選取膝關(guān)節(jié)脛骨平臺區(qū)域軟骨下骨進(jìn)行分析。骨組織分析指標(biāo)：骨體積分?jǐn)?shù)（bone volμme fraction，BV/TV）為皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨骨量評價(jià)常用指標(biāo)，能夠反映不同樣本骨小梁骨量的多少，該值增高說明骨合成代謝大于分解代謝，骨量增加；骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（trabecular nμmber，Tb.N）、骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp），上述三個(gè)指標(biāo)是評價(jià)骨小梁空間形態(tài)結(jié)構(gòu)的主要指標(biāo)，在骨合成代謝大于骨分解代謝時(shí)，Tb.N 和Tb.Th 數(shù)值上升，Tb.Sp數(shù)值下降。

1.5.3 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3 含量 治療20 d 后，按照白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）、聚蛋白多糖酶-7（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-7，ADAMTS-7）的ELISA 試劑盒子上的操作方法使用ELISA 檢測大鼠關(guān)節(jié)液中的IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的含量。

1.5.4 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3含量 檢測兩組大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨組織IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3 蛋白表達(dá)水平。摘取大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)，剝離軟骨組織并粉碎后，再加0.5 mL RIPA 裂解液沒過軟骨組織，于2 ℃下15000 r/min 離心10 min，取上清液，對待測蛋白進(jìn)行上樣，依次完成電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉及免疫印跡顯色等步驟。采用Image J 軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白條帶與GAPDH灰度比值表示蛋白相對表達(dá)水平。

1.5.5 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（Real-time qPCR，RT-qPCR）檢測IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的mRNA 表達(dá) 使用RT qPCR 檢測兩組大鼠軟骨組織中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3 的mRNA 表達(dá)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)。

10月19日早上8：20，離金樽獎(jiǎng)?wù)搲_幕還有40分鐘時(shí)，我見到了David。他背著鼓囊囊的挎包，一步步走向舞臺，一邊的肩膀被壓得微微有些傾斜。坐了一個(gè)晚上的飛機(jī)，早上6點(diǎn)才落地廣州，他看起來似乎有些疲憊。論壇、大師班、品鑒會、晚宴，4場幾乎無縫銜接的活動都需要他在場發(fā)言或是主持，這天對David而言會是漫長的一天。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測結(jié)果模型制備前兩組大鼠Lequesne MG評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型制備后2 w，模型組、溫針灸組Lequesne MG評分較之前升高（P＜0.05），說明KOA大鼠造模成功。治療20 d 后，兩組Lequesne MG 評分明顯降低（P＜0.05），且與模型組比較，溫針灸組的Lequesne MG 評分更低（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組大鼠Leauesne MG評分結(jié)果比較（ ± s，分）

表1 兩組大鼠Leauesne MG評分結(jié)果比較（ ± s，分）

注：與制備前比較，①P＜0.05；與治療前比較，②P＜0.05；與模型組比較，③P＜0.05

組別模型組溫針灸組模型制備前0.60±0.70 0.60±0.70模型制備后2 w 9.00± 0.94①8.90±1.20①治療20 d后6.50±1.58②8.20±1.14②③

2.2 影像學(xué)檢測結(jié)果治療20 d 后，觀察兩組大鼠脛骨平臺軟骨下骨情況，結(jié)果顯示模型組大鼠軟骨下骨損傷較溫針灸組明顯，見圖1。骨組織分析結(jié)果顯示，與模型組比較，溫針灸組的BV/TV、Tb.Th、Tb.N上升，Tb.Sp 降低，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組大鼠膝關(guān)節(jié)骨組織分析結(jié)果比較（ ± s）

表2 兩組大鼠膝關(guān)節(jié)骨組織分析結(jié)果比較（ ± s）

注：與模型組比較，①P＜0.05

溫針灸組49.36±1.29①78.36±2.36①6.53±0.16①102.89±1.69①指標(biāo)BV/TV（%）Tb.Th（μm）Tb.N（mm-1）Tb.Sp（μm）模型組33.07±2.06 69.62±1.36 5.02±0.33 118.25±1.66

2.3 ELISA 檢測結(jié)果治療20 d 后，與模型組比較，溫針灸組關(guān)節(jié)液中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3 含量均降低（P＜0.05）。見圖2。

2.4 Western blot 檢測結(jié)果治療20 d 后，與模型組比較，溫針灸組大鼠軟骨組織中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3含量均降低（P＜0.05）。見圖3。

2.5 RT qPCR檢測結(jié)果治療20 d后，與模型組比較，溫針灸組IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3 的mRNA 含量均降低（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

近年來，溫針灸廣泛應(yīng)用于KOA 的治療，大部分研究認(rèn)為其在鎮(zhèn)痛、恢復(fù)關(guān)節(jié)功能等方面具有很好的療效[14]。何敏昌等[15]研究發(fā)現(xiàn)，相較于傳統(tǒng)口服藥物治療，溫針灸治療KOA 可以改善患者的骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)，增加膝關(guān)節(jié)屈曲度。但也有研究[10]認(rèn)為溫針灸在與傳統(tǒng)針刺、電針的比較中，總有效率并沒有區(qū)別。部分回顧性研究指出，對于溫針灸的治療效果，仍需要更多高質(zhì)量的研究進(jìn)一步驗(yàn)證[16-17]。與此同時(shí)，關(guān)于溫針灸治療骨關(guān)節(jié)炎的動物實(shí)驗(yàn)逐漸受到重視。王永超等[18]對溫針灸治療前后的大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測，利用局部疼痛度和關(guān)節(jié)腫脹程度兩個(gè)指標(biāo)評價(jià)溫針灸的治療效果。本研究通過Lequesne MG 量表評分，觀察KOA 大鼠在溫針灸治療后疼痛程度、步態(tài)改變、關(guān)節(jié)活動范圍、關(guān)節(jié)腫脹程度四個(gè)指標(biāo)的改善程度，結(jié)果表明溫針灸確實(shí)可以改善KOA 的癥狀，療效確切。

骨關(guān)節(jié)炎主要是以關(guān)節(jié)內(nèi)異常的炎癥反應(yīng)及軟骨等組織的破壞為主要病理表現(xiàn)。軟骨細(xì)胞賴以生存的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的合成與降解失衡是導(dǎo)致軟骨退變的重要原因之一[19]。其中ADAMTS 和MMPs 與ECM 退變密切相關(guān)。軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）作為軟骨細(xì)胞中重要的非膠原成分，可以維持軟骨的穩(wěn)定性[20]。骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病時(shí)關(guān)節(jié)軟骨組織中的ADAMTS-7 明顯提高，可以消化分解COMP，進(jìn)而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞ECM的破壞，導(dǎo)致軟骨組織受損[21]。研究[22]表明，ADAMTS-7 對于軟骨細(xì)胞的分化及軟骨形成具有抑制作用，認(rèn)為可以通過抑制ADAMTS-7從而治療骨關(guān)節(jié)炎。周逸敏[23]研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)骨寶湯可通過抑制ADAMTS-7 的表達(dá)，減少COMP 的降解，穩(wěn)定軟骨細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)環(huán)境，從而有利于KOA 的修復(fù)。羅素娟[24]發(fā)現(xiàn)，消骨痛湯可通過抑制“ADAMTS-7-COMP 降解-細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定性下降”達(dá)到治療骨關(guān)節(jié)炎的目的。由此可見，ADAMTS-7 的上調(diào)是KOA中促進(jìn)軟骨損傷、阻礙軟骨修復(fù)的重要因子，同時(shí)也為骨關(guān)節(jié)炎治療提供了新的思路。然而，目前溫針灸治療骨關(guān)節(jié)炎的研究中，還未有人關(guān)注過ADAMTS-7的變化。

MMPs家族構(gòu)成了細(xì)胞外基質(zhì)降解最重要的蛋白水解系統(tǒng)，其中MMP-3是基質(zhì)溶解素中的重要成分，在KOA 的不同病理時(shí)期均有表達(dá)，可促進(jìn)軟骨組織的退變[25]。林如意等[26]研究證明，溫針灸可以降低患者血清中MMP-3 的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，與模型組比較，溫針灸組關(guān)節(jié)液、軟骨組織中ADAMTS-7、MMP-3 含量均降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明溫針灸可以通過降低ADAMTS-7 以及MMP-3的表達(dá)，延緩軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的破壞，從而起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用，進(jìn)而延緩骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展。炎癥反應(yīng)作為骨關(guān)節(jié)炎的主要病理機(jī)制，抑制炎癥反應(yīng)對于疾病的治療有著重要意義。大量研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β 在KOA 患者關(guān)節(jié)軟骨中表達(dá)增加[27]，IL-1β 是重要的促炎細(xì)胞因子，可加重關(guān)節(jié)內(nèi)的炎癥反應(yīng)，還可以促進(jìn)ADAMTS-7、MMP-3 的表達(dá)[28-29]，在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中參與關(guān)節(jié)軟骨的損傷及破壞。夏循富等[30]研究發(fā)現(xiàn)，通過溫針灸治療，關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑液中IL-1β含量降低，與治療前比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但其檢測手段單一，檢測結(jié)果不夠直觀。而本研究通過多種檢測方法，證明溫針灸確實(shí)可以有效降低骨關(guān)節(jié)炎中IL-1β的表達(dá)?？傊?，本研究獲取大鼠關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)液等標(biāo)本，通過ELISA檢測、Western blot、RT qPCR等方法，驗(yàn)證了溫針灸可以同時(shí)降低ADAMTS-7、MMP-3、IL-1β 的表達(dá)，從多方位起到對骨關(guān)節(jié)炎中軟骨組織退變的延緩作用。

KOA的病變不僅僅累及軟骨，軟骨下骨同樣會發(fā)生改變。關(guān)節(jié)活動依賴于正常的解剖結(jié)構(gòu)，早期KOA軟骨下骨多以軟骨下骨的吸收為主，表現(xiàn)為骨體積減小，可以出現(xiàn)應(yīng)力性微骨折[31]。軟骨下骨結(jié)構(gòu)改變可導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)生物力學(xué)特性發(fā)生變化，從而引發(fā)并加重KOA。有研究[32]表明，軟骨下骨與軟骨之間存在生物化學(xué)交流，這種交流調(diào)控在KOA 病程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。由此可見，保護(hù)軟骨下骨對KOA 的治療至關(guān)重要。戴燚等[33]發(fā)現(xiàn)，青娥方可以通過保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨下骨，調(diào)節(jié)軟骨下骨組織骨小梁各項(xiàng)指標(biāo)，改善骨代謝，延緩早期軟骨下骨丟失，防治骨性關(guān)節(jié)炎。柴毅[34]研究發(fā)現(xiàn)，左歸丸可改善骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨、軟骨病變，促進(jìn)軟骨下骨形成，抑制骨吸收，有助于恢復(fù)骨重建平衡，提高骨密度，具有修復(fù)軟骨下骨的作用。如今，軟骨下骨的保護(hù)在骨關(guān)節(jié)炎的治療中愈發(fā)受到重視，然而目前關(guān)于溫針灸對骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨影響的研究較少。馬遇原等[35]通過切片觀察到，模型組軟骨下骨受損嚴(yán)重，軟骨下骨中細(xì)胞排列紊亂，大小、密度不均，而溫針灸組較模型組軟骨下骨細(xì)胞分布較均勻。朱仕強(qiáng)等[36]通過病理切片染色觀察后發(fā)現(xiàn)，溫針灸治療可以使得軟骨下骨的骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)目明顯升高，骨小梁彌散度明顯降低。

從本研究大鼠膝關(guān)節(jié)micro-CT 的掃描結(jié)果可以看出，模型組大鼠軟骨下骨損傷破壞較為明顯，而溫針灸組大鼠軟骨下骨的形態(tài)較為規(guī)整，較模型組破壞程度明顯降低。從骨組織分析發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，溫針灸組大鼠軟骨下骨的骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量均有所上升，而骨小梁分離度有所下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示溫針灸可以在一定程度上緩解大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨的破壞。由此可見，溫針灸不僅可以保護(hù)軟骨，同時(shí)可以改善膝關(guān)節(jié)炎早期軟骨下骨的損傷，延緩疾病的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，溫針灸能夠有效改善關(guān)節(jié)疼痛等癥狀，同時(shí)改善關(guān)節(jié)軟骨下骨的破壞，降低關(guān)節(jié)軟骨組織IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3 等細(xì)胞因子對軟骨的降解作用，使KOA的癥狀得以改善。