正交響應(yīng)面提取山核桃外果皮4,8-DHT的研究

張金云，劉 姚，楊 光，宋 杰，陽桂芳，吳世軍

（廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院 園藝與食品學(xué)院，廣東 廣州 51000）

天然產(chǎn)物提取方法主要有超聲法、浸提法、研磨萃取法、熱回流法、微波法和酶解法等[1]。工業(yè)化提取天然產(chǎn)物常用浸提法，多采用正交設(shè)計(jì)，優(yōu)化時(shí)提取工藝條件影響較大的浸提時(shí)間、浸提溫度、浸提溶劑和料液比等參數(shù)[2]。目前，正交響應(yīng)面優(yōu)化超聲提取法在核桃外果皮天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用還不多見，正交響應(yīng)面分析法中的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)模型可以提供3～12個(gè)因素，從高到低3個(gè)水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析。與正交法相比，該方法使用高效、模型誤差小、精度高，通過回歸模型預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)測試驗(yàn)結(jié)果之間有無差異[3，4]。因此，對(duì)山核桃外果皮化感活性物質(zhì)提取條件進(jìn)行正交響應(yīng)面設(shè)計(jì)，對(duì)于高效提取4,8-DHT 有一定意義。本文采用正交響應(yīng)面分析法優(yōu)化設(shè)計(jì)山核桃外果皮4,8-DHT 提取條件影響較大的因素，確定山核桃外果皮4,8-DHT 提取工藝的最佳組合，為工業(yè)化提取4,8-DHT奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

4,8-DHT標(biāo)準(zhǔn)品（97.8%）從山核桃外果皮分離純化獲得。

1.2 主要儀器

JP3-120 超聲清洗機(jī)（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；ESJ-4B 萬分之一電子天平（上海嘉展儀器設(shè)備有限公司）；BPMJ-250F恒溫智能培養(yǎng)箱（河南鞏義予華有限公司）。Agilent Technologies 1290 Infinity 超高效液相色譜（UPLC）（美國安捷倫科技公司）；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琪公司）。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配置

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配置，精確稱取4,8-DHT 樣品5 mg，乙醇定容10 mL，配制成濃度為500 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)母液，將標(biāo)配母液制成1.25 μg/mL、0.625 μg/mL、0.312 μg/mL、0.156 μg/mL和0.078 μg/mL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2 4,8-DHT標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值

標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品吸光值分別為2.073、1.013、0.543、0.266和0.106。y=1.658 1x-0.003（R2=0.999 3）。

2.3 4,8-DHT含量測定方法

將山核桃外果皮水浸提液真空抽濾，濾液減壓旋蒸干燥后通過Diaion HP-20 柱初分離，用不同濃度的乙醇溶液（0、10%、30%、50%和60%）洗脫，并收集洗脫液，洗脫流速25 mL/min，梯度洗脫至洗脫液為無色。合并收集的洗脫液。UV測定吸光值，計(jì)算4,8-DHT含量。

2.4 4,8-DHT提取含量計(jì)算方法

4,8-DHT提取含量的計(jì)算公式為：

式中：T——4,8-DHT 的提取含量，mg/g；C——所測的樣品的的濃度，μg/mL；V——樣品體積，mL；W——山核桃外果皮粉末的質(zhì)量，g。

3 結(jié)果與分析

3.1 山核桃外果皮4,8-DHT單因素提取試驗(yàn)

不同提取條件對(duì)4,8-DHT含量的影響，見圖1。

圖1 不同提取條件對(duì)4,8-DHT含量的影響Fig.1 Effects of different extraction conditions on the content of 4,8-DHT

由圖1A 可知，當(dāng)提取時(shí)間為2 h 時(shí)提取含量達(dá)最高；由圖1B可知，當(dāng)提取溫度達(dá)到70℃時(shí)提取含量達(dá)峰值；由圖1C可知，當(dāng)超聲功率為65 W 時(shí)提取含量最高；由圖1D 可知，當(dāng)提取乙醇濃度達(dá)到65%時(shí)提取含量達(dá)峰值，故選取2 h、70℃、65 W、65%為正交響應(yīng)面提取因素試驗(yàn)的中間水平值。

3.2 4,8-DHT提取正交響應(yīng)曲面的優(yōu)化

3.2.1 山核桃外果皮提取4,8-DHT響應(yīng)曲面試驗(yàn)

響應(yīng)面分析的因素與水平見表1。根據(jù)CCD 原理，整個(gè)試驗(yàn)過程以4,8-DHT 提取含量為響應(yīng)值，以提取時(shí)間、溫度、超聲功率和乙醇濃度為因素，設(shè)計(jì)4 因素3 水平的超聲提取響應(yīng)面試驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面分析法的因素與水平表Tab.1 Factor and level table of response surface analysis

3.2.2 超聲提取4,8-DHT的模型和顯著性分析

應(yīng)用Design-expert（version8.0）軟件對(duì)表1 提取試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到4,8-DHT 提取含量（y）的二次多項(xiàng)式回歸方程為：

式中：x1——提取時(shí)間真實(shí)值，h；x2——提取溫度真實(shí)值，℃；x3——提取功率真實(shí)值，W；x4——乙醇濃度真實(shí)值，%。

Design-expert 對(duì)模型進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見表2 可。結(jié)果顯示模型P＜0.000 1，表明該模型的回歸方程極顯著；同時(shí)模型的線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.926 5，表明模型可以解釋92.65%的總變異，模型擬合程度較好，總差0.046，系統(tǒng)誤差不大，說明可以用此模型來分析和預(yù)測超聲提取4,8-DHT 的含量。

表2 方差分析Tab.2 Analysis of variance

3.2.3 超聲提取4,8-DHT的響應(yīng)曲面分析

由圖2A 可知，超聲功率62.5 W、乙醇濃度65%，提取時(shí)間和提取溫度對(duì)4,8-DHT 提取含量影響試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)提取時(shí)間大于1 h，溫度在55℃～65℃時(shí)，4,8-DHT 提取含量高于2.41 mg/g。時(shí)間和溫度對(duì)4，8-DHT 提取含量影響不顯著（P＜0.05）；時(shí)間和溫度的交互作用對(duì)4,8-DHT 提取含量影響不顯著（P＞0.05）；由圖2B 可知，時(shí)間2 h、提取溫度70℃，超聲功率和乙醇濃度對(duì)4,8-DHT 提取含量影響試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)超聲功率＞50 W、乙醇濃度＞50%時(shí)，4,8-DHT 提取含量高于2.43 mg/g。超聲功率和乙醇濃度顯著影響4,8-DHT 提取含量（P＜0.05）；超聲功率和乙醇濃度的交互作用顯著影響4，8-DHT 提取含量（P＜0.05）；由圖2C 可知，當(dāng)超聲功率＞50 W，提取溫度在55℃～65℃時(shí)，4，8-DHT 提取含量高于2.39 mg/g。超聲功率對(duì)4,8-DHT 是顯著的；溫度、超聲功率和乙醇濃度的交互作用對(duì)4,8-DHT 提取含量影響不顯著（P＞0.05）；由圖2D 可知，當(dāng)超聲功率＞50 W、提取時(shí)間＞1 h 時(shí)，4,8-DHT 提取含量高于2.44 mg/g。超聲功率，超聲功率和時(shí)間的交互作用對(duì)4,8-DHT 提取含量影響顯著；時(shí)間對(duì)4,8-DHT 提取含量影響不顯著的（P＞0.05）；由圖2E 可知當(dāng)乙醇濃度＞50%，取溫度在55℃～65℃時(shí)，4，8-DHT 提取含量高于2.43 mg/g。乙醇濃度對(duì)4,8-DHT 是顯著的；溫度，溫度與乙醇濃度的相互作用對(duì)4,8-DHT 的影響是不顯著的（P＞0.05）；由圖2F 可知，當(dāng)乙醇濃度＞50%、時(shí)間＞1 h 時(shí)，4,8-DHT提取含量高于2.42 mg/g。乙醇濃度顯著影響4,8-DHT 提取含量；時(shí)間與乙醇濃度的相互作用對(duì)4,8-DHT 提取含量無影響（P＞0.05）。

圖2 時(shí)間、溫度、超聲功率和乙醇濃度對(duì)4,8-DHT提取含量響應(yīng)曲面的影響Fig.2 Effect of time,temperature,ultrasonic power and ethanol concentration on the content response surface of 4,8-DHT extraction

3.2.4 超聲提取4,8-DHT的響應(yīng)曲面優(yōu)化與顯著性驗(yàn)證

模型的驗(yàn)證，見表3。

表3 模型的驗(yàn)證Tab.3 Verification of model

由3表可知，提取時(shí)間1.04 h，提取溫度60.2℃，超聲功率為52.76 W，乙醇濃度為50%。在此條件下，4,8-DHT 提取含量的理論值為2.48 mg/g；試驗(yàn)值為2.48 mg/g。結(jié)果表明理論值與試驗(yàn)值相近，模型可用。

4 討論

研究結(jié)果表明，4,8-DHT 標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.658 1x-0.003（R2=0.999 3），4,8-DHT 含量與峰面積線型關(guān)系良好，可以用來測定山核桃外果皮4,8-DHT含量。

最佳提取工藝研究結(jié)果表明，超聲法不考慮提取因素之間互作對(duì)提取含量的影響，當(dāng)提取時(shí)間為2 h、提取溫度為70℃、超聲功率為65 W、乙醇濃度為65%時(shí)，4,8-DHT提取效果最好。有研究采用正交熱回流法提取山核桃外果皮中核桃酮，單因素核桃酮最佳提取溶劑為95%的乙醇，溫度為80℃，提取時(shí)間為1 h 時(shí)，正交試驗(yàn)熱回流法提取最佳條件為95%乙醇，提取溫度80℃，提取時(shí)間1 h[5]。

超聲法與熱回流法提取時(shí)間相同，其他因素存在差異，有可能是因?yàn)樘崛∥锞鶠樗苄院痛既苄曰瘜W(xué)物質(zhì)，熱回流法提取過程中乙醇可以循環(huán)利用，在較高溫度情況下，乙醇無蒸發(fā)損失。因此，乙醇濃度相對(duì)較高，有利于物質(zhì)的提取。超聲法雖然有利于提高物質(zhì)溶解速度，但溫度較高時(shí)，溶劑乙醇容易蒸發(fā)，故而超聲法溫度和乙醇濃度相對(duì)回流法要略有降低，且響應(yīng)面超聲法模型理論值（2.48 mg/g）與實(shí)測值（2.49 mg/g）相近，表明最佳提取工藝可用?？紤]工藝化提取4,8-DHT 含量過程熱耗損失與乙醇經(jīng)濟(jì)成本，適當(dāng)?shù)臏囟群鸵掖紳舛扔欣诮档凸I(yè)化生產(chǎn)成本。

5 小結(jié)

經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證得出，超聲提取山核桃外果皮4,8-DHT 的最佳工藝條件為：提取時(shí)間1 h，提取溫度60℃，超聲功率55 W，乙醇濃度50%；在該工藝條件下，4,8-DHT 提取含量為2.48 mg/g，達(dá)到最優(yōu)。