基于蛋白組學分析旋毛蟲原肌球蛋白過表達對小細胞肺癌NCI-H446細胞蛋白組分的影響

王灝軒,朱瑩瑩,程露陽,郭文平,杜孌英

肺癌在我國的發(fā)病率和死亡率均位居各類癌癥之首,且呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[1]。小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)具有惡性程度高、進展快,預后差等特點[2]。臨床上對SCLC的治療以化療為主,但容易造成化療藥物的繼發(fā)性耐藥,而腫瘤的生物治療可在腫瘤的治療方面發(fā)揮重要作用[3]。旋毛蟲的抗腫瘤作用已被越來越多的研究所證實[4],其作用機制主要分為調節(jié)免疫細胞功能[5-7]或誘導細胞凋亡發(fā)揮作用[8-9]。除此之外,旋毛蟲對腫瘤細胞增殖、周期、代謝以及免疫微環(huán)境均有影響[5, 9-10]。但因旋毛蟲感染人體可導致一定的病理損傷,用旋毛蟲感染人體治療腫瘤會有諸多困難,也會引起患者不良心理反應等缺點,使其在臨床上較難推廣應用[11-12]。而源自旋毛蟲的重組蛋白則可以減少旋毛蟲對人體的感染。旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白(Excretory/secretory proteins, ESPs)能通過影響細胞周期和促進凋亡抑制NCI-H446細胞增殖[13]。課題組前期通過質譜法分析了旋毛蟲肌幼蟲ESPs的蛋白組分,并篩選出旋毛蟲原肌球蛋白(Tropomyosin,Tm)等抗腫瘤相關重組蛋白[14],以其替代旋毛蟲肌幼蟲ESPs發(fā)揮其抗腫瘤作用。

Tm是肌動蛋白細胞骨架結構蛋白,參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展。研究表明Tm可以介導癌細胞的遷移、侵襲、細胞凋亡和細胞代謝等生物學過程[15-17]。文獻報道,旋毛蟲Tm可以通過交叉免疫反應抑制骨肉瘤細胞生長[18]。其他寄生蟲源Tm也展現(xiàn)出不同的免疫調節(jié)作用或抗腫瘤活性[19-20]。但是旋毛蟲重組蛋白Tm的分子功能,及其對NCI-H446細胞蛋白組分的影響和潛在機制尚不清楚。

異源基因造成腫瘤細胞凋亡,周期阻滯,代謝水平的改變等均會影響腫瘤細胞的生長[19, 21-23],癌細胞的生長一旦受到抑制會引起癌細胞內多種蛋白的表達發(fā)生變化[22],分析其蛋白組分的變化并研究其功能是揭示異源基因抗腫瘤作用機制的手段之一。蛋白質組學可以分析細胞全體蛋白質,能夠直觀、整體地研究蛋白質的組成與調控的活動規(guī)律。本研究通過蛋白質組學技術對旋毛蟲Tm過表達組和轉染空載體組的蛋白質組分進行對比,篩選出差異表達蛋白(Differentially expressed protein,DEPs),并對DEPs進行基因本體論(Genetic Ontology, GO)功能富集分析,通過構建蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡進一步篩選中心節(jié)點蛋白,并通過Western blot對隨機選取的中心節(jié)點蛋白NDRG1進行驗證。實驗將為深入研究旋毛蟲Tm的分子功能以及對SCLC的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 NCI-H446細胞的培養(yǎng)與傳代 從液氮中取出NCI-H446細胞,立即復蘇,用 RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%小牛血清和1%青鏈霉素混合液)培養(yǎng)細胞。待細胞豐度達到80%～90%時,進行細胞傳代,傳3代后取對數(shù)生長期的NCI-H446細胞待用。

1.2 旋毛蟲TM過表達NCI-H446細胞的構建 細胞轉染采用脂質體法。將2 μg目的基因質粒(TM-pcDNA3.1)和空載體(PcNDA3.1)用無血清的1640培養(yǎng)基(不含血清和抗生素)稀釋,向DNA溶液中加入2 μL的轉染試劑,室溫下孵育10～15 min。待轉染復合物形成后將其緩慢滴入培養(yǎng)基中,并輕輕轉動培養(yǎng)基以確保轉染復合物分布均勻。

1.3 差異蛋白的篩選 本研究利用串聯(lián)質譜標記(Tandem mass tags, TMT)技術,標記目標肽段的N端或賴氨酸側鏈,以期分離處發(fā)生變化的蛋白。使用Q Exactive質譜儀(Thermo Fisher Scientific, 美國)檢測肽段信號,將脫鹽后的多肽混合物裝入Acclaim PePmap C18反相色譜柱(100 mm × 7 mm,5 μm),用安裝在Dionex ultimate 3000 nano LC系統(tǒng)上的反相C18色柱進行分離。使用80%(v/v)的乙腈在0.1%的甲酸中的梯度,在45 min內洗脫多肽,流速為300 nL / min。洗脫液直接進入Q Exactive質譜儀,設置為正離子模式,以數(shù)據(jù)為導向,質譜全掃描范圍為 350～2 000 m/z,以上操作重復3次以確保其穩(wěn)定性。最后,利用PD(Proteome Discoverer 1.4,thermo)軟件進行定性檢索與分析,PD提取后的譜圖用mascot進行搜索。檢索 UniProt 數(shù)據(jù)庫獲取蛋白質名稱、基因ID等信息,根據(jù)P<0.05,且FC(fold change)≥1.2或≤0.83為標準篩選DEPs。

1.4 生物信息學分析 在獲得DEPs數(shù)據(jù)后,利用生物信息學分析對數(shù)據(jù)進行注釋和歸類,以得到蛋白質的注釋結果及其可能的細胞組分定位、分子功能、參與的信號通路和蛋白互作網(wǎng)絡等信息,進而為后期研究方向的選擇提供參考。本研究利用GO (http: / /www.Geneontology.org/) 功能富集分析分別從生物過程(biological processes)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)3個不同的生物學方面描述蛋白的功能。

1.5 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡的構建 在生物體中,蛋白質并非獨立存在,其功能形式必須借助其他蛋白質的調節(jié)和介導,因此,研究蛋白質間的相互作用及相互作用形成的網(wǎng)絡對揭示蛋白質的功能有重要意義。本研究利用相互作用基因庫檢索工具(STRING)數(shù)據(jù)庫檢索DEPs,構建出PPI網(wǎng)絡,設定最低相互作用閾值為0.15,獲取其相互作用的具體數(shù)值。將相互作用網(wǎng)絡數(shù)據(jù)及DEPs數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.9.0 軟件,繪制蛋白質相互作用網(wǎng)絡。利用cytoCNA插件中介數(shù)中心性(Betweenness Centrality,BC)算法繪制出與其他蛋白密切關系。

1.6 Western blot 取對數(shù)生長期的NCI-H446細胞,轉染TM-pcDNA3.1為實驗組(Tm),轉染PcNDA3.1為對照組(NC),轉染48 h 后按細胞裂解液說明書提取細胞總蛋白,采用BCA蛋白定量試劑盒(Solarbio,中國)檢測各組蛋白濃度。上樣量為每孔20 μg進行電泳、轉膜、封閉后,加入一抗NDRG1(1∶1 000,Abclonal 公司,中國武漢)、β-actin(1∶100 000,Abclonal 公司,中國武漢)單克隆抗體分別孵育2 h,洗膜后加入二抗(1∶10 000)孵育1 h。蛋白相對表達水平=NDRG1 灰度值/β-actin 灰度值,重復測量3次,取平均值。每個條帶的蛋白灰度值采用 Image J 軟件檢測。

2 結 果

2.1 蛋白/肽段統(tǒng)計 本研究共鑒定到2 629個蛋白,9 961條多肽。在所有已鑒定的蛋白質中,大約62%的蛋白包括至少2種肽段(圖1A)。對于不同的質譜儀可檢測的肽段長度有一定的限制,鑒定肽段長度合理說明蛋白酶選用恰當。結果表明,肽段長度主要集中在7～17個氨基酸長度,符合肽段長度合理范圍內,說明酶切效果好,數(shù)據(jù)質量高(圖1B)。鑒定到的所有蛋白依據(jù)其肽段電荷分布進行統(tǒng)計,肽段電荷數(shù)≤3的約占96.55%(圖1C),電荷數(shù)超過3的情況不常見。此外,分別鑒定出約44.4%和20.3%的蛋白質具有大于10%和20%的序列覆蓋率(圖1D),鑒定到的蛋白的整體可信度及準確度較高。

A:蛋白肽段鑒定數(shù)分布圖,B:多肽長度分布圖,C:肽段電荷分布圖,D:蛋白鑒定覆蓋率。圖1 蛋白/肽段統(tǒng)計概覽Fig.1 Protein/peptide statistics overview

2.2 差異蛋白的篩選 為探討旋毛蟲Tm對NCI-H446細胞的影響,本研究利用TMT技術對旋毛蟲Tm過表達48 h后NCI-H446細胞的蛋白組分進行分析。以P<0.05,FC≥1.2或≤0.83為篩選條件,篩選出70個DEPs,包括34個下調蛋白和36個上調蛋白,將篩選DEPs的分析結果以火山圖(volcano plot)的形式進行可視化(圖2A)。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索DEPs,表1和表2分別列出了表達上調和下調顯著性排名位于前10的蛋白質信息。

表1 顯著上調的差異蛋白前10位列表Tab.1 Top 10 protein of up-regulated differential expressed proteins

表2 顯著下調的差異蛋白前10位列表Tab.2 Top 10 protein of down-regulated differential expressed proteins

A:差異表達蛋白火山圖;B:差異蛋白分子功能的GO分析;C:差異蛋白生物學過程的GO分析;D:差異蛋白細胞組分的GO分析。圖2 旋毛蟲Tm過表達所致差異表達蛋白的生物信息學分析Fig.2 Bioinformatics analysis of differentially expressed proteins after overexpression of Trichinella spiralis Tm

2.3 旋毛蟲Tm過表達所致的DEPs的GO分析 為分析DEPs的生物學功能,本研究分別從分子功能、生物過程、細胞成分3個層面對DEPs進行GO功能注釋分析。GO分析結果顯示DEPs主要發(fā)揮絲氨酸型肽鏈內切酶活性、蛋白激酶活性等分子功能(圖2B);生物過程涉及免疫球蛋白等介導的免疫應答調節(jié)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄延長的正調控及脂質定位等(圖2C);DEPs定位于轉錄延長因子復合物、前核糖體小亞基等(圖2D)。

2.4 旋毛蟲Tm過表達所致的蛋白互作關系 為了鑒定旋毛蟲Tm與其他蛋白聯(lián)系密切的中心節(jié)點蛋白,構建了PPI網(wǎng)絡,其中蛋白蛋白互作關系數(shù)據(jù)從STRING數(shù)據(jù)庫獲得。根據(jù)STRING數(shù)據(jù)庫提供的信息,利用Cytoscape 3. 9. 0軟件對70個差異蛋白進行可視化(圖3A)。為了更直觀的觀察中心節(jié)點蛋白,利用CytoCNA插件通過BC評分計算出蛋白-蛋白之間的聯(lián)系程度(圖3B),BC評分前五的蛋白分別是:細胞周期蛋白G相關激酶(GAK)、組蛋白H3-7(H3-7)、辛普勒金Symplekin(SYMPK)、N-myc下游調節(jié)因子1(NDRG1)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶N2(PKN2)。

A:所有差異蛋白構成的 PPI 網(wǎng)絡圖;紅色菱形代表上調差異蛋白,綠色圓形代表下調差異蛋白;直線連接兩個圓形代表差異蛋白之間有相互作用。B:以“BC”評分為篩選條件;顏色越接近紫色則BC評分越高,越接近藍色則BC評分越低。圖3 PPI調節(jié)網(wǎng)絡圖Fig.3 PPI network diagram

2.5 Western blot 我們從上述評分前五的中心節(jié)點蛋白中隨機選取了一種蛋白NDRG1,通過Western blot 進行了獨立驗證。實驗結果顯示,旋毛蟲Tm能降低NCI-H446細胞中NDRG1的表達(t=5.772,P<0.05)。見圖4。

A:Western blot檢測Tm過表達后對NCI-H446細胞中NDRG1蛋白的表達情況;B:NDRG1蛋白表達的定量分析。圖4 Western blot 驗證Fig.4 Western blot verification

3 討 論

旋毛蟲是人獸共患病病原體,對人類健康有一定影響,但有許多研究亦表明,旋毛蟲有調節(jié)免疫細胞功能的能力[4],例如旋毛蟲通過誘導巨噬細胞、樹突細胞等免疫細胞的活化[5-6],促進轉化生長因子β和調節(jié)性因子白細胞介素-10的釋放[7]。除旋毛蟲感染宿主外,學者們還通過提取旋毛蟲ESPs,或重組蛋白證明了旋毛蟲的抗腫瘤作用[13, 24],例如旋毛蟲肌幼蟲ESPs通過抑制抗凋亡蛋白Bcl2,激活促凋亡蛋白Bax的表達,引起Cyt-C由線粒體內釋放到胞質中,激活線粒體介導的細胞凋亡發(fā)揮作用[8-9]。

Tm在肌肉收縮的過程中發(fā)揮調節(jié)作用。該蛋白由兩條α-螺旋鏈組成,結構相對保守,該蛋白可表達于寄生蟲類、魚類和哺乳動物(包括人)體內。既往有關旋毛蟲Tm的研究僅是證實其分子量及氨基酸序列,且發(fā)現(xiàn)了其對骨肉瘤細胞的抗腫瘤作用[25],其他的實驗則多以篩選鑒定特異性的診斷抗原或是尋找與其他蛋白質組間共同的免疫反應抗原為目的[20, 26],而旋毛蟲Tm對SCLC的抗腫瘤作用尚無報道。本課題組前期實驗證明,旋毛蟲ESPs處理NCI-H446細胞后,能抑制其細胞增殖、誘導細胞凋亡,造成S期阻滯等[9, 13]。旋毛蟲Tm作為旋毛蟲ESPs的蛋白組分之一[14],能否也發(fā)揮抗腫瘤作用,值得進一步研究。因此為探究旋毛蟲重組蛋白Tm的分子功能,及其對NCI-H446細胞的影響和潛在機制。我們以旋毛蟲Tm過表達的NCI-H446細胞為研究對象,采用TMT技術分析旋毛蟲Tm過表達NCI-H446細胞中蛋白質的變化情況。結果顯示,與NC組相比,瞬時轉染旋毛蟲Tm 48 h后,NCI-H446細胞中蛋白組分及表達發(fā)生顯著變化,共篩選出70個差異表達蛋白(包括34個上調蛋白和36個下調蛋白)。結果表明,旋毛蟲Tm對NCI-H446細胞蛋白組分有顯著的改變。

我們對DEPs進行GO分析,結果顯示,DEPs主要定位于轉錄延長因子復合物中。研究表明,轉錄延長因子是影響細胞基因組穩(wěn)定的重要分子,可以通過調控RNA聚合酶Ⅱ的延長和終止從而影響細胞周期[27],且在免疫微環(huán)境調控方面發(fā)揮巨大作用[28-29]。GO分析結果提示旋毛蟲Tm對NCI-H446細胞周期及免疫功能有潛在調控作用,而細胞周期及免疫功能的改變是影響腫瘤細胞生長的有效步驟之一。部分DEPs可以影響絲氨酸型內肽酶、蛋白激酶的活化。研究表明,內肽酶對多肽內部的切割和蛋白激酶對關鍵酶蛋白的激活在腫瘤細胞的凋亡、代謝、自噬等方面發(fā)揮重要作用[30-32]。除此之外,DEPs還涉及免疫球蛋白介導的細胞免疫應答反應等生物學過程。研究表明,免疫細胞的功能貫穿腫瘤細胞的生長,旋毛蟲能通過調控腫瘤細胞的免疫應答而發(fā)揮抗腫瘤作用[4]。由旋毛蟲Tm過表達引起的DEPs與腫瘤細胞的轉錄、蛋白質激活及免疫調控有關,這為旋毛蟲Tm影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展提供理論依據(jù)。

分析PPI網(wǎng)絡BC評分前5個蛋白:GAK、HIST2H3PS2、SYMPK、NDRG1、PKN2。GAK是細胞周期蛋白家族成員,在腫瘤細胞增殖、細胞周期調控以及影響線粒體功能等方面發(fā)揮作用[33-35]。最近有研究表明,在小鼠體內敲除GAK,會造成NF-κB p65的活性增加,而NF-κB p65在腫瘤細胞的增殖和遷移以及葡萄糖代謝的調控上發(fā)揮重要作用[36-37]。本實驗中GAK的表達量下調,提示旋毛蟲TM可能通過抑制GAK的表達影響腫瘤細胞的生長以及葡萄糖的利用。SYMPK是一種多聚腺苷酸化因子,在mRNA成熟,轉錄后調控以及和細胞間的緊密連接中發(fā)揮作用[38]。研究發(fā)現(xiàn),SYMPK的積累會促進細胞增殖和去分化[39]。也有研究表明,SYMPK參與不穩(wěn)定熱因子對細胞周期的調節(jié),其消耗減慢了S期進程[40]。由此推測,旋毛蟲Tm通過下調NCI-H446細胞中SYMPK的表達水平,影響HLF復合物的功能從而可能導致NCI-H446細胞S期阻滯。NDRG1是N-myc下游調節(jié)因子1,在腫瘤細胞增殖、遷移、糖代謝以及線粒體介導的細胞凋亡中發(fā)揮作用[41-42]。研究表明,沉默NDRG1會加劇缺氧誘導的線粒體碎片化[41]。有趣的是,沉默GAK基因也能改變線粒體形態(tài),研究表明GAK參與線粒體自噬過程,在線粒體碎片正確攝取到自噬體這一過程發(fā)揮重要作用[35]。由此可見,二者有著相似的生物學效應。但GAK和NDRG1之間的明確關系還需進一步實驗論證。除此之外,沉默NDRG1可以影響肝癌細胞的糖代謝[41]。我們通過Western blot檢測了NDRG1在旋毛蟲Tm過表達的NCI-H446細胞中的表達水平,與蛋白組學的結果一致,這提示旋毛蟲Tm可能會通過下調NDRG1影響NCI-H446細胞葡萄糖代謝以及線粒體功能。PKN2是絲蘇氨酸蛋白激酶家族成員,研究表明,沉默PKN2可以調節(jié)G2/M期進展和細胞分裂[43]。除此之外,PKN2在調節(jié)細胞周期進展、肌動蛋白細胞骨架組裝、細胞遷移、腫瘤細胞侵襲和轉錄激活信號過程中發(fā)揮作用[43-44]。本實驗發(fā)現(xiàn)旋毛蟲Tm可能通過下調NCI-H446細胞中PKN2的表達,這提示旋毛蟲Tm可能通過下調PKN2發(fā)揮其抗腫瘤作用。

綜上所述,旋毛蟲Tm影響NCI-H446細胞增殖、細胞周期、細胞代謝以及細胞免疫應答等生物學過程,這可能與旋毛蟲Tm下調NCI-H446細胞中GAK、H3-7、SYMPK、NDRG1、PKN2等蛋白的表達有關。

利益沖突:無

引用本文格式:王灝軒,朱瑩瑩,程露陽,等.基于蛋白組學分析旋毛蟲原肌球蛋白過表達對小細胞肺癌NCI-H446細胞蛋白組分的影響[J].中國人獸共患病學報,2023,39(8):758-765. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.082