約氏瘧原蟲(chóng)P.y17XL感染小鼠長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)譜特征分析

呂蔭宜,吳 雙,田 爽,廖國(guó)艷,杜云婷,陳 光

世界瘧疾報(bào)告指出,2021年約有2.47億人感染瘧疾,其中約619 000人死于嚴(yán)重并發(fā)癥[1]。盡管使用了包括青蒿素在內(nèi)的抗瘧藥物,嚴(yán)重瘧疾患者的死亡率仍然很高[2-3]。更深入的了解瘧疾感染宿主免疫系統(tǒng)和其他生理功能的平衡,對(duì)于制定有效干預(yù)措施以減少瘧疾相關(guān)發(fā)病率和嚴(yán)重并發(fā)癥至關(guān)重要[4]。然而,宿主與寄生蟲(chóng)之間的相互作用和共同進(jìn)化為安全有效的疫苗設(shè)計(jì)和預(yù)防耐藥提供了重要的背景知識(shí)。

長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn),宿主體內(nèi)所涉及的免疫信號(hào)通路以及疾病預(yù)后等過(guò)程中復(fù)雜的寄生蟲(chóng)-宿主相互作用途徑和方式是感染性疾病防控的基礎(chǔ)[5]。高通量測(cè)序技術(shù)恰恰提供了獲得大量、全面、系統(tǒng)的病原體-宿主相互作用信息,從而使系統(tǒng)研究病原體-宿主相互作用以獲得對(duì)其整體理解成為可能。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (lncRNA) 長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸,雖然不編碼蛋白質(zhì),但其可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。目前,轉(zhuǎn)錄組學(xué)領(lǐng)域中l(wèi)ncRNAs 在宿主防御中的作用機(jī)制研究尚少。僅有的部分研究表明,lncRNAs參與了宿主免疫功能和抗感染能力的調(diào)節(jié)[6]。關(guān)于瘧原蟲(chóng)感染宿主細(xì)胞時(shí)lncRNAs表達(dá)譜的變化特征無(wú)相關(guān)報(bào)道。

本研究利用二代測(cè)序技術(shù)分析了鼠源致死性約氏瘧原蟲(chóng)P.y17XL(Plasmodiumyoelii17XL)感染誘導(dǎo)的lncRNAs表達(dá)譜特征改變及其對(duì)瘧疾感染宿主免疫調(diào)節(jié)的影響,探討lncRNAs表達(dá)譜變化與瘧疾感染進(jìn)程和結(jié)局的相關(guān)性,確定瘧原蟲(chóng)-宿主相互作用調(diào)控抗瘧免疫的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑來(lái)源及分組 6～8周齡的雌性BALB/c小鼠購(gòu)自動(dòng)物研究所(中國(guó)北京)。動(dòng)物在 22 ℃～24 ℃和(50±5)% 濕度下保持12 h明暗循環(huán)。鼠源致死性約氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumyoelii17XL,P.y17XL)由Motomi Torii 博士(日本愛(ài)媛大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子寄生蟲(chóng)學(xué)系)提供。所有實(shí)驗(yàn)均按照當(dāng)?shù)貏?dòng)物倫理委員會(huì)的要求進(jìn)行。將小鼠隨機(jī)分為正常組和P.y17XL感染組。腹腔感染1×106P.y17XL寄生紅細(xì)胞,動(dòng)態(tài)進(jìn)行小鼠尾靜脈采血,制備薄血膜,Giemsa染色,監(jiān)測(cè)原蟲(chóng)血癥水平及生存率。固定時(shí)間點(diǎn)用異氟醚(0.6～0.8 L/min)麻醉小鼠取出脾臟,然后通過(guò)頸椎脫臼法處死所有小鼠。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)臺(tái)州學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào):TZXY2019-501)。所有動(dòng)物均按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》(1988.11.1)處死和人道對(duì)待。

1.2 LncRNA測(cè)序生物信息學(xué)分析

1.2.1 生物信息學(xué)分析流程 小鼠脾臟的RNA分離、文庫(kù)制備和測(cè)序在北京諾禾致源公司完成,流程如圖1。

圖1 生物信息學(xué)分析流程Fig.1 Process of bioinformatics analysis

1.2.2 LncRNAs差異表達(dá)譜及聚類分析 差異表達(dá)分析使用ballgown。從統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的角度上考慮,將不同類型轉(zhuǎn)錄本 (lncRNA, TUCP和mRNA)整體進(jìn)行差異分析,若分析中包含數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的lncRNA,進(jìn)一步將 lncRNA分為已知Annotated_lncRNA 和未知Novel_lncRNA。使用Bioconductor 軟件包,進(jìn)行層次聚類分析,調(diào)整后的P<0.05或P<0.05的轉(zhuǎn)錄本被指定為差異表達(dá),不同顏色的區(qū)域代表不同聚類分組信息,同組內(nèi)表達(dá)模式相近,可能具有相似的功能或參與相同的生物學(xué)過(guò)程。

1.2.3 LncRNA 共表達(dá)靶向mRNA預(yù)測(cè) LncRNAs沒(méi)有編碼基因的潛力,它們通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因發(fā)揮作用。目前,lncRNA與mRNA相互作用的潛在機(jī)制尚不清楚,lncRNA的生物學(xué)功能是通過(guò)其與蛋白質(zhì)編碼基因的共定位和共表達(dá)來(lái)預(yù)測(cè)的。采用Pearson相關(guān)系數(shù)法分析樣本間lncRNAs與mRNAs的相關(guān)性,取相關(guān)性絕對(duì)值大于0.95的mRNAs基因進(jìn)行功能富集分析預(yù)測(cè)lncRNAs的主要功能。

1.2.4 差異表達(dá) lncRNAs 靶基因GO和KEGG通路富集分析 LncRNAs通過(guò)調(diào)控mRNAs的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能。目前,lncRNAs與mRNAs相互作用的機(jī)制尚未明確,我們通過(guò)其與蛋白編碼基因的共表達(dá)相關(guān)性(co-expression)預(yù)測(cè) lncRNAs的生物學(xué)功能。將與共表達(dá)中差異表達(dá)的lncRNAs基因分別進(jìn)行GO和 KEGG富集分析和蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析。GoSeq R包用于差異表達(dá)基因或lncRNAs靶基因的GO富集分析,以糾正基因長(zhǎng)度偏差[7]。P<0.05的GO基因被認(rèn)為在差異表達(dá)基因中顯著富集。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用Bioconductor軟件包,進(jìn)行層次聚類分析,調(diào)整后的P<0.05或P<0.05的轉(zhuǎn)錄本被指定為差異表達(dá)。采用Pearson相關(guān)系數(shù)法分析數(shù)據(jù),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1P.y17XL感染BALB/c小鼠的感染率和生存率 如圖2所示,P.y17XL感染的BALB/c小鼠于感染后第6 d原蟲(chóng)血癥水平高達(dá)39%～49%,所有小鼠均死亡(圖 2A、2B)。

圖2 P.y17XL感染小鼠紅細(xì)胞感染率(A)與小鼠生存率(B)Fig.2 Parasitemia (A) and survival rate (B) of P.y17XL-infected BALB/c mice

2.2P.y17XL感染的BALB/c小鼠LncRNAs表達(dá)譜差異分析 我們使用火山圖分析了lncRNAs的差異表達(dá)(圖3A)。與正常對(duì)照組相比,P.y17XL感染的BALB/c小鼠中l(wèi)ncRNAs的表達(dá)上調(diào)132個(gè),下調(diào)159個(gè)。本實(shí)驗(yàn)采用聚類分析確定不同轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)模式,將不同實(shí)驗(yàn)組中不同轉(zhuǎn)錄本的FPKM值作為表達(dá)水平,進(jìn)行層次聚類分析。不同顏色用于表示來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)組的分組信息,同一組內(nèi)相似的表達(dá)模式可能具有相似的功能或參與相同的生物學(xué)過(guò)程,在本研究中,與正常對(duì)照組小鼠相比,P.y17XL感染后 lncRNAs表達(dá)譜發(fā)生顯著性差異表達(dá)(圖3B)。

圖3 火山圖(A)和熱圖(B)分析P.y17XL感染的BALB/c小鼠lncRNAs差異表達(dá)Fig.3 Differential expression of lncRNAs in BALB/c mice infected with P.y17XL, displayed as a volcano plot and heatmap

2.3 LncRNAs 靶向mRNAs預(yù)測(cè) 我們通過(guò)對(duì)lncRNAs共表達(dá)的mRNAs基因進(jìn)行功能富集分析,預(yù)測(cè)了瘧原蟲(chóng)感染相關(guān)的差異lncRNAs的主要功能(表1)。

2.4 差異表達(dá)lncRNAs靶基因的GO和KEGG富集分析 GO分析發(fā)現(xiàn)12個(gè)差異表達(dá) lncRNAs的富集,主要參與了“生物過(guò)程”、“細(xì)胞成分”和“分子功能”,且在“生物過(guò)程”和“細(xì)胞成分”中富集更為顯著,如分子功能的正向調(diào)節(jié)、磷代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)和囊泡的調(diào)節(jié)(圖4A)。KEGG通路富集分析進(jìn)一步確定上述差異表達(dá)lncRNAs的潛在生物學(xué)功能,預(yù)測(cè)相關(guān)免疫學(xué)信號(hào)通路和分子相互作用。氣泡圖顯示了富集途徑,其中包括瘧疾、TGF-β信號(hào)通路和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(圖 4B)。

圖4 P.y17XL感染的BALB/c小鼠差異表達(dá)lncRNA靶基因的GO(A)和KEGG(B)富集分析Fig.4 GO and KEGG enrichment analysis of differentially expressed lncRNA target genes in BALB/c mice infected with P.y17XL

2.5 差異表達(dá)的lncRNAs靶向免疫相關(guān)信號(hào)通路分析 根據(jù)KEGG分析結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)12個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs與總富集于瘧疾、TGF-β信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路的蛋白編碼基因共表達(dá)。為了進(jìn)一步闡明12個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs 在瘧疾中的調(diào)控功能,我們確定了通路圖中差異表達(dá)基因的分布(圖 5)。這些結(jié)果提示12個(gè)差異表達(dá)的lncRNA靶基因通過(guò)調(diào)節(jié)免疫相關(guān)信號(hào)通路參與瘧疾感染的發(fā)生發(fā)展。

3 討 論

瘧原蟲(chóng)在宿主體內(nèi)難以清除主要與逃避人體免疫系統(tǒng),并利用宿主的反應(yīng)作為生理信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)生命周期,使其迅速適應(yīng)宿主環(huán)境密切相關(guān)[8]。因此,寄生蟲(chóng)和宿主之間的相互作用對(duì)于寄生蟲(chóng)在生命周期的各個(gè)階段建立感染和毒力是至關(guān)重要的。LncRNAs參與了多個(gè)物種之間的相互作用,例如載體-宿主-病原體相互作用。 LncRNAs 既可以是載體/宿主衍生的,也可以是由病原體編碼的[9]。LncRNAs 作為基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,參與大多數(shù)細(xì)胞過(guò)程。為了探究瘧疾感染中l(wèi)ncRNAs表達(dá)譜特征,我們采用RNA-seq方法分析了P.y17XL感染的BALB/c小鼠差異表達(dá)的lncRNAs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)132個(gè)上調(diào)和159個(gè)下調(diào)的lncRNAs與瘧原蟲(chóng)感染相關(guān)(圖3)。作為廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)的新興介質(zhì),lncRNAs越來(lái)越受到關(guān)注。研究中檢測(cè)到了一部分寄生蟲(chóng)感染后參與調(diào)控免疫相關(guān)基因的lncRNAs。LncRNAs在寄生蟲(chóng)入侵宿主過(guò)程中具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。LncRNAs調(diào)節(jié)寄生蟲(chóng)和宿主中的基因轉(zhuǎn)錄、mRNA穩(wěn)定性和翻譯以及免疫反應(yīng)[10]。我們預(yù)測(cè)了這些差異表達(dá)lncRNAs的潛在靶向mRNAs,以便通過(guò)與蛋白質(zhì)編碼基因的共表達(dá)來(lái)分析lncRNAs的生物學(xué)功能。 GO和KEGG富集分析顯示,差異表達(dá)的lncRNAs參與了宿主免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖、代謝和疾病相關(guān)轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的調(diào)控,其中我們發(fā)現(xiàn)與瘧疾感染中TGF-β信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路相關(guān)的明顯差異表達(dá)的lncRNAs包括3個(gè)已知的和9個(gè)未知的lncRNAs,分別是ENSMUST00000146154.1、ENSMUST00000181191.1、ENSMUST00000202081.1、LNC_000258、LNC_000871、LNC_000962、LNC_002093、LNC_004354、LNC_006284、LNC_004518、LNC_004350和LNC_003730。雖然我們鑒定的一些lncRNAs可能是由其他因素誘導(dǎo)的,但它們?nèi)匀挥锌赡艹蔀榀懺x(chóng)感染誘導(dǎo)免疫過(guò)程中的關(guān)鍵因素。

研究發(fā)現(xiàn),瘧原蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的lncRNAs差異表達(dá)通過(guò)免疫相關(guān)信號(hào)通路改變了瘧疾感染后宿主的免疫反應(yīng)特征(圖5)。寄生蟲(chóng)和宿主之間蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是寄生蟲(chóng)持續(xù)存在于宿主體內(nèi)的前提條件[11]。在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中,寄生蟲(chóng)可以通過(guò)復(fù)雜的通信來(lái)調(diào)控宿主免疫系統(tǒng),從而使寄生蟲(chóng)能夠控制宿主的生理功能和免疫穩(wěn)態(tài),有利于寄生蟲(chóng)在宿主體內(nèi)的生存[12]。

圖5 P.y17XL感染小鼠的差異表達(dá)lncRNAs基因分布Fig.5 Distribution of differentially expressed lncRNA genes in P.y17XL infected mice

LncRNAs在免疫學(xué)領(lǐng)域研究是一個(gè)新興的熱點(diǎn),有限的研究發(fā)現(xiàn),lncRNAs作為一種新型調(diào)節(jié)劑,參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中的相關(guān)基因表達(dá)。LncRNAs通過(guò)一種高度譜系特異性的方式調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能和分化特征來(lái)調(diào)控染色質(zhì)、RNA和蛋白質(zhì)的作用[13]。本研究結(jié)果表明,瘧原蟲(chóng)感染顯著改變了宿主lncRNAs的表達(dá)譜特征,可能與瘧疾感染過(guò)程和感染結(jié)局密切相關(guān)。因此,lncRNAs是瘧原蟲(chóng)與宿主免疫系統(tǒng)交流的橋梁。在后續(xù)研究中,我們需要驗(yàn)證與免疫學(xué)相關(guān)基因表達(dá)相關(guān)的特定lncRNAs在瘧疾感染中的特異性功能。

利益沖突:無(wú)

引用本文格式:呂蔭宜,吳雙,田爽,等.約氏瘧原蟲(chóng)P.y17XL感染小鼠長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)譜特征分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2023,39(8):733-738. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.079