傷寒沙門菌hns基因缺失株的構(gòu)建及其對(duì)毒力基因表達(dá)的影響

顧麗萍,丁 超,徐國(guó)新,朱婉秋, 陳 龍

傷寒沙門菌(Salmonellaentericaserovar Typhi,S.Typhi)屬于腸桿菌科沙門菌屬,是一種革蘭陰性桿菌,常通過污染的食物或水進(jìn)入人體消化道,侵襲回腸與盲腸的腸道上皮細(xì)胞,破壞腸屏障,經(jīng)腸壁淋巴組織進(jìn)入腸系膜淋巴組織。傷寒沙門菌能逃避巨噬細(xì)胞殺傷,在巨噬細(xì)胞中存活,并經(jīng)淋巴及血液循壞擴(kuò)散至全身組織,引起系統(tǒng)性感染[1-2]。鼠傷寒沙門菌等其他沙門菌屬細(xì)菌感染人體僅產(chǎn)生消化道癥狀,傷寒沙門菌獨(dú)特的致病機(jī)制是由其基因組決定的,后者通過基因的水平轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer, HGT)獲得了大量的毒力基因,包括致病島1(SalmonellaPathogenicity Island 1,SPI-1)、致病島2(SPI-2)等沙門菌屬普遍攜帶的毒力基因[3],以及致病島7等傷寒沙門菌特有的毒力基因[4]。

HNS(histone-like nucleoid-structuring protein)是一種擬核結(jié)構(gòu)蛋白,其編碼基因hns大小414 bp,廣泛存在于多種革蘭陰性桿菌中,參與細(xì)菌基因組裝配并調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄表達(dá),通過水平轉(zhuǎn)移的毒力基因往往被HNS抑制[5-6]。基因的水平轉(zhuǎn)移賦予了致病菌新的毒力、耐藥與代謝方式[7]。但外源性毒力基因的過度表達(dá)會(huì)破壞細(xì)菌代謝平衡,不利于細(xì)菌生長(zhǎng)[8-9]。HNS等負(fù)向調(diào)控因子通過沉默毒力基因,抑制其表達(dá),從而緩沖這些基因過分表達(dá)帶來的不利影響[10]。鼠傷寒沙門菌中的研究顯示,敲除hns基因后,致病島1和致病島2上的毒力基因表達(dá)上調(diào)[11-12]。hilA、invF和ssrB、ssaB分別是沙門菌屬普遍存在的SPI-1和SPI-2上的毒力基因,在傷寒沙門菌致病過程中發(fā)揮重要作用;catB、pltB是傷寒沙門菌特有的SPI-7上的毒力基因,編碼傷寒毒素(typhiod toxin)[13]。本研究中,我們擬敲除傷寒沙門菌hns基因,觀察毒力基因表達(dá)差異,從而分析HNS對(duì)傷寒沙門菌毒力基因的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 傷寒沙門菌GIFU10007株(野生型,記為WT)、質(zhì)粒pMGB151、pKD4、pKD46、pCP20均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;限制性內(nèi)切酶(BamH I、SalI、EcoR I)、T4 DNA連接酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司公司;熱啟動(dòng)DNA聚合酶預(yù)混液購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;蛋白胨、瓊脂粉和酵母提取物購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司;L-阿拉伯糖、蔗糖、卡那霉素、氨芐西林購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;質(zhì)粒提取試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。

1.1.3 主要儀器 凝膠成像儀Gel Doc XR+、電轉(zhuǎn)化穿孔儀Gene pulser Ⅱ、水平凝膠電泳儀與PCR擴(kuò)增儀s1000購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司;超微量分光光度計(jì)Nanodrop與熒光定量PCR擴(kuò)增儀ABI DX購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司;分光光度計(jì)BioPhotometer D30購(gòu)自德國(guó)eppendorf公司。

1.2 方 法

1.2.1 自殺質(zhì)粒法敲除hns通過兩輪PCR擴(kuò)增得到缺失了部分hns編碼序列的同源片段:煮沸法提取WT基因組,第1輪PCR以WT基因組(約20 ng/μL)為模板,上游引物hns-A、下游引物hns-B擴(kuò)增hns編碼序列上游同源臂,上游引物hns-C、下游引物hns-D擴(kuò)增下游同源臂;第2輪PCR以hns上下游同源臂PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(約20 ng/μL)為模板,上游引物hns-A,下游引物hns-D,擴(kuò)增得到缺失了部分hns編碼序列的同源片段。同源片段與pMGB151質(zhì)粒經(jīng)BamH I酶切后,T4連接酶連接制備重組自殺質(zhì)粒。

重組自殺質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入WT感受態(tài),電轉(zhuǎn)產(chǎn)物加入37 ℃溫浴的LB肉湯,37 ℃復(fù)蘇1 h后涂布于氨芐西林抗性平板,使用重組自殺質(zhì)粒的氨芐西林抗性篩選得到陽(yáng)性克隆。重組自殺質(zhì)粒在蔗糖壓力下會(huì)迫使其所攜帶的片段與細(xì)菌基因組發(fā)生同源重組。根據(jù)這一特性使用含5%蔗糖的LB平板進(jìn)行陽(yáng)性克隆傳代,并使用引物hns-A/hns-D,經(jīng)PCR進(jìn)行重組鑒定。

1.2.2 RED重組法敲除hns質(zhì)粒pKD46是一個(gè)溫度敏感型質(zhì)粒,高于37 ℃時(shí)易丟失,經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)后表達(dá)Gam、Bet和Exo 3個(gè)λ噬菌體重組酶。pKD46導(dǎo)入WT獲得受體菌,pKD4攜帶卡那霉素抗性基因盒,以質(zhì)粒pKD4(約20 ng/μL)為模板,上游引物hns-RED-F、下游引物hns-RED-R,PCR擴(kuò)增得到含卡那霉素抗性基因盒的hns同源打靶片段。

將含有pKD46的傷寒沙門菌受體菌接種,30 ℃培養(yǎng)過夜,1∶100轉(zhuǎn)接于20 mL LB培養(yǎng)液中(氨芐西林濃度為100 mg/mL),30 ℃培養(yǎng)至D (600 nm)≈0.2時(shí)加入L-阿拉伯糖(30 mmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)1 h,使得pKD46攜帶的重組酶充分表達(dá)。菌液冰上預(yù)冷后,離心收菌,10%甘油洗滌3遍,制備感受態(tài)細(xì)胞。

將同源打靶片段與感受態(tài)細(xì)胞混勻,利用電穿孔儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。電擊后加入37 ℃溫浴的 LB肉湯,37 ℃復(fù)蘇1 h后涂布于卡那霉素抗性平板(卡那霉素濃度50 mg/mL),37 ℃培養(yǎng)16 h后,使用上游引物hns-check-F、下游引物hns-check-R,PCR法鑒定長(zhǎng)出的卡那霉素抗性克隆。

1.2.3 RED重組法敲除phoPQ-hnsphoPQ的敲除方法同上,以WT為模板,上游引物phoPQ-RED-F、下游引物phoPQ-RED-R,擴(kuò)增同源打靶片段,與感受態(tài)細(xì)胞混合后進(jìn)行電轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于卡那霉素抗性平板(卡那霉素濃度50 mg/mL),37 ℃培養(yǎng)16 h后,使用上游引物phoPQ-check-F、下游引物phoPQ-check-R,PCR法鑒定長(zhǎng)出的卡那霉素抗性克隆。

卡那霉素抗性基因的消除:將質(zhì)粒pCP20導(dǎo)入篩選出的抗性克隆,30 ℃培養(yǎng)8 h后,42 ℃培養(yǎng)過夜誘導(dǎo)pCP20表達(dá)FLP重組酶,FLP重組酶可識(shí)別FRT位點(diǎn),刪除同源打靶片段上FRT間的抗性片段。過夜培養(yǎng)菌液分別接種于無抗性平板與卡那霉素抗性平板,挑選無抗性的克隆,PCR方法進(jìn)一步驗(yàn)證,得到無抗性的phoPQ缺失株(記為ΔphoPQ)。ΔphoPQ進(jìn)一步使用RED重組法敲除hns,得到phoPQ與hns的雙缺失株(記為ΔphoPQ-hns)。

1.2.4 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定 各挑取WT、ΔphoPQ和ΔphoPQ-hns的單菌落,分別接種于2 mL的LB肉湯中,37 ℃、250 r/min培養(yǎng)12～14 h后,將菌株種子液稀釋到OD(600 nm)=1.0,取200 μL菌液1∶100轉(zhuǎn)接到新鮮的20 mL的LB肉湯中,37 ℃ 250 r/min繼續(xù)培養(yǎng),每隔1 h檢測(cè)一次OD(600 nm)值至12 h。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的OD(600 nm)平均值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量RT-PCRΔphoPQ與ΔphoPQ-hns保種液接種于LB肉湯培養(yǎng),37 ℃、250 r/min培養(yǎng)12～14 h后,1∶100轉(zhuǎn)接于新鮮的LB肉湯,37 ℃、250 r/min培養(yǎng)至OD(600 nm)≈0.4,收集菌體。使用Trizol提取細(xì)菌總RNA,N6隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用ABI DX做實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析,以5s為內(nèi)參基因,利用經(jīng)典的2-ΔΔCt進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 本研究所用引物Tab.1 Oligonucleotide primers used in this study

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,t檢驗(yàn)分析ΔphoPQ與ΔphoPQ-hns中的靶基因mRNA水平差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 自殺質(zhì)粒法及RED重組法敲除傷寒沙門菌hns成功構(gòu)建了含hns同源短片段的重組自殺質(zhì)粒,并導(dǎo)入WT感受態(tài)細(xì)胞中,使用PCR法鑒定同源重組結(jié)果。結(jié)果如圖1所示,5%蔗糖壓力下傳代3次以上,WT基因組帶有的長(zhǎng)片段與重組自殺質(zhì)粒帶有的同源短片段共存,顯示陽(yáng)性克隆在5%蔗糖壓力下無法完成同源重組,表明傷寒沙門菌hns無法被替換敲除。

圖1 自殺質(zhì)粒法敲除hns陽(yáng)性克隆篩選Fig.1 Positive clone screening for hns knockout with the suicide plasmid method

hns同源打靶片段經(jīng)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入RED重組WT感受態(tài)細(xì)胞后,涂布卡那霉素抗性平板,無克隆生長(zhǎng)(重復(fù)3次以上),表明RED重組法也無法成功敲除傷寒沙門菌hns。

2.2 傷寒沙門菌phoPQ-hns雙基因敲除 我們嘗試?yán)肦ED重組法先敲除phoPQ,降低毒力基因表達(dá)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步敲除hns(圖2A)。結(jié)果顯示:phoPQ被成功敲除(記為ΔphoPQ),WT基因組phoPQ編碼區(qū)域被較短的同源序列替換;以ΔphoPQ為受體菌,再行RED重組敲除hns,成功制備ΔphoPQ-hns雙基因缺失株,WT基因組hns編碼區(qū)域被較長(zhǎng)的含有卡那霉素抗性基因的同源片段所替換(圖2B)。經(jīng)實(shí)時(shí)定量RT-PCR驗(yàn)證,與ΔphoPQ相比,ΔphoPQ-hns中檢測(cè)不到hns的轉(zhuǎn)錄表達(dá)(圖2C)。生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與ΔphoPQ相比,ΔphoPQ-hns生長(zhǎng)明顯緩慢,WT與ΔphoPQ的生長(zhǎng)曲線基本一致。表明,hns的缺失影響細(xì)菌生長(zhǎng)(圖3)。

注:A.RED重組制備phoPQ-hns雙基因敲除示意圖,①phoPQ同源序列被卡那霉素抗性基因片段替換;②FLP重組酶識(shí)別FRT位點(diǎn),消除卡那霉素抗性基因;③hns同源序列被卡那霉素抗性基因片段替換。B.驗(yàn)證phoPQ-hns雙基因敲除。M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1.WT; 2.phoPQ RED重組卡那霉素抗性克隆; 3.phoPQ RED重組消除抗性基因; 4.NC陰性對(duì)照; 5.WT; 6.ΔphoPQ; 7.hns RED重組卡那霉素抗性克隆; 8.NC陰性對(duì)照。C.實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)ΔphoPQ與ΔphoPQ-hns的hns表達(dá)。圖2 傷寒沙門菌phoPQ-hns雙基因敲除的制備與驗(yàn)證Fig.2 Preparation and validation of phoPQ-hns double gene deletion in Salmonella Typhi

圖3 傷寒沙門菌ΔphoPQ-hns生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of Salmonella Typhi ΔphoPQ-hns

2.3 HNS對(duì)傷寒沙門菌部分毒力基因表達(dá)的調(diào)控作用 實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示,與ΔphoPQ相比,ΔphoPQ-hns中hilA、invF、ssrB、ssaB、cdtB、pltB等靶基因的mRNA水平出現(xiàn)明顯升高,分別為19.97倍、16.12倍、64.89倍、71.41倍、133.25倍和650.5倍,見圖4,表明HNS負(fù)調(diào)控以上毒力基因表達(dá)。

圖4 ΔphoPQ與ΔphoPQ-hns的毒力基因mRNA表達(dá)差異Fig.4 Differences in mRNA expression of virulence genes between ΔphoPQ and ΔphoPQ-hns

3 討 論

hns編碼產(chǎn)物HNS,是一種擬核相關(guān)DNA結(jié)合蛋白,除具有壓縮染色質(zhì)、壓實(shí)擬核的功能外,還參與多種基因表達(dá)調(diào)控。HNS可形成激活型二聚體,像鉗子一樣夾住DNA鏈,阻礙相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,HNS對(duì)DNA的結(jié)合無序列特異性,優(yōu)先結(jié)合GC%低的區(qū)域(富AT序列)[14]。本研究利用自殺質(zhì)粒法與RED重組法敲除傷寒沙門菌hns,結(jié)果顯示,兩種方法均無法成功敲除hns。重組自殺質(zhì)粒在蔗糖壓力下,截短的hns編碼序列短片段無法替換基因組同源序列;RED重組法中,攜帶卡那霉素抗性基因的hns同源打靶片段同樣無法替換基因組同源序列。以上結(jié)果表明,傷寒沙門菌存在抵抗hns丟失的機(jī)制,hns可能對(duì)傷寒沙門菌的生長(zhǎng)至關(guān)重要。

致病性革蘭陰性桿菌通過“水平轉(zhuǎn)移”獲得了大量的外源毒力基因,這些基因GC%明顯低于宿主菌基因組。外源基因賦予宿主菌獨(dú)特的致病機(jī)制的同時(shí)也帶來健康損害的代價(jià),HNS通過沉默外源性毒力基因,降低了后者過度表達(dá)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的損害。鼠疫耶爾森菌[15]、副溶血弧菌[14]、大腸埃希菌[16]中的hns均能被敲除。鼠傷寒沙門菌中,在突變RpoS以降低毒力基因表達(dá)的基礎(chǔ)上,可成功敲除hns,hns缺失株傳代30代后,出現(xiàn)致病島1、致病島2大片段的突變,表明鼠傷寒沙門菌通過突變毒力基因的方式抵消hns缺失帶來的損害[10]。

與鼠傷寒沙門菌基因組相比,除了致病島1、致病島2等毒力基因外,傷寒沙門菌還具備獨(dú)特的致病島7,后者編碼Vi莢膜、傷寒毒素(typhiod toxin)等致病因子[13]。PhoPQ是傷寒沙門菌重要的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng),參與激活多種毒力基因[17]。本研究通過先敲除phoPQ,緩沖細(xì)菌健康損害的基礎(chǔ)上,再敲除hns,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,敲除phoPQ后,hns可被成功敲除。ΔphoPQ與ΔphoPQ-hns的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步證實(shí)hns對(duì)傷寒沙門菌生長(zhǎng)的影響。

實(shí)時(shí)定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HNS對(duì)毒力基因hliA、invF、ssrB、ssaB、pltB、cdtB都有抑制作用。hliA、invF、ssrB、ssaB是沙門菌屬共有的毒力基因,其中hliA、invF位于致病島1,編碼產(chǎn)物是T3SS-1的重要組成部分,參與傷寒沙門菌侵襲宿主細(xì)胞、引起炎癥等致病過程;ssrB、ssaB位于致病島2,SsrB是重要的調(diào)節(jié)因子,SsaB是T3SS-2的重要組分[11-12];pltB、cdtB位于致病島7,是傷寒沙門菌特有的毒力基因,編碼產(chǎn)物生成傷寒毒素。表明HNS對(duì)傷寒沙門菌的毒力基因具有廣泛抑制作用。

HNS通過與富AT序列結(jié)合,沉默外源性基因的非必要表達(dá)[6]。PhoPQ是腸桿菌科細(xì)菌廣泛存在的雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),由跨膜的組氨酸蛋白激酶PhoQ和胞內(nèi)的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白PhoP組成,PhoQ感受到胞外信號(hào)(如低Mg2+、H+、抗菌肽等),激活PhoP磷酸化,調(diào)控下游基因表達(dá)[18]。磷酸化的PhoP可上調(diào)多種外源性毒力基因的表達(dá),解除HNS對(duì)外源基因的沉默,從而形成“沉默-反沉默”的基因調(diào)控機(jī)制[19]。本研究在敲除phoPQ以降低毒力基因表達(dá)的基礎(chǔ)上,成功敲除hns,為后續(xù)研究HNS的調(diào)控作用建立了基礎(chǔ)。

利益沖突:無

引用本文格式:顧麗萍,丁超,徐國(guó)新,等.傷寒沙門菌hns基因缺失株的構(gòu)建及其對(duì)毒力基因表達(dá)影響[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2023,39(8):727-732. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.078