代謝工程改造微生物利用甲酸研究進(jìn)展

程真真，張健，高聰，劉立明，陳修來

（1 江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122； 2 江南大學(xué)，食品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

傳統(tǒng)化工行業(yè)依賴于化石燃料或糖類資源，在實(shí)際生產(chǎn)過程中不僅產(chǎn)生了大量溫室氣體，對(duì)環(huán)境造成了巨大壓力，而且還會(huì)與食品行業(yè)競(jìng)爭(zhēng)，影響糧食安全［1?2］。近年來，隨著微生物細(xì)胞工廠的開發(fā)與應(yīng)用，二氧化碳（CO2）、一氧化碳（CO）、甲烷（CH4）、甲醇與甲酸等一碳資源的生物煉制備受關(guān)注。相比于化石燃料與傳統(tǒng)碳源，一碳資源天然儲(chǔ)備豐富且生產(chǎn)成本相對(duì)低廉，因此，一碳資源有望成為下一代原料用于制備高附加值化學(xué)品［3?5］，如生物能源［6?7］、生物基材料［8?9］、生物醫(yī)藥［10?11］等，從而推動(dòng)碳資源的可持續(xù)循環(huán)利用。CO2、CO 與CH4作為氣態(tài)底物，在氣液傳質(zhì)上具有一定的局限性［4，12］，不利于微生物的細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成；甲醇與甲酸作為液態(tài)底物，很好地繞過了這些限制條件［13］。甲醇作為一種大宗化學(xué)品，產(chǎn)能豐富且生產(chǎn)成本低，但是受到易燃性的限制，甲醇在微生物培養(yǎng)過程中的安全性明顯低于甲酸［14］。因此，甲酸的工業(yè)應(yīng)用逐步展現(xiàn)出了巨大的潛能［15］，從而凸顯了甲酸生物經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)。

甲酸生物經(jīng)濟(jì)的發(fā)展關(guān)鍵在于甲酸營(yíng)養(yǎng)型微生物的構(gòu)建與應(yīng)用。目前，甲酸營(yíng)養(yǎng)型微生物的構(gòu)建方式主要有兩種：①優(yōu)化天然甲酸利用微生物，提高甲酸代謝能力。例如，在鉤蟲貪銅菌（Cupriavidus necator）中，采用低能耗的異源還原性甘氨酸途徑取代高能耗的本源卡爾文循環(huán)，有效提高了菌株的甲酸代謝潛力［16］。雖然天然甲酸利用微生物具有一定的甲酸代謝基礎(chǔ)，能夠進(jìn)行代謝工程改造，但是天然甲酸利用微生物的分子遺傳學(xué)操作工具與方法相對(duì)較少，從而在很大程度上限制了其改造與應(yīng)用的空間。②構(gòu)建人工甲酸利用微生物，人工賦予模式微生物甲酸代謝能力。例如，通過在大腸桿菌（Escherichia coli）中引入還原性甘氨酸途徑與能量再生模塊，使得工程菌株能夠利用甲酸為唯一碳源和能源進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)［17?18］。類似地，通過在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中強(qiáng)化還原性甘氨酸途徑，獲得的工程菌株可以同化利用甲酸與CO2［19］。相比于天然甲酸利用微生物，模式微生物的代謝工程改造難度小且應(yīng)用范圍廣，但是卻面臨甲酸代謝能力不足與生長(zhǎng)速率偏低等問題，因此，需要采用合適的代謝工程策略進(jìn)行相應(yīng)的改造與優(yōu)化，提高甲酸的利用效率。

本綜述圍繞微生物同化利用甲酸過程中的關(guān)鍵問題，從甲酸利用的微生物、代謝路徑和代謝工程策略三個(gè)方面，闡述了微生物同化利用甲酸的改造與優(yōu)化策略，并展望了甲酸生物經(jīng)濟(jì)進(jìn)一步發(fā)展與應(yīng)用的方向。

1 甲酸利用的微生物

甲酸生物經(jīng)濟(jì)的發(fā)展有利于推動(dòng)一碳生物煉制的工業(yè)化進(jìn)程，現(xiàn)階段甲酸生物經(jīng)濟(jì)的首要任務(wù)是開發(fā)出能夠高效利用甲酸的微生物。然而，在提高微生物的甲酸利用效率方面仍然存在很多挑戰(zhàn)，如：天然甲酸利用微生物的甲酸代謝機(jī)制研究尚不完善、代謝工程改造的微生物甲酸耐受性偏低等。因此，需要在解析微生物甲酸代謝機(jī)制的基礎(chǔ)上，結(jié)合代謝改造策略進(jìn)一步強(qiáng)化微生物甲酸耐受性，提高微生物的甲酸利用效率。

1.1 天然甲酸利用微生物

天然甲酸利用微生物廣泛存在于各種環(huán)境中，能夠通過多種代謝途徑，以甲酸為碳源或能源進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)（圖1，表1）。近年來，隨著甲酸生物經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，天然甲酸利用微生物展現(xiàn)出了廣闊的開發(fā)空間與獨(dú)特的研究?jī)r(jià)值，不僅可以進(jìn)行代謝改造提高甲酸利用效率與目標(biāo)代謝物生產(chǎn)能力，而且還能借鑒所具有的天然甲酸利用路徑，拓展模式微生物的代謝工程改造空間。

表1 天然甲酸利用微生物Table 1 Natural formate?utilizing microorganisms

圖1 天然甲酸利用微生物CBB cycle-Calvin?Benson?Bassham循環(huán)；THF-四氫葉酸；THMPT-四氫甲基蝶呤Fig. 1 Natural formate?utilizing microorganismsCBB cycle-Calvin?Benson?Bassham cycle; THF-tetrahydrofolate; THMPT-tetrahydromethanopterin

1.1.1 產(chǎn)乙酸菌

產(chǎn)乙酸菌（acetogen）為專性厭氧微生物，可以利用還原性乙酰輔酶A途徑進(jìn)行CO2固定，在完成終端電子接受和能量代謝的同時(shí)，將CO2轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A［20］［圖1（a）］。甲酸作為還原性乙酰輔酶A 途徑中的重要代謝物之一，對(duì)于產(chǎn)乙酸菌的生長(zhǎng)與代謝具有重要意義，可以被多種產(chǎn)乙酸菌同化利用，如伍氏醋酸桿菌（Acetobacterium woodii）、永達(dá)爾梭菌（Clostridium ljungdahlii）和熱醋穆爾氏菌（Moorella thermoacetica）等［20，37］。近年來，隨著甲酸營(yíng)養(yǎng)型微生物的開發(fā)與研究，產(chǎn)乙酸菌可天然利用甲酸的這一特征引起了研究人員的極大重視。其中，以A. woodii作為產(chǎn)乙酸菌模式菌株，通過定量生理學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝模型計(jì)算等策略，分析了菌株的甲酸利用水平與甲酸代謝路徑，結(jié)果表明A. woodii具有良好的單一營(yíng)養(yǎng)/混合營(yíng)養(yǎng)型甲酸利用能力與能量利用效率［21?22］，從而充分證明了A. woodii作為甲酸天然利用微生物所具有的巨大應(yīng)用潛能。

1.1.2 產(chǎn)甲烷菌

產(chǎn)甲烷菌（methanogen）是一種專性厭氧的古菌，可將CO2、甲酸、乙酸或含甲基的簡(jiǎn)單化合物等還原為CH4，并從中獲取能量［23］［圖1（b）］。根據(jù)代謝底物類型的不同，可將產(chǎn)甲烷菌分為氫營(yíng)養(yǎng)型、甲基營(yíng)養(yǎng)型和乙酸營(yíng)養(yǎng)型［38］。其中，氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌具有最高的產(chǎn)能效率［39］，部分氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌可以利用甲酸作為主要的電子供體，將CO2還原為CH4進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)［38，40?41］。氫營(yíng)養(yǎng)型海沼甲烷球菌（Methanococcus maripaludis）作為產(chǎn)甲烷菌的模式菌株，不僅能利用氫氣與甲酸作為電子供體，還能以高轉(zhuǎn)化率將甲酸轉(zhuǎn)化為氫氣［24］。目前，基于M. maripaludis已經(jīng)開發(fā)出了一系列分子遺傳學(xué)操作工具與技術(shù)［25?26］，如基于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)［42］與CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)［43］的基因編輯工具，充分顯示出了產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行代謝工程改造的潛能與應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

1.1.3 硫酸鹽還原菌

硫酸鹽還原菌（sulfate?reducing bacteria，SRB）為專性厭氧微生物，能夠以有機(jī)物、氫氣等作為電子供體，以硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽等作為末端電子受體，通過異化作用獲取能量來進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)［圖1（c）］。部分SRB可以利用甲酸作碳源或電子供體，如普通脫硫弧菌（Desulfovibrio vulgaris）［44］、巴氏脫硫弧菌（Desulfovibrio baarsii）［45］、脫硫脫硫弧菌（Desulfovibrio desulfuricans）［46］和巴氏脫硫菌（Desulfarculus baarsii）［47］等。在SRB 可利用的眾多底物中，甲酸被認(rèn)為是生物制氫的最佳底物之一［27?28］。以D. vulgaris作為SRB 的模式菌株，驗(yàn)證了以甲酸為底物驅(qū)動(dòng)產(chǎn)氫的可行性［27，29，48］，證明了SRB 在生物制氫方面所具有的優(yōu)勢(shì)與未來發(fā)展空間。

1.1.4 甲基桿菌

甲基桿菌屬（Methylobacterium）細(xì)菌為好氧或兼性厭氧的甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物，能夠在甲酸、甲醛、甲醇或甲胺等一碳化合物上進(jìn)行生長(zhǎng)，也能利用二碳、三碳和四碳等多碳化合物進(jìn)行生長(zhǎng)［30］［圖1（d）］。扭脫甲基桿菌AM1（Methylobacterium extorquensAM1）為甲基桿菌的模式菌株，能夠利用甲醇作唯一碳源和能源。以往關(guān)于M. extorquensAM1 的研究，多集中于以甲醇為底物生產(chǎn)聚羥基丁酸酯、有機(jī)酸和精細(xì)化學(xué)品等［49］。近年來，隨著甲酸為底物的優(yōu)勢(shì)逐步凸顯出來，M. extorquensAM1 可通過絲氨酸循環(huán)利用甲酸的特性也引起了研究人員的重視［31］。特別是對(duì)M. extorquensAM1的5，10?次甲基四氫葉酸環(huán)化酶的研究，為甲酸同化分子機(jī)制的研究奠定了生物化學(xué)基礎(chǔ)［50］。另外，通過甲醇與甲酸的耦合利用，提高了M. extorquensAM1的甲羥戊酸產(chǎn)量、產(chǎn)率和甲醇消耗速率［32］，充分體現(xiàn)了M. extorquensAM1 代謝利用甲酸的優(yōu)勢(shì)，為一碳化合物轉(zhuǎn)化為高附加值化學(xué)品提供了一種切實(shí)可行的途徑。

1.1.5 其他天然微生物

除了上述天然甲酸利用微生物之外，近年來研究人員逐步分離與鑒定出更多新的天然甲酸利用微生物，如能夠通過絲氨酸循環(huán)同化甲酸合成單細(xì)胞蛋白的共生副球菌MA5 （Paracoccus communisMA5）［51］，這在一定程度上拓寬了甲酸利用微生物的應(yīng)用范圍。另外，除了還原性乙酰輔酶A 途徑、絲氨酸循環(huán)以及還原性甘氨酸途徑之外，部分天然甲酸利用微生物還可以通過還原性磷酸戊糖循環(huán)利用甲酸，如C. necatorH16［33?34］、苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）［52］、亞硝酸鹽氧化細(xì)菌（Nitrolancetus hollandicus）［53］、嗜二氧雜環(huán)乙烷假諾卡氏菌CB1190（PseudonocardiadioxanivoransCB1190）［54］和嗜硫偶氮螺旋菌（Azospirillum thiophilum）［55］等，它們都具有甲酸脫氫酶，能夠在甲酸氧化為CO2的同時(shí)產(chǎn)生還原力，并通過還原性磷酸戊糖循環(huán)固定CO2進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)與代謝［圖1（e）］。C. necatorH16作為這一類型微生物的模式菌株，已經(jīng)開發(fā)出一系列相應(yīng)的分子遺傳學(xué)操作工具與技術(shù)，并結(jié)合代謝工程改造策略將其應(yīng)用于開發(fā)微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)多種代謝產(chǎn)物［35?36］，極大地拓寬了生物固碳與甲酸生物經(jīng)濟(jì)的發(fā)展空間。

1.2 代謝工程改造的微生物

天然甲酸利用微生物具有同化甲酸的代謝途徑，可以直接將甲酸作為碳源或能源。然而，大多數(shù)天然甲酸利用微生物并不像E. coli、S. cerevisiae等模式微生物適用于代謝工程改造與工業(yè)化生產(chǎn)。與代謝工程改造模式微生物相比，天然甲酸利用微生物仍然存在一定的不足，如：對(duì)環(huán)境條件更為敏感、培養(yǎng)條件更加復(fù)雜、生長(zhǎng)速度較為緩慢等。此外，由于天然甲酸利用微生物的代謝機(jī)制研究尚不清晰，因此對(duì)其進(jìn)行代謝工程改造仍然存在挑戰(zhàn)。相比而言，E. coli、S. cerevisiae等模式微生物（圖2，表2）的研究更加充分，不僅更適用于代謝工程改造與工業(yè)化生產(chǎn)，而且更有利于甲酸生物經(jīng)濟(jì)的進(jìn)一步發(fā)展。

表2 代謝工程改造的微生物Table 2 Metabolically engineered microorganisms

圖2 代謝工程改造的微生物PAOX1-醇氧化酶啟動(dòng)子；THF-四氫葉酸Fig. 2 Metabolically engineered microorganismsPAOX1-alcohol oxidase 1 promoter; THF-tetrahydrofolate

1.2.1 大腸桿菌

E. coli作為常用的原核模式微生物，近年來已有多項(xiàng)研究聚焦于改造E. coli利用甲酸。在這些研究中，通過構(gòu)建甲酸利用路徑［圖2（a）］，并結(jié)合代謝工程策略與實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化等策略，使得E. coli能夠利用甲酸（或甲酸與CO2）進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)［56］，充分體現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)室改造模式微生物利用甲酸的可行性。然而，這種甲酸營(yíng)養(yǎng)型E. coli的生長(zhǎng)速率與細(xì)胞密度顯著低于使用常規(guī)碳源培養(yǎng)的E.coli，主要原因在于甲酸營(yíng)養(yǎng)型E. coli對(duì)甲酸的同化效率與耐受性均偏低。

1.2.2 釀酒酵母

相比于E. coli，S. cerevisiae作為真核模式微生物，雖然生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，但是其擁有高效的內(nèi)源性NAD+依賴型甲酸脫氫酶，因此對(duì)甲酸的耐受性更高。此外，已有研究表明S. cerevisiae中存在還原性甘氨酸途徑所需的酶，將該途徑所涉及的酶進(jìn)行強(qiáng)化表達(dá)之后，能夠?qū)崿F(xiàn)S. cerevisiae同化利用甲酸與CO2［圖2（b）］，并且在1～500 mmol/L甲酸范圍內(nèi)生長(zhǎng)速率均能保持恒定［19］，這表明S.cerevisiae具有成為高效利用甲酸宿主的潛力。

1.2.3 其他微生物

甲酸營(yíng)養(yǎng)型微生物的開發(fā)與應(yīng)用在一碳生物煉制方面展現(xiàn)出了巨大潛能。除了E. coli與S.cerevisiae之外，通過改造其他模式微生物進(jìn)行甲酸代謝，有利于開發(fā)更高效的甲酸營(yíng)養(yǎng)型微生物細(xì)胞工廠。巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）作為天然的甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母，在一碳生物煉制方面有望成為代謝工程改造的關(guān)鍵底盤微生物。甲醇作為誘導(dǎo)物，可以觸發(fā)P. pastoris的醇氧化酶（alcohol oxidase 1，AOX1）啟動(dòng)子PAOX1所調(diào)控的異源蛋白表達(dá)。然而，由于甲醇具有一定的毒性、易燃性和爆炸性，從而限制了P. pastoris在食品與生物醫(yī)藥等產(chǎn)業(yè)的大規(guī)模應(yīng)用。與甲醇相比，甲酸被認(rèn)為是更安全的PAOX1的誘導(dǎo)物［68］。利用甲酸作為誘導(dǎo)物，可以增強(qiáng)P. pastoris木聚糖酶的表達(dá)［圖2（c）］，體現(xiàn)了該系統(tǒng)在異源蛋白表達(dá)與安全性方面的潛力［68?69］。此外，通過在惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）中引入異源的還原性甘氨酸途徑［圖2（d）］，并結(jié)合模塊化工程、代謝工程改造與實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化等多項(xiàng)策略，獲得了能夠同化利用甲酸的工程菌株［70］，從而證明了P. putida在甲酸利用方面的潛能。

2 甲酸利用的代謝路徑

甲酸代謝路徑是甲酸營(yíng)養(yǎng)型微生物利用甲酸的基礎(chǔ)，根據(jù)甲酸代謝路徑的來源與特點(diǎn)可分為3 類：天然的甲酸利用路徑、重構(gòu)與優(yōu)化的甲酸利用路徑以及人工設(shè)計(jì)的甲酸利用路徑。然而，天然的甲酸利用路徑存在明顯的應(yīng)用局限性，人工設(shè)計(jì)的甲酸利用路徑則面臨路徑酶催化效率低等問題。因此，現(xiàn)階段甲酸代謝路徑的研究仍聚焦于天然甲酸利用路徑的重構(gòu)與優(yōu)化。

2.1 天然甲酸利用路徑

根據(jù)微生物利用甲酸的方式，可將天然甲酸利用路徑分為2類（圖3）：①甲酸分子并不直接參與到細(xì)胞代謝中，而是在氧化為CO2過程中產(chǎn)生還原力，從而為微生物的生長(zhǎng)與固碳代謝提供能量，如還原性磷酸戊糖循環(huán)；②甲酸分子作為碳源，被直接同化進(jìn)入到微生物的中心代謝之中，但是部分甲酸分子仍可能被氧化用于供能，如絲氨酸循環(huán)、還原性乙酰輔酶A 途徑和還原性甘氨酸途徑。

2.1.1 還原性磷酸戊糖循環(huán)

還原性磷酸戊糖循環(huán)（reductive pentose?phosphate cycle），也稱為Calvin?Benson?Bassham（CBB）循環(huán)，是唯一已知的能夠利用甲酸進(jìn)行微生物自養(yǎng)生長(zhǎng)的天然碳同化途徑［71］。CBB 循環(huán)主要包括三個(gè)過程［圖3（a）］：首先是羧化作用，在關(guān)鍵酶核酮糖?1，5?二磷酸羧化酶/加氧酶的作用下，1 分子CO2與1，5?二磷酸核酮糖（ribulose?1，5?bisphosphate，RuBP）分子進(jìn)行反應(yīng)，生成一個(gè)不穩(wěn)定的六碳化合物，隨之分解為2分子3?磷酸甘油酸；其次是還原作用，2 分子3?磷酸甘油酸先轉(zhuǎn)化為2 分子1，3?二磷酸甘油酸，隨之生成2 分子3?磷酸甘油醛；最后是RuBP 的再生，在經(jīng)過一系列多碳糖之間復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化后，5 分子3?磷酸甘油醛先轉(zhuǎn)化為1 分子5?磷酸核酮糖，隨之再生得到1分子RuBP。綜上所述，每輪CBB 循環(huán)固定1 分子CO2，三輪循環(huán)后生成1 分子3?磷酸甘油醛，共計(jì)消耗6 分子NAD（P）H 與9 分子ATP。CBB 循環(huán)依賴型微生物可以將甲酸作為唯一碳源和能源進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)。然而，CBB 循環(huán)途徑仍然存在一定的不足，如該循環(huán)是ATP 利用效率最低的固碳途徑之一［72］。與甲酸直接同化相比，甲酸的氧化供能存在著能量浪費(fèi)，因?yàn)殡娮訌募姿徂D(zhuǎn)移到氧化還原載體的過程需要消耗額外的能量［71］。因此，CBB 循環(huán)依賴型微生物的細(xì)胞生長(zhǎng)速率與生產(chǎn)潛能仍然不夠高，與實(shí)際的工業(yè)化生產(chǎn)仍然存在差距。

2.1.2 絲氨酸循環(huán)

絲氨酸循環(huán)（serine cycle）是多種甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物（如M. extorquensAM1［31］）同化利用甲酸的代謝途徑。該循環(huán)包含了二碳、三碳及四碳化合物之間的相互轉(zhuǎn)化［圖3（b）］：首先是四氫葉酸（tetrahydrofolic acid，簡(jiǎn)稱THF）循環(huán)，即甲酸分子在甲酸四氫葉酸連接酶、次甲基四氫葉酸環(huán)水解酶和亞甲基四氫葉酸脫氫酶的先后作用下，生成5，10?亞甲基四氫葉酸，隨后5，10?亞甲基四氫葉酸的甲基轉(zhuǎn)移到二碳化合物甘氨酸上，生成三碳化合物絲氨酸；其次，絲氨酸依次轉(zhuǎn)化為羥基丙酮酸、甘油酸、2?磷酸甘油酸與磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP），隨后PEP 經(jīng)羧化作用固定1 分子CO2生成四碳化合物草酰乙酸；然后，草酰乙酸依次轉(zhuǎn)化為蘋果酸與蘋果酰輔酶A；最后，蘋果酰輔酶A 裂解為兩個(gè)二碳化合物乙酰輔酶A 與乙醛酸，其中乙醛酸能夠再次轉(zhuǎn)化為甘氨酸用于維持絲氨酸循環(huán)。綜上所述，每輪絲氨酸循環(huán)能夠同化1分子甲酸并固定1分子CO2，最終生成1分子乙酰輔酶A，共計(jì)消耗3分子NAD（P）H與3 分子ATP。與甲酸氧化供能相比，絲氨酸循環(huán)可以同化甲酸并固定CO2，不僅避免了碳損失，而且還能在一定程度上減少能量浪費(fèi)。通過在E. coli中引入異源的天然絲氨酸循環(huán)，同時(shí)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化策略，獲得了能夠同化利用甲酸合成乙醇的工程菌株［73］，從而驗(yàn)證了絲氨酸循環(huán)在模式微生物中同化利用甲酸的可行性。然而，天然絲氨酸循環(huán)所涉及的酶和代謝反應(yīng)比較多，且ATP利用效率仍然比較低，因此，利用該循環(huán)同化甲酸的微生物，目標(biāo)代謝物的產(chǎn)量偏低，目前還不適合用于工業(yè)化生產(chǎn)。

2.1.3 還原性乙酰輔酶A途徑

還原性乙酰輔酶A 途徑（reductive acetyl?CoA pathway），也稱為Wood?Ljungdahl（WL）途徑，是一種廣泛存在于產(chǎn)乙酸菌、產(chǎn)甲烷菌與硫酸鹽還原菌等厭氧微生物中的固碳途徑。不同類型的厭氧微生物所具有的WL 途徑結(jié)構(gòu)相似但有所差別，如產(chǎn)乙酸菌與產(chǎn)甲烷菌的WL途徑存在著一碳載體、輔酶與路徑酶等方面的差異［74］。以產(chǎn)乙酸菌的WL 途徑為例［圖3（c）］，WL 途徑由甲基分支與羰基分支兩條支路組成。在甲基分支中，甲酸到5，10?亞甲基四氫葉酸的部分與絲氨酸循環(huán)一致，隨后5，10?亞甲基四氫葉酸先轉(zhuǎn)化為5?甲基四氫葉酸，再實(shí)現(xiàn)甲基與鈷鐵硫蛋白（corrinoid ironsulfur protein，CoFeSP）間的連接，生成5?甲基鈷鐵硫蛋白；在羰基分支中，CO2在一氧化碳脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為CO；最后，甲基分支的產(chǎn)物5?甲基鈷鐵硫蛋白提供甲基，羰基分支的產(chǎn)物CO 提供羰基，兩者連接生成乙酰輔酶A。綜上所述，WL 途徑能夠同化1 分子甲酸與1 分子CO2，最終生成1分子乙酰輔酶A，共計(jì)消耗3 分子NAD（P）H 與1分子ATP。與絲氨酸循環(huán)相比，WL 途徑生成1 分子乙酰輔酶A 僅僅消耗了1 分子ATP，且該途徑不存在碳損失，是ATP 利用效率最高的天然甲酸同化路徑。然而，WL 途徑的蛋白質(zhì)組學(xué)十分復(fù)雜，且包含對(duì)氧氣非常敏感的路徑酶，因此，該途徑僅僅能夠在嚴(yán)格厭氧的條件下運(yùn)行，且代謝改造難度比較大［75?76］，實(shí)現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用仍然存在挑戰(zhàn)。

2.1.4 還原性甘氨酸途徑

還原性甘氨酸途徑（reductive glycine pathway，簡(jiǎn)稱為rGly 途徑），主要存在于硫酸鹽還原菌（如D. desulfuricans）［46］和產(chǎn)乙酸菌（如梭狀芽孢桿菌Clostridium drakei）［77］中。該途徑主要包括三個(gè)模塊［圖3（d）］：首先，由甲酸到5，10?亞甲基四氫葉酸的轉(zhuǎn)化；其次，5，10?亞甲基四氫葉酸在甘氨酸裂解系統(tǒng)（glycine cleavage system，GCS）的催化下，固定1 分子CO2生成甘氨酸；最后，甘氨酸可通過兩種路線轉(zhuǎn)化為丙酮酸，一種為還原甘氨酸（reductive glycine，RG）路線，即5，10?亞甲基四氫葉酸的甲基轉(zhuǎn)移到甘氨酸上生成絲氨酸，隨后絲氨酸脫氨基形成丙酮酸，另一種為甘氨酸還原酶（glycine reductase，GR）路線，即甘氨酸依次轉(zhuǎn)化為乙酰磷酸、乙酸與乙酰輔酶A，隨后固定1 分子CO2生成丙酮酸。綜上所述，依賴于RG 路線的rGly 途徑能夠同化2 分子甲酸和1 分子CO2，最終生成1分子丙酮酸，共計(jì)消耗3分子NAD（P）H與2 分子ATP；依賴于GR 路線的rGly 途徑能夠同化1 分子甲酸和2 分子CO2，最終生成1 分子丙酮酸，共計(jì)消耗2分子NAD（P）H與1分子ATP。rGly途徑是一種能夠高效同化甲酸的代謝路徑，具有許多優(yōu)勢(shì)：rGly 途徑對(duì)ATP 的利用效率僅次于WL途徑；rGly 途徑為線性途徑，降低了代謝改造的難度，且多種微生物具有內(nèi)源性的rGly 途徑［78］；rGly 途徑與中心代謝途徑的重疊較少，因此異源引入或改造內(nèi)源rGly 途徑對(duì)本源代謝網(wǎng)絡(luò)的干擾比較小；與絲氨酸循環(huán)和WL途徑相比，rGly途徑具有更高的代謝物靈活性，可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為多種化學(xué)品。基于上述優(yōu)勢(shì)，rGly 途徑成為目前最具發(fā)展?jié)摿Φ募姿岽x路徑，與此同時(shí)，對(duì)路徑關(guān)鍵酶GCS 的深入研究［79?80］，有望進(jìn)一步優(yōu)化rGly 途徑。然而，對(duì)于具有天然rGly 途徑的微生物研究仍然較少，還不能滿足現(xiàn)階段甲酸生物經(jīng)濟(jì)的發(fā)展要求。

2.2 重構(gòu)與優(yōu)化甲酸利用路徑

目前，對(duì)于天然甲酸利用路徑的應(yīng)用，還存在著許多缺點(diǎn)與限制條件，因此，為了提高甲酸利用路徑的效率與應(yīng)用潛能，研究人員在E. coli等模式微生物中重構(gòu)與優(yōu)化了天然甲酸利用路徑，獲得了一系列新型甲酸利用路徑（圖4），并分析了新型路徑的特點(diǎn)與可行性。

2.2.1 重構(gòu)的卡爾文循環(huán)

通過在E. coli中重構(gòu)卡爾文循環(huán)，首次實(shí)現(xiàn)了異養(yǎng)微生物向自養(yǎng)微生物的轉(zhuǎn)化［57］。通過敲除糖酵解途徑中的磷酸果糖激酶和戊糖磷酸途徑中的葡萄糖?6?磷酸脫氫酶，并異源表達(dá)核酮糖?1，5?二磷酸羧化酶、磷酸核酮糖激酶、碳酸酐酶和甲酸脫氫酶，實(shí)現(xiàn)了在E. coli中重構(gòu)卡爾文循環(huán)［圖4（a）］。重構(gòu)的卡爾文循環(huán)（reconstructed Calvin cycle）可以固定CO2合成生物量，同時(shí)氧化甲酸實(shí)現(xiàn)供能。在此基礎(chǔ)上，將該循環(huán)與實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化相結(jié)合，進(jìn)化獲得了自養(yǎng)型E. coli，這種基于甲酸供能的生物固碳模式在甲酸生物經(jīng)濟(jì)發(fā)展和未來工業(yè)生物制造方面具有極大的潛力［81］。此外，隨著近年來電化學(xué)法還原CO2生產(chǎn)甲酸［82?84］的深入研究，該自養(yǎng)系統(tǒng)中由于甲酸氧化速率高于固碳速率而導(dǎo)致的CO2凈排放也有望得到優(yōu)化與解決。

2.2.2 改良的絲氨酸循環(huán)

基于源自M. extorquensAM1 的天然絲氨酸循環(huán)，通過在E. coli中進(jìn)行表達(dá)與改良絲氨酸循環(huán)，獲得的工程菌株能夠利用甲醇、甲酸和CO2合成乙酰輔酶A［58］。改良的絲氨酸循環(huán)（modifed serine cycle）同化甲酸的過程主要分為以下幾個(gè)步驟［圖4（b）］：首先，甲酸在甲酸四氫葉酸連接酶和5，10?亞甲基四氫葉酸合成酶的作用下轉(zhuǎn)化為5，10?亞甲基四氫葉酸，隨后在絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，5，10?亞甲基四氫葉酸的甲基轉(zhuǎn)移至甘氨酸上，生成絲氨酸；其次，絲氨酸在絲氨酸脫氨酶的催化下脫氨生成丙酮酸，再經(jīng)PEP 合成酶、PEP 羧化酶的作用，固定1 分子CO2生成草酰乙酸；再次，草酰乙酸在蘋果酸脫氫酶和蘋果酸硫激酶的作用下轉(zhuǎn)化為蘋果酰輔酶A；最后，蘋果酰輔酶A經(jīng)蘋果酰輔酶A裂解酶的催化，裂解為乙醛酸與乙酰輔酶A。其中，乙酰輔酶A作為該循環(huán)的輸出產(chǎn)物，而乙醛酸則轉(zhuǎn)化為甘氨酸用于完成新一輪循環(huán)。綜上所述，當(dāng)甲酸作為底物時(shí)，改良的絲氨酸循環(huán)與天然絲氨酸循環(huán)一致，每輪循環(huán)能夠同化1 分子甲酸并固定1 分子CO2，最終生成1 分子乙酰輔酶A，共計(jì)消耗3 分子NAD（P）H與3 分子ATP。相比于天然絲氨酸循環(huán)，改良的絲氨酸循環(huán)具有一定生物優(yōu)勢(shì)。通過甲醇脫氫酶和甲醛脫氫酶，不僅簡(jiǎn)化了甲醇轉(zhuǎn)化為甲酸的路徑，而且還利用丙氨酸?乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸?丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸脫氫酶進(jìn)行氨同化，以丙氨酸代替絲氨酸成為氨基供體，從而避免了有毒中間代謝物羥基丙酮酸的生成。然而，改良的絲氨酸循環(huán)路徑比較復(fù)雜，涉及多個(gè)酶促反應(yīng)，且與中心代謝途徑的重疊較多。因此，仍存在ATP 利用效率偏低的問題，不利于進(jìn)一步的代謝工程改造與工業(yè)應(yīng)用。

2.2.3 高絲氨酸循環(huán)

基于絲氨酸循環(huán)，在E. coli中構(gòu)建了高絲氨酸循環(huán)（homoserine cycle）［59］［圖4（c）］。首先，甲酸在乙酰輔酶A 合成酶和乙醛脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為甲醛，甲醛作為一種高活性化合物，更易于被同化進(jìn)入代謝系統(tǒng)［56，85］；其次，在絲氨酸醛縮酶的作用下，甲醛與甘氨酸反應(yīng)生成絲氨酸，隨之絲氨酸脫氨形成丙酮酸；然后，另一分子甲醛與丙酮酸在4?羥基?2?氧代丁酸（4?hydroxy?2?oxobutanoate，HOB）醛縮酶的作用下，生成非天然代謝物HOB；隨后，氨基被結(jié)合到HOB 上生成高絲氨酸，高絲氨酸在高絲氨酸激酶與蘇氨酸合成酶的作用下轉(zhuǎn)化為蘇氨酸；最后，在蘇氨酸醛縮酶的催化下，蘇氨酸裂解為甘氨酸與乙醛。其中，甘氨酸重新進(jìn)入循環(huán)，而乙醛分子經(jīng)乙醛脫氫酶的催化，生成乙酰輔酶A 并輸出循環(huán)。綜上所述，每輪高絲氨酸循環(huán)能夠同化2分子甲酸，最終生成1 分子乙酰輔酶A，共計(jì)消耗1 分子NADH與3 分子ATP。高絲氨酸循環(huán)是在改良絲氨酸循環(huán)的基礎(chǔ)上，對(duì)天然絲氨酸循環(huán)進(jìn)行的更深層的優(yōu)化，具有明顯的優(yōu)勢(shì)：以甲醛替代CO2進(jìn)入同化路徑，改善了羧化反應(yīng)所造成的限速作用，減少了還原力的使用，有利于支持更高的生物量產(chǎn)量；該循環(huán)路徑所涉及的酶均為E. coli的內(nèi)源酶，保證了酶的催化活性；相比于絲氨酸循環(huán)，該循環(huán)所包含的酶促反應(yīng)較少，且與中心代謝途徑的重疊也較少［59］。然而，甲醛與高絲氨酸對(duì)E. coli都具有一定的毒性作用。因此，深入探究E. coli的毒性機(jī)理與解毒機(jī)制［86?88］，對(duì)于進(jìn)一步優(yōu)化高絲氨酸循環(huán)具有重要意義。

2.2.4 重組THF循環(huán)?反向甘氨酸裂解途徑

近年來，依賴于RG 路線的rGly 途徑已被應(yīng)用于多種微生物的代謝改造。在這些研究中，rGly途徑通常被分為兩個(gè)模塊［圖4（d）］：重組THF循環(huán)（reconstructed THF cycle，rTHF）模塊與反向甘氨酸裂解（reverse glycine cleavage，rgcv）模塊。通過組合rTHF 模塊與rgcv 模塊，驗(yàn)證了甲酸同化在E. coli中的可行性。隨后，rTHF?rgcv 途徑以及關(guān)鍵模塊被進(jìn)一步從E. coli拓展到多種微生物中，通過組合和優(yōu)化異源路徑酶與微生物內(nèi)源酶之間的適配性，實(shí)現(xiàn)了rTHF?rgcv 途徑在多種微生物中的應(yīng)用（表3），從而證明了該途徑所具有的優(yōu)勢(shì)與工業(yè)應(yīng)用潛能。

表3 rTHF?rgcv途徑的路徑酶來源Table 3 Source of pathway enzymes of the rTHF?rgcv pathway

2.3 人工設(shè)計(jì)甲酸利用路徑

隨著計(jì)算機(jī)輔助路徑設(shè)計(jì)［90］與酶工程［91?92］等技術(shù)的發(fā)展，研究人員在開發(fā)新型甲酸利用路徑（圖5）時(shí)不再局限于自然界已有的酶促反應(yīng)，這不僅有利于簡(jiǎn)化甲酸利用路徑，而且還能夠拓展甲酸營(yíng)養(yǎng)型微生物的改造空間。

圖5 人工設(shè)計(jì)甲酸利用路徑Acdh-乙醛脫氫酶；Acs-乙酰輔酶A合成酶；Acps-乙酰磷酸合成酶；Dhak-二羥基丙酮激酶；Fls-甲醛酶；Gals-乙醇醛合成酶；Pta-磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（綠色底色的化合物為路徑底物，粉色底色的化合物為路徑產(chǎn)物）Fig. 5 Artificial formate?utilizing pathwaysAcdh-acetaldehyde dehydrogenase; Acs-acetyl?CoA synthase; Acps-acetyl phosphate synthase;Dhak-dihydroxyacetone kinase; Fls-formolase; Gals-glycolaldehyde synthase; Pta-phosphate acetyltransferase(compounds with a green background are pathway substrates, compounds with a pink background are pathway products)

2.3.1 甲醛酶途徑

以熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）的苯甲醛裂解酶為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)并優(yōu)化獲得了一種新酶：甲醛酶（formolase）［93］。在此基礎(chǔ)上，重構(gòu)了一條新型甲酸同化路徑，即甲醛酶途徑（formolase pathway），該途徑由四步酶促反應(yīng)組成［圖5（a）］：首先，甲酸在乙酰輔酶A 合成酶與乙醛脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為甲醛；其次，在甲醛酶的催化作用下，3 分子甲醛縮合生成1 分子二羥基丙酮；最后，二羥基丙酮在二羥基丙酮激酶的作用下轉(zhuǎn)化為微生物的中心代謝物磷酸二羥丙酮。綜上所述，該路徑能夠同化3 分子甲酸生成1 分子磷酸二羥丙酮，共計(jì)消耗3 分子NADH 與4 分子ATP。甲醛酶路徑為線性反應(yīng)路徑，僅需4 種酶即可完成路徑催化，然而，甲醛酶的酶促反應(yīng)效率比較低，從而限制了該路徑的應(yīng)用潛能。通過酶工程策略對(duì)甲醛酶途徑的甲醛酶與乙醛脫氫酶進(jìn)行改造，能夠有效提高該路徑對(duì)甲酸的利用效率［94?95］。

2.3.2 合成乙酰輔酶A途徑

通過定向進(jìn)化P. putida的苯甲酰甲酸脫羧酶，獲得了乙醇醛合成酶（glycolaldehyde synthase）［67］。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一條合成乙酰輔酶A 途徑（synthetic acetyl?CoA pathway），該途徑僅有3 步酶促反應(yīng)［圖5（b）］：首先，在乙醇醛合成酶的作用下，兩個(gè)甲醛分子縮合生成1 分子乙醇醛；其次，在乙酰磷酸合成酶的催化下，實(shí)現(xiàn)了乙醇醛到乙酰磷酸的轉(zhuǎn)化；最后，乙酰磷酸在磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的催化下生成乙酰輔酶A。綜上所述，該路徑能夠同化2 分子甲醛生成1 分子乙酰輔酶A，且不存在ATP與還原力的消耗。合成乙酰輔酶A途徑同樣為線性反應(yīng)路徑，僅需3種酶即可完成路徑催化。然而，該途徑尚未被拓展到直接利用甲酸作為路徑的起點(diǎn)，尚需參考甲醛酶途徑以實(shí)現(xiàn)甲酸到甲醛的轉(zhuǎn)化。另外，由于甲醛毒性以及乙醇醛合成酶和乙酰磷酸合成酶對(duì)底物的親和力比較差，因此在E. coli中引入合成乙酰輔酶A途徑后，菌株的生物量偏低［67］，從而限制了該路徑在現(xiàn)階段的應(yīng)用范圍。

3 甲酸利用的代謝工程策略

代謝工程改造在提高微生物細(xì)胞工廠的應(yīng)用方面具有重要意義。甲酸營(yíng)養(yǎng)型微生物的工業(yè)應(yīng)用主要面臨著甲酸同化路徑效率低、甲酸利用微生物生長(zhǎng)速率緩慢等問題。因此，需要開發(fā)合適的代謝工程策略，提高甲酸同化路徑的代謝效率，改善甲酸利用微生物的細(xì)胞生長(zhǎng)，從而推動(dòng)甲酸生物經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

3.1 提高甲酸同化路徑的代謝效率

甲酸同化路徑的代謝效率決定了微生物利用甲酸的效率。然而，不同類型的甲酸利用微生物具有不同的代謝特征，因此，需要選擇合適的代謝工程策略來提高甲酸同化路徑的代謝效率。近年來，提高甲酸同化路徑代謝效率的策略，主要包括：路徑基因表達(dá)水平優(yōu)化、路徑關(guān)鍵酶改造、競(jìng)爭(zhēng)路徑阻斷、輔因子再生系統(tǒng)重構(gòu)、路徑模塊化優(yōu)化等。

3.1.1 路徑基因表達(dá)水平優(yōu)化

甲酸同化路徑的構(gòu)建方式主要包括兩種：一種是將異源路徑基因與微生物的內(nèi)源基因進(jìn)行理性組合；另一種是僅對(duì)微生物內(nèi)源基因進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。然而，上述兩種構(gòu)建方式均會(huì)影響微生物的本源代謝網(wǎng)絡(luò)，從而影響甲酸同化效率。因此，需要對(duì)路徑基因的表達(dá)水平進(jìn)行合理優(yōu)化［圖6（a）］。采用的策略主要包括兩種：①選擇合適的異源基因，用于構(gòu)建甲酸同化路徑。例如，當(dāng)在E. coli中引入甲酸四氫葉酸連接酶（Ftl）、次甲基四氫葉酸環(huán)水解酶（Fch）和亞甲基四氫葉酸脫氫酶（Mtd）等基因構(gòu)建THF 循環(huán)［圖4（d）］時(shí)，同時(shí)將源自C. ljungdahlii和A. woodie的基因操縱子Cl和Aw 分別引入絲氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中，結(jié)果顯示Cl 操縱子可以回補(bǔ)菌株的絲氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷，使其以甲酸為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，但是Aw 操縱子卻不能實(shí)現(xiàn)上述效果。上述結(jié)果表明，Cl操縱子有利于異源Ftl、Fch 和Mtd 以及內(nèi)源絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（GlyA）的催化作用，實(shí)現(xiàn)甲酸到絲氨酸的轉(zhuǎn)化［61］。然而，上述研究所構(gòu)建的THF 循環(huán)對(duì)甲酸的同化效率明顯低于源自M. extorquens的THF 循環(huán)［62?63］，這也進(jìn)一步證明了選擇合適的異源基因?qū)τ跇?gòu)建甲酸同化路徑的重要性。②優(yōu)化路徑基因水平，實(shí)現(xiàn)路徑與宿主的最優(yōu)適配。例如，采用高拷貝數(shù)、中拷貝數(shù)和低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，在E. coli中表達(dá)Ftl、Fch、Mtd 與兩種甲酸脫氫酶，結(jié)果顯示含有低拷貝數(shù)質(zhì)粒的菌株生長(zhǎng)速率明顯高于中含有高拷貝數(shù)的菌株。上述結(jié)果表明，低拷貝數(shù)質(zhì)粒有利于實(shí)現(xiàn)菌株路徑基因的最優(yōu)表達(dá)［18］。除了利用不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒外，啟動(dòng)子工程也可以用于優(yōu)化路徑基因表達(dá)水平。例如，通過將不同啟動(dòng)子組合的質(zhì)粒pC1（表達(dá)Ftl、Fch、Mtd）和pC2（表達(dá)GCS）分別導(dǎo)入E. coli甘氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，結(jié)果顯示當(dāng)采用弱啟動(dòng)子時(shí)菌株生長(zhǎng)最好。上述結(jié)果表明，弱啟動(dòng)子組合有利于實(shí)現(xiàn)路徑基因的最優(yōu)表達(dá)［16］。另外，值得注意的是，雖然使用質(zhì)粒過表達(dá)路徑基因相對(duì)簡(jiǎn)捷，但是過多質(zhì)粒的使用會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)，相比而言基因組的過表達(dá)更加穩(wěn)定。例如，首先在E. coli的基因組上過表達(dá)GCS，隨后導(dǎo)入rTHF 循環(huán)，獲得了菌株E. coliRG3。與使用質(zhì)粒過表達(dá)GCS 的菌株E. coliRG2相比，E. coliRG3 具有更高的生長(zhǎng)速率與產(chǎn)物產(chǎn)率［63］。

圖6 提高甲酸同化效率的關(guān)鍵方法FDH-甲酸脫氫酶；Hint-H蛋白的氨甲基化形式；Hox-H蛋白的氧化形式；Hred-H蛋白的還原形式；TCA cycle-三羧酸循環(huán)；THF-四氫葉酸Fig. 6 Key methods to improve the efficiency of formate assimilationFDH-formate dehydrogenase; Hint-aminomethylated form of H protein; Hox-oxidized form of H protein;Hred-reduced form of H protein; TCA cycle-tricarboxylic acid cycle; THF-tetrahydrofolate;

3.1.2 路徑關(guān)鍵酶改造

甲酸同化路徑的代謝流通量受到路徑關(guān)鍵酶活性的直接影響。因此，結(jié)合路徑關(guān)鍵酶的催化特點(diǎn)并進(jìn)行理性改造，能夠減少甚至消除路徑表達(dá)的限制性因素，從而提高甲酸同化路徑的催化效率。以rTHF?rgcv 途徑的關(guān)鍵酶GCS 為例，GCS是由四種蛋白質(zhì)（T/H/P/L）組成的多酶復(fù)合體，催化的甘氨酸代謝為可逆反應(yīng)［圖6（b）］，但是在E. coli等多數(shù)微生物中的GCS更傾向于催化甘氨酸的裂解而非合成，因此，在構(gòu)建rTHF?rgcv 途徑的過程中，不僅需要改造GCS 的催化反應(yīng)方向，而且還需要提高GCS 的催化活性。例如，通過在E.coli中過表達(dá)內(nèi)源GCS 和敲除gcvR基因（抑制編碼蛋白T/H/P 的基因轉(zhuǎn)錄），工程菌株E. coliRG1能夠更好地轉(zhuǎn)化甲酸與CO2生成甘氨酸，從而證明了改造GCS 有利于提高甲酸同化路徑的代謝通量［63］。

3.1.3 競(jìng)爭(zhēng)路徑阻斷

由于甲酸同化路徑與微生物的本源代謝網(wǎng)絡(luò)存在一定的交叉性，所以不可避免地存在著路徑代謝流的泄露，因此，需要對(duì)甲酸同化路徑的競(jìng)爭(zhēng)路徑進(jìn)行合理阻斷。以rTHF?rgcv 途徑為例［圖6（c）］，一方面阻斷本源代謝網(wǎng)絡(luò)中能夠合成甲酸同化途徑中間產(chǎn)物的路徑。例如，通過在serA基因（編碼3?磷酸甘油酸脫氫酶）缺陷型E.coli中構(gòu)建rTHF?rgcv 途徑，促進(jìn)5，10?亞甲基四氫葉酸的合成，使得rTHF?rgcv 途徑的丙酮酸合成通量達(dá)到了總丙酮酸合成通量的12.9%，而在未敲除serA基因的菌株中僅為7.3%［63］。另一方面阻斷能夠代謝甲酸同化途徑中間產(chǎn)物的路徑。例如，C.necator能夠通過乙醛酸路徑同化甘氨酸，即甘氨酸先氧化生成乙醛酸，隨后乙醛酸通過甘油酸途徑轉(zhuǎn)化為生物量。然而，相比于rTHF?rgcv 途徑中的絲氨酸路徑，乙醛酸路徑同化甘氨酸的效率更低，故絲氨酸路徑取代乙醛酸路徑更有利于菌株在甲酸上生長(zhǎng)［16］。

3.1.4 輔因子再生系統(tǒng)重構(gòu)

輔因子NAD（P）H 可以為甲酸同化路徑提供還原力，而甲酸能夠在甲酸脫氫酶（Fdh）的催化下將NAD（P）+轉(zhuǎn)化為NAD（P）H，從而無需添加其他底物即可完成還原力供應(yīng)［圖6（d）］。因此，輔因子再生系統(tǒng)重構(gòu)不僅有利于提高甲酸同化路徑的催化效率，而且對(duì)于甲酸營(yíng)養(yǎng)型微生物的還原力和能量供給至關(guān)重要。例如，通過在E. coli中異源引入能夠再生NADH 的Fdh（來自博伊丁假絲酵母Candida boidinii）和能夠再生NADPH 的Fdhmut（來自擬南芥Arabidopsis thaliana），構(gòu)建了能夠?qū)AD（P）+轉(zhuǎn)化為NAD（P）H 的能量再生模塊，結(jié)合rTHF?rgcv 途徑，使得工程菌株能夠利用甲酸為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)［18］。

3.1.5 路徑模塊化優(yōu)化

路徑模塊化優(yōu)化作為一種理性的代謝工程策略，通過將甲酸同化路徑劃分為幾個(gè)代謝模塊，并利用相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株測(cè)試各個(gè)模塊的活性與限制性瓶頸，通過解除瓶頸最終實(shí)現(xiàn)甲酸同化路徑的整體優(yōu)化與適配［96］［圖6（e）］。例如，借助模塊化工程策略，通過組合rTHF模塊與絲氨酸?蘇氨酸循環(huán)，驗(yàn)證了甲酸同化在E. coli中的代謝可行性［60］。首先，通過在一碳與甘氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中過表達(dá)異源Ftl，甲酸能夠回補(bǔ)菌株的一碳營(yíng)養(yǎng)缺陷，從而證明了一碳模塊的活性；其次，通過在絲氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中過表達(dá)rTHF 模塊的Fch/ Mtd 雙功能酶（FolD）與GlyA，工程菌株實(shí)現(xiàn)了在甲酸與甘氨酸上進(jìn)行生長(zhǎng)；最后，通過在絲氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中引入絲氨酸?蘇氨酸循環(huán)，使工程菌株能夠在甲酸與葡萄糖上進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)，不再需要提供外源甘氨酸。上述研究為后續(xù)甲酸同化路徑的構(gòu)建提供了重要參考，模塊化工程不僅實(shí)現(xiàn)了甲酸營(yíng)養(yǎng)型E. coli的構(gòu)建［17］，而且還完成了P. putida甲酸代謝改造［70］等，從而拓展了同化甲酸的底盤微生物。

3.2 改善甲酸利用微生物的細(xì)胞生長(zhǎng)

為了充分發(fā)揮甲酸利用微生物在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用潛能，需要甲酸利用微生物在保持較高細(xì)胞生長(zhǎng)水平的前提下進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物的高效合成。因此，研究人員采用了一系列代謝工程與生化工程策略用于提高甲酸利用微生物的細(xì)胞生長(zhǎng)水平，主要包括實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化、強(qiáng)化甲酸營(yíng)養(yǎng)型微生物的細(xì)胞生長(zhǎng)、提高微生物協(xié)同利用甲酸的能力等。

3.2.1 實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化

實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化（adaptive laboratory evolution，ALE）是工業(yè)微生物領(lǐng)域常用的方法之一，能夠在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬自然進(jìn)化對(duì)有益的遺傳突變進(jìn)行富集［97］［圖7（a）］。與理性代謝工程策略相比，ALE 無需對(duì)微生物復(fù)雜的代謝系統(tǒng)進(jìn)行改造，不僅在一定程度上減少了工作量，而且還能夠繞開現(xiàn)階段代謝工程改造的理論與技術(shù)限制（尤其是非模式微生物）。因此，ALE 在甲酸營(yíng)養(yǎng)型微生物的構(gòu)建與應(yīng)用方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，主要包括兩種進(jìn)化方式：①ALE 用于推動(dòng)甲酸利用路徑在代謝網(wǎng)絡(luò)中的運(yùn)行，在提高路徑代謝流通量的同時(shí)改善菌株的細(xì)胞生長(zhǎng)［57，64］。例如，在E. coli中引入異源Ftl（來自克氏梭菌Clostridium kluyveri）后，采用Turbidostat 培養(yǎng)方法對(duì)菌株進(jìn)行定向進(jìn)化，提高了重構(gòu)rTHF?rgcv 途徑在代謝網(wǎng)絡(luò)中的代謝流通量，最終獲得的菌株E. coliG4670和E. coliG4671 能夠利用甲酸和CO2合成甘氨酸和絲氨酸［64］。在此基礎(chǔ)上，通過進(jìn)一步的長(zhǎng)期進(jìn)化，獲得的菌株E. coliG5222 和E. coliG5225 能夠利用甲酸與CO2為唯一碳源進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)［65］。②ALE用于提高菌株在甲酸上的細(xì)胞生長(zhǎng)與代謝能力，主要針對(duì)經(jīng)過一系列代謝改造后具有一定甲酸代謝能力的工程菌株［16?17，70，73］，或者本身不經(jīng)改造即可天然利用甲酸的菌株（如C. necatorH16［36］）。例如，通過在E. coli中構(gòu)建rTHF?rgcv 途徑與能量再生模塊，實(shí)現(xiàn)了菌株利用甲酸為唯一碳源和能源進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)。隨后，在補(bǔ)料?分批模式下對(duì)菌株進(jìn)行短期進(jìn)化，在13 個(gè)進(jìn)化周期內(nèi)，菌株的倍增時(shí)間縮短至不到8 h，生物量產(chǎn)量提高至2.3 g CDW/mol甲酸［17］。在此基礎(chǔ)上，采用類似的進(jìn)化方式，將菌株的倍增時(shí)間進(jìn)一步縮短至6 h，生物量產(chǎn)量提高至3.3 g CDW/mol甲酸，同時(shí)也提高了菌株對(duì)甲酸的耐受性［66］。

圖7 改善甲酸利用微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵方法Fig. 7 Key methods to improve the cell growth of formate?utilizing microorganisms

3.2.2 強(qiáng)化甲酸營(yíng)養(yǎng)型微生物的細(xì)胞生長(zhǎng)

對(duì)于人工構(gòu)建的甲酸營(yíng)養(yǎng)型菌株而言，合適的培養(yǎng)條件對(duì)于提高菌株對(duì)甲酸的耐受性與利用效率至關(guān)重要。甲酸營(yíng)養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)條件優(yōu)化主要包括兩種方式［圖7（b）］。①培養(yǎng)基成分的調(diào)整。例如，基于以甲酸為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)的E. coli工程菌株，通過在培養(yǎng)基中添加100 mmol/L的碳酸氫鈉，可以使菌株在更高的甲酸濃度下進(jìn)行生長(zhǎng)，甚至可以耐受300 mmol/L 甲酸。菌株對(duì)甲酸耐受性的增加可能是由于含有碳酸氫鹽的溶液具有更好的pH 緩沖性能，從而減少了由于甲酸消耗所引起的生長(zhǎng)環(huán)境局部pH 波動(dòng)［17］。②培養(yǎng)過程的優(yōu)化。例如，通過在E. coli中構(gòu)建rTHF?rgcv途徑與能量再生模塊，并降低菌株的培養(yǎng)溫度（由37 ℃降至32 ℃），提高了菌株細(xì)胞色素Cyo的表達(dá)水平并降低了Cyd 的表達(dá)水平，使得還原力NAD（P）H 能夠更有效地轉(zhuǎn)化為ATP，從而解決了菌株生長(zhǎng)過程中能量供應(yīng)不足的問題［18］。

3.2.3 提高微生物協(xié)同利用甲酸的能力

利用甲酸與其他碳源對(duì)微生物進(jìn)行共底物培養(yǎng)也是實(shí)現(xiàn)甲酸有效利用的方法之一，如甲酸與其他一碳化合物（如甲醇和甲醛等）可以實(shí)現(xiàn)協(xié)同代謝。在甲酸與甲醇的協(xié)同代謝過程中，甲醇脫氫酶能夠催化甲醇轉(zhuǎn)化為甲醛，而甲醛經(jīng)甲醛脫氫酶的催化可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為甲酸，上述過程均能夠產(chǎn)生還原力，從而為甲酸營(yíng)養(yǎng)型微生物的生長(zhǎng)提供更多能量。然而，傳統(tǒng)碳源（如葡萄糖和蔗糖等）與甲酸的協(xié)同代謝具有更大的優(yōu)勢(shì)，不僅有利于傳統(tǒng)生物經(jīng)濟(jì)向甲酸生物經(jīng)濟(jì)的過渡，而且更加適用于現(xiàn)階段的工業(yè)應(yīng)用［圖7（c）］。曼氏產(chǎn)琥珀酸菌（Mannheimia succiniciproducens）是公認(rèn)的高效生產(chǎn)琥珀酸的菌種之一，以阻斷副產(chǎn)物合成途徑的M. succiniciproducens為底盤微生物，通過過表達(dá)源自M. extorquens的甲酸脫氫酶后，實(shí)現(xiàn)了工程菌株協(xié)同代謝葡萄糖（或蔗糖）和甲酸，使得琥珀酸得率達(dá)到了1.41 mol/mol，接近于琥珀酸的最大理論得率1.5 mol/mol［98］。另外，傳統(tǒng)碳源與甲酸的協(xié)同代謝也拓展了模式微生物（如E. coli）的工業(yè)應(yīng)用范圍。例如，通過在E. coli中構(gòu)建能夠協(xié)同代謝葡萄糖和甲酸的合成途徑SMGF，使得工程菌株由葡萄糖合成丙酮酸的得率達(dá)到了理論糖酵解得率的94%（達(dá)到1.88 mol/mol）［95］。

4 結(jié) 語

針對(duì)微生物利用甲酸的研究，研究人員采用合成生物學(xué)與代謝工程等策略，提高了天然甲酸利用微生物的甲酸同化能力，賦予了模式微生物甲酸代謝能力，推動(dòng)了甲酸生物經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。然而，目前微生物利用甲酸的研究尚處于初始階段，仍然存在許多不足，例如：微生物利用甲酸的效率偏低，細(xì)胞生長(zhǎng)速率較慢，目標(biāo)代謝物產(chǎn)量尚未達(dá)到工業(yè)化要求等。因此，未來的研究重點(diǎn)可以繼續(xù)圍繞甲酸利用的微生物、代謝路徑和代謝工程策略三個(gè)方面進(jìn)行。

在甲酸利用的微生物方面，深入探究天然甲酸利用微生物的甲酸代謝機(jī)制，針對(duì)微生物的生化特征與代謝特性，開發(fā)相應(yīng)的分子遺傳學(xué)操作工具與檢測(cè)技術(shù)，如高通量測(cè)序技術(shù)［99］與同位素標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)［100］等，從而拓展天然甲酸利用微生物的應(yīng)用空間。目前，模式微生物利用甲酸的研究主要聚焦于E. coli，需要進(jìn)一步拓展至改造與提高其他模式微生物（如S. cerevisiae與P. pastoris等）的甲酸代謝能力。此外，通過挖掘與開發(fā)新型甲酸利用微生物，也能夠進(jìn)一步拓寬甲酸利用微生物底盤與代謝產(chǎn)物范圍。

在甲酸利用的代謝路徑方面，結(jié)合新型的基因編輯工具與路徑酶改造技術(shù)，進(jìn)一步優(yōu)化現(xiàn)有的甲酸利用路徑與路徑酶。結(jié)合生物信息學(xué)與計(jì)算機(jī)算法，進(jìn)一步設(shè)計(jì)與構(gòu)建更加簡(jiǎn)單高效的甲酸利用路徑。另外，通過構(gòu)建微生物細(xì)胞微區(qū)室等方式，提高氧氣敏感性路徑酶在甲酸同化過程中的可實(shí)用性。在E. coli中設(shè)計(jì)能夠封存丙酮酸甲酸裂解酶和磷酸?；D(zhuǎn)移酶的微區(qū)室，可以有效地將甲酸和乙酰磷酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸［101］。這類微生物細(xì)胞微區(qū)室的構(gòu)建，不僅能夠降低其他路徑對(duì)甲酸同化路徑的代謝干擾，而且對(duì)氧氣敏感性路徑酶在需氧生物中的應(yīng)用具有重要的借鑒意義。

在甲酸利用的代謝工程策略方面，開發(fā)更有效的代謝工程改造策略，優(yōu)化微生物的甲酸代謝網(wǎng)絡(luò)。通過探究sRNA 對(duì)微生物基因表達(dá)的微調(diào)機(jī)制，并將該機(jī)制應(yīng)用于微生物的甲酸代謝網(wǎng)絡(luò)改造，有利于進(jìn)一步優(yōu)化相關(guān)基因在甲酸同化過程中的表達(dá)水平，從而提高甲酸營(yíng)養(yǎng)型微生物的甲酸同化效率［102?103］。此外，通過優(yōu)化甲酸脫氫酶的催化性能、建立能夠評(píng)估輔因子再生系統(tǒng)的微生物體內(nèi)平臺(tái)等策略，進(jìn)一步完善甲酸代謝的能量再生機(jī)制。例如，通過在E. coli中敲除二氫硫辛酸脫氫酶基因，消除了丙酮酸脫氫酶和α?酮戊二酸脫氫酶的活性，從而構(gòu)建了NADH 和ATP 的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，并用于評(píng)估NAD+依賴型甲酸脫氫酶和甲醇脫氫酶，為甲酸代謝的能量機(jī)制評(píng)估提供了一種有效的策略［104］。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化等策略，提高甲酸利用微生物的工業(yè)化生產(chǎn)潛能。