液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中黃體酮?dú)埩袅康牟淮_定度分析

鄭雪雪 王淑霞 黃鵬 張輝 唐文杰 周叢

摘 要：本文采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)牛奶中黃體酮?dú)埩袅窟M(jìn)行分析測(cè)定。結(jié)果表明，當(dāng)牛奶中黃體酮?dú)埩袅繙y(cè)定含量為6.93 μg·kg-1時(shí)，其擴(kuò)展不確定度達(dá)到1.82 μg·kg-1（k=2）。該方法的不確定度主要來(lái)自校準(zhǔn)過(guò)程產(chǎn)生的不確定度，可對(duì)相關(guān)計(jì)量器具進(jìn)行檢定以改善。

關(guān)鍵詞：黃體酮；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；牛奶；不確定度

Abstract： This article uses a liquid chromatography tandem mass spectrometry method to determine the residual amount of progesterone in milk. The results showed that when the content of progesterone residue in milk was?6.93 μg·kg-1， the expanded uncertainty reached 1.82 μg·kg-1（k=2）. The uncertainty of this method mainly comes from the uncertainty generated during the calibration process， and relevant measuring instruments can be verified to improve the accuracy

Keywords： progesterone; liquid chromatography tandem mass spectrometry; milk; uncertainty

黃體酮是由雌性的卵巢黃體分泌，是一種孕激素。為保障生育所需要，黃體酮在生物體內(nèi)對(duì)維護(hù)子宮內(nèi)膜正常功能發(fā)揮著重要作用，在生理臨床治療中應(yīng)用廣泛[1-2]。研究表明，長(zhǎng)期食用含孕激素的食品，易造成內(nèi)分泌紊亂，損害生殖器官，增加子宮內(nèi)膜發(fā)生病變及患上乳腺腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。牛奶作為廣受人們歡迎的消費(fèi)品，其膳食攝入占比較大，由此帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)不容忽視，因此合理、準(zhǔn)確地評(píng)估乳制品黃體酮?dú)埩袅匡@得尤為必要，而合理準(zhǔn)確的評(píng)估就需要對(duì)其測(cè)量不確定度的大小進(jìn)行評(píng)價(jià)。

目前，黃體酮檢測(cè)分析一般采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）等方法[5-7]。其中，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法憑借其高度靈敏性以及高準(zhǔn)確度而被廣泛用于各類(lèi)樣品中黃體酮的測(cè)定[8-9]。但關(guān)于采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定牛奶中黃體酮的殘留量的不確定性評(píng)價(jià)方法鮮見(jiàn)。本文參照《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）[10]、《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS—GL006： 2019）[11]以及農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-1-2008《動(dòng)物源性食品中11種激素殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[12]等，對(duì)牛奶中黃體酮?dú)埩艉繙y(cè)量的不確定度進(jìn)行評(píng)估，希望對(duì)評(píng)估檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶樣品，淘寶網(wǎng)購(gòu)買(mǎi)。

黃體酮標(biāo)準(zhǔn)品（壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；氘代睪酮（壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；乙腈（色譜純，美國(guó)tedia公司）；甲酸（色譜純，美國(guó)Supelco公司）；甲醇（色譜純，美國(guó)tedia公司）；甲醚（色譜純，上海安譜公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛（中國(guó)）有限公司；TG16-WS型臺(tái)式離心機(jī)，cence湘儀；電子分析天平，美國(guó)新澤西的奧豪斯公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

參照農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-1-2008《動(dòng)物源性食品中11種激素殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》進(jìn)行樣品前處理操作。準(zhǔn)確稱(chēng)取實(shí)驗(yàn)樣品5.0 g，放入50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入10 ng氘代睪酮內(nèi)標(biāo)，用5 mL水稀釋樣品，加入10% Na2CO3溶液3 mL與甲基叔丁基醚25 mL，振蕩提取10 min，離心，取上層，殘?jiān)貜?fù)提取1次。合并兩次提取液，40 ℃下氮吹至近干，加入1 mL乙腈水（體積比V/V=1∶1）溶液將殘?jiān)芙?，快速渦旋混勻后，轉(zhuǎn)移至離心管中，冷凍離心后，取上清液過(guò)0.22 μm的有機(jī)濾膜，用于HPLC-MS/MS測(cè)定。樣品空白按同方法處理。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取黃體酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg裝入至100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，得到黃體酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，其濃度為100 μg·mL-1。再準(zhǔn)確移取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，同時(shí)采用甲醇稀釋并定容，得到黃體酮標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，其濃度為1 μg·mL-1，再分別準(zhǔn)確移取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，加入10 ng氘代睪酮內(nèi)標(biāo)，得到濃度為2.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1和50.0 μg·L-1，內(nèi)標(biāo)濃度為100 μg·L-1的黃體酮系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18（100 mm×2.1 m×3 μm）；樣品進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.4 mL·min-1；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；正離子掃描；被測(cè)物監(jiān)測(cè)離子見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

測(cè)定牛奶中黃體酮?dú)埩袅康臄?shù)學(xué)模型為

式中：X為試樣中黃體酮濃度，μg·kg-1；c為試樣溶液含量，μg·L-1；V為試樣定容體積，mL；m為稱(chēng)樣量，g；fr為回收率校正因子；fQ為儀器定量校準(zhǔn)影響因子。

2.2 不確定度來(lái)源分析

針對(duì)HPLC-MS/MS法檢測(cè)牛奶中黃體酮含量的分析過(guò)程進(jìn)行分析，可以判斷出該實(shí)驗(yàn)中各分量不確定度的主要來(lái)源為校準(zhǔn)過(guò)程、測(cè)量重復(fù)性以及回收率等。

2.3 各分量不確定度的計(jì)量

2.3.1 校準(zhǔn)過(guò)程產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ulrel（b）

（1）黃體酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液產(chǎn)生的不確定度分量包括以下內(nèi)容。①準(zhǔn)確稱(chēng)取質(zhì)量為10 mg的黃體酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解后，定容。由黃體酮標(biāo)準(zhǔn)品純度所帶來(lái)的不確定度，記為u（p）。由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)可知，黃體酮純度為99.0%±0.5%，其中，偏差為±0.5%，按照均勻分布方法計(jì)算，由純度所產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為

②根據(jù)電子天平檢定合格證書(shū)，天平允許偏差為±0.1 mg，按均勻分布方法計(jì)算，由標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量所帶來(lái)的不確定度與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度依次為

③A級(jí)單標(biāo)線的100 mL容量瓶（V1）體積容差為±0.1 mL，據(jù)矩形分布計(jì)算，其帶入的不確定度為

實(shí)驗(yàn)室的溫度在（20±5）℃波動(dòng)，溫度的不斷變化隨之會(huì)引起體積的變化，呈現(xiàn)出均勻分布，其中k=，甲醇體積膨脹系數(shù)為1.19×10-3/℃，故可計(jì)算出容量瓶（100 mL）因溫度變化引起的體積不確定度為

容量瓶（100 mL）定容體積引入的合成相對(duì)不確定度為

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程因容量瓶所引入的不確定度u（VL）。①依據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）中[13]所要求的，當(dāng)溫度為20 ℃時(shí)，A級(jí)單標(biāo)線容量瓶（100 mL）體積容差為±0.10 mL，10 mL A級(jí)單標(biāo)線容量瓶體積容差為±0.02 mL，按矩形分布，則容量瓶本身引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

②溫度波動(dòng)引起的容量瓶體積變化。溫度波動(dòng)范圍為（20±5）℃，呈均勻分布，k=，50%乙腈水溶液體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3/℃，故溫度波動(dòng)引起的容量瓶體積變化引入的不確定度為

100 mL容量瓶和10 mL容量瓶所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

則100 mL容量瓶和10 mL容量瓶體積的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（3）移液器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（Vq）。按照《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）的要求[14]，100 μL移液器中20 μL刻度處、50 μL刻度處、100 μL刻度處的檢定體積的容量允許誤差依次是±8.00%、±3.00%、±2.00%，1 000 μL的移液器中200 μL刻度處、500 μL刻度處測(cè)定點(diǎn)的容量允許誤差依次是±2.00%、±1.00%。依據(jù)矩形分布，k=，則采用不同體積規(guī)格的移液器移取不同體積溶液所引入的相對(duì)不確定度urel（Vqi）為

式中：Vi為不同移液點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的體積，μL；ti為容量所允許的誤差；Vq為移液器體積規(guī)格，即所允許量取溶液的最大體積，μL。

移液器所引入的具體參數(shù)（含數(shù)值）以及所計(jì)算出的相對(duì)不確定度結(jié)果匯總見(jiàn)表3。

則移液器引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

綜合上述，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制過(guò)程所引入的合成不確定度為

（4）擬合校準(zhǔn)工作曲線所帶來(lái)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（c0）。分別移取表3中5種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液供HPLC-MS/MS進(jìn)行分析，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

采用最小二乘法原理擬合出曲線方程為

Ai=0.073 225 6cj+0.020 90，R2=0.999 9。采用該曲線方程對(duì)試樣溶液進(jìn)行3次平行測(cè)定，最后根據(jù)直線方程得到的試樣溶液中黃體酮含量為c0=6.93 ng·mL-1，則黃體酮含量c0引入的不確度為

式中：S（A）為標(biāo)準(zhǔn)曲線所引入的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

N為標(biāo)準(zhǔn)溶液所對(duì)應(yīng)的平行測(cè)定次數(shù)，N=9；P為試樣溶液的測(cè)定次數(shù)，P=3；a為標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線的截距；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線所對(duì)應(yīng)的斜率；c0為由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得出試樣溶液中黃體酮的濃度，μg·L-1；c為各標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度配制濃度所計(jì)算出來(lái)的算術(shù)平均值，μg·L-1；ci為各校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度點(diǎn)的配制值，μg·L-1；cj為由線性方程所計(jì)算得出的標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定值，μg·L-1；Ai為單次標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的響應(yīng)值。

則擬合校準(zhǔn)工作曲線所帶來(lái)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

則校準(zhǔn)過(guò)程產(chǎn)生的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.2 測(cè)量重復(fù)性產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel（X）

稱(chēng)取7份陰性牛奶樣品（不含黃體酮）進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)量均為10.00 μg·kg-1，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。黃體酮的平均含量為X=9.50 μg·kg-1，標(biāo)準(zhǔn)偏差

S（X ）=0.245 μg·kg-1，故重復(fù)實(shí)驗(yàn)所帶來(lái)的不確定度以及相對(duì)不確定度分別為

2.3.3 回收率產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel（R）

由表5計(jì)算出牛奶中黃體酮的回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差為S（R）=2.445%，按A類(lèi)不確定評(píng)定，回收率所帶入的不確定度與相對(duì)不確定度分別為

2.3.4 實(shí)驗(yàn)過(guò)程稱(chēng)量樣品所帶來(lái)的相對(duì)不確定度urel（m）

準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g奶粉試樣，所使用電子分析天平的允許誤差為±0.01 g，按矩形分布進(jìn)行計(jì)算，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度依次為

2.3.5 樣品定量體積所帶來(lái)的相對(duì)不確定度urel（Vy）

按《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）[14]所明示的要求，當(dāng)實(shí)驗(yàn)室溫度處于20 ℃時(shí)，1 mL移液器所對(duì)應(yīng)容量允許誤差為±1.0%，按矩形分布計(jì)算可得移液器容量引入的不確定度為

實(shí)驗(yàn)室溫度處于（20±5） ℃內(nèi)，一般來(lái)說(shuō)，溫度的改變同時(shí)伴隨著體積的變化，并且呈現(xiàn)出均勻分布，其中k=，50%乙腈水溶液所對(duì)應(yīng)的體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3/℃，故因溫度變化所引入的不確定度為

樣品在定量分析時(shí)，由樣品定量體積所帶來(lái)的相對(duì)不確定度為

2.3.6 HPLC-MS/MS校準(zhǔn)引入的相對(duì)不確定度urel（Q）

根據(jù)儀器校準(zhǔn)證書(shū)，儀器的不確定度u=5%，取均勻分布（k=），則儀器校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.4 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ucrel（X）

對(duì)于黃體酮不確定度的貢獻(xiàn)大部分來(lái)自校準(zhǔn)過(guò)程產(chǎn)生的不確定度與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀校準(zhǔn)帶入的不確定度。

則黃體酮測(cè)定過(guò)程引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

當(dāng)樣品中黃體酮的含量為6.93 μg·kg-1，則黃體酮含量測(cè)定不確定度為

2.5 擴(kuò)展不確定度及測(cè)定結(jié)果

按照《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）中所規(guī)定[10]，取置信區(qū)間P=95%（k=2），把2.4中所求的合成不確定度與包含因子二者進(jìn)行相乘從而得到測(cè)量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度U=uc（X）×k=0.908×2=1.82 μg·kg-1。故采用HPLC-MS/MS測(cè)定牛奶中黃體酮的含量結(jié)果報(bào)告表示為（6.93±1.82）μg·kg-1，k=2。

3 結(jié)論

本文利用HPLC-MS/MS對(duì)牛奶中黃體酮?dú)埩袅窟M(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明其不確定度主要來(lái)自校準(zhǔn)過(guò)程產(chǎn)生的不確定度，其次為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀校準(zhǔn)帶入的不確定度、測(cè)量重復(fù)性及加標(biāo)回收率。因此，試驗(yàn)過(guò)程中可通過(guò)提升檢驗(yàn)技術(shù)人員的作業(yè)技術(shù)水平和完善試驗(yàn)儀器設(shè)備的維修保養(yǎng)等來(lái)降低測(cè)量不確定度，保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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