焙烤及油炸食品中賴丙氨酸檢測(cè)方法的建立及監(jiān)測(cè)

潘強(qiáng)，李燕妹，梁敏，黃燕，吳麗倩，陳集元，蔡小明

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院 國家加工食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心，福建 福州 350002）

隨著生活水平的提高，人們對(duì)食品的消費(fèi)理念逐漸從吃飽吃好的生存型消費(fèi)轉(zhuǎn)變成健康、營養(yǎng)、多樣化的享受型消費(fèi)，越來越多的消費(fèi)者追求吃得更健康、更安全。熱加工是食品生產(chǎn)過程中必不可少的環(huán)節(jié)，其不僅能夠賦予食品良好的口感、香味、外觀，而且能夠延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期，但這一過程往往伴隨著蛋白質(zhì)變性、脂質(zhì)氧化、維生素降解等，并生成一些有害物質(zhì)[1,2]。賴丙氨酸就是食品熱加工過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)之一。富含蛋白質(zhì)的食品經(jīng)過高溫[3-7]或堿處理[8-10]會(huì)產(chǎn)生賴丙氨酸，大量消耗掉食品中必需氨基酸，降低食品的營養(yǎng)價(jià)值[11,12]，同時(shí)螯合金屬酶，使生物體內(nèi)礦物質(zhì)利用率降低，造成機(jī)體金屬元素營養(yǎng)失調(diào)，此外賴丙氨酸還會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生腎毒性[13]。目前在食品法規(guī)中沒有明確表明賴丙氨酸的危害性及安全限量，但是在嬰幼兒配方食品中，賴丙氨酸已經(jīng)開始作為一個(gè)質(zhì)量控制指標(biāo)，以避免對(duì)嬰幼兒造成傷害[14,15]。

焙烤及油炸類食品品種多樣、味道各異，深受我國消費(fèi)者喜愛，具有食用范圍廣、頻率高等特點(diǎn)。目前，我國對(duì)食品中賴丙氨酸的研究主要集中在皮蛋[16]、牛奶[17-18]和嬰幼兒配方食品，對(duì)于焙烤及油炸類食品中賴丙氨酸含量的檢測(cè)及監(jiān)控存在一定的空白。本文構(gòu)建了焙烤及油炸食品中賴丙氨酸的氨基酸分析儀檢測(cè)方法，該方法能夠方便快速、準(zhǔn)確地對(duì)焙烤及油炸類食品中賴丙氨酸含量的進(jìn)行測(cè)定，有利于監(jiān)測(cè)焙烤及油炸食品中的賴丙氨酸的含量，對(duì)保障消費(fèi)者的食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

L-8900 氨基酸分析儀（日立公司）；電子天平（0.01 g，賽多利斯有限公司）；MS 3 basic微量振蕩器（德國艾卡公司）；Avanti J-E高速冷凍離心機(jī)（賽默飛有限公司）；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)（美國密理博公司）；全自動(dòng)平行濃縮儀（?？苾x器有限公司）；DHG -9140A 恒溫干燥箱（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

賴丙氨酸（1000 mg/L，CAS:4418-81-9）：天津阿爾塔科技有限公司。17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.50 μmol/mL）：富士膠片和光純藥株式會(huì)社東京工廠。

焙烤食品（面包、餅干等）和油炸食品（薯片、沙琪瑪、麻花等）均為市售品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

將1000 mg/L的賴丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品用水稀釋成質(zhì)量濃度為0.50、1.00、5.00、10.0、50.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品直接酸水解

準(zhǔn)確稱取1.00 g（精確至 0.01g）粉碎后樣品于25 mL水解管中，加入10 mL濃度為6 mol/L的HCl溶液，密封，110 ℃下水解24 h。

1.3.2 樣品按脫脂、酸水解蛋白的步驟處理準(zhǔn)確稱取1.00 g（精確至 0.01g）粉碎后樣品置于50 mL離心管中，加入正己烷10 mL，渦旋離心棄去正己烷層，重復(fù)上述步驟2次并氮吹去除正己烷。脫脂后的樣品用濃度為6 mol/L HCl的溶液10 mL轉(zhuǎn)移至 25 mL水解管中，110 ℃下水解24 h。

1.3.3 樣品按脫脂、還原、酸水解蛋白的步驟處理

準(zhǔn)確稱取1.00 g（精確至0.01g）粉碎后樣品置于50 mL離心管中，加入正己烷10 mL，渦旋離心棄去正己烷層，重復(fù)上述步驟2次并氮吹去除正己烷。脫脂后的樣品加入10 mL硼砂鹽緩沖溶液（0.2 mol/L）渦旋混勻，再加入1 mL硼氫化鈉溶液（2.0 mol/L），混勻后4 ℃冷藏過夜。離心，棄去上清液。將樣品用10 mL，濃度6 mol/L的HCl溶液轉(zhuǎn)移至25 mL水解管中，110 ℃下水解24 h。

1.3.4 用水直接提取

準(zhǔn)確稱取1.00 g（精確至0.01 g）粉碎后樣品于10 mL容量瓶中，加入5 mL水超聲提取20 min，之后用水定容至10 mL，測(cè)定樣品中游離的賴丙氨酸。

水解管取出自然冷卻后將水解液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，并用水定容搖勻、過濾。準(zhǔn)確分取5.00 mL濾液于10 mL比色管中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的NaOH溶液調(diào)pH值為5.0～6.0，用水定容至10 mL， 渦旋混勻備用。

1.4 儀器條件

1.4.1 氨基酸分析儀條件

色譜柱：HITACHI 陽離子交換柱（60 mm×4.6 mm×3μm）。

流動(dòng)相：A相為檸檬酸鈉溶液（0.020 mol/L，pH3.3）；B相為檸檬酸鈉溶液（0.026 mol/L，pH3.2）；C相為檸檬酸鈉溶液（0.045 mol/L，pH4.0）；D相為檸檬酸鈉溶液（0.091 mol/L，pH4.9）；E相為再生液。柱后衍生劑：R1茚三酮溶液；R2緩沖液；R3乙醇溶液（5%）。

梯度洗脫程序?yàn)椋?～2.5 min，100% A；2.6～5.0 min，100 %B；5.1～12.8 min，100% C；12.9～27.0 min，100%D；27.1～33.0 min，100%E；33.1～34.0 min，100 %B；34.1～53.0 min，100%A。（流速0.40 mL/min）。

衍生程序：0～32.0 min，50%R1+50%R2；32.1～37.0 min，100% R3；37.1～53.0 min，50 %R1+50%R2（流速0.35 mL/min）。

檢測(cè)波長(zhǎng)：570 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：57 ℃；衍生溫度：135 ℃。

1.4.2 液相色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters BEH C18 (1.7μm，2.1 mm×100 mm)；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈；進(jìn)樣量5 μL；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；梯度洗脫程序：0～5 min，95%～60% A；5.1～8 min，0%A；8.1～10 min，95% A。

離子源：電噴霧離子源（ESI-源）；離子源溫度：350 ℃；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；定量離子m/z 234.1＞84.1，定性離子m/z 234.1＞130.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗(yàn)

分別取賴丙氨酸標(biāo)液、賴丙氨酸及17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品溶液按1.4.1的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（圖1）。從圖1A、圖1B可以看出，在1.4.1所示色譜分析條件下，賴丙氨酸和16種混合氨基酸均能實(shí)現(xiàn)基線分離，且分離度大于1.5。圖1C顯示，實(shí)際樣品檢測(cè)不存在干擾峰。綜上，在該氨基酸分析儀的分析條件下，其他氨基酸組分或樣品成分對(duì)賴丙氨酸含量的測(cè)定無干擾，表明所用方法的專屬性良好。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液（A、B）和樣品溶液（C）的色譜圖

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

以薯片為樣品，比較4種不同樣品前處理方法對(duì)目標(biāo)物檢測(cè)結(jié)果影響（見表2）。結(jié)果表明，未經(jīng)正己烷脫脂處理的樣品（方法①）測(cè)得的賴丙氨酸含量與經(jīng)過正己烷脫脂處理的樣品（方法②）沒有顯著性差別（p＞0.05），未經(jīng)正己烷脫脂處理的樣品并未對(duì)賴丙氨酸造成干擾，但對(duì)前10 min出峰的氨基酸產(chǎn)生了干擾，影響了對(duì)其他氨基酸組分的同時(shí)監(jiān)測(cè)，此外，焙烤及油炸食品油脂含量較高，為避免油脂對(duì)色譜柱的損害，需將樣品進(jìn)行脫脂處理。未經(jīng)NaBH4還原處理的樣品（方法②）測(cè)得的賴丙氨酸含量與經(jīng)過NaBH4還原處理的樣品 (方法③)沒有顯著性差別（p＞0.05），說明高溫酸性水解過程并不會(huì)促使新的賴丙氨酸生成，使樣品中賴丙氨酸的測(cè)定值偏高，因此無須對(duì)樣品進(jìn)行NaBH4還原處理。方法④未檢測(cè)到樣品中游離的賴丙氨酸，說明在食品中賴丙氨酸主要以結(jié)合態(tài)的方式存在，需要對(duì)樣品進(jìn)行水解才能得到賴丙氨酸。

表2 不同處理方式測(cè)得的賴丙氨酸含量（n=3）

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限、定量限

配制 0.50～50.0 mg/L 的6個(gè)系列濃度點(diǎn)的賴丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按色譜條件（1.4.1）進(jìn)行測(cè)定。以測(cè)定賴丙氨酸的質(zhì)量濃度（X，mg/L）為橫坐標(biāo)，賴丙氨酸的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，目標(biāo)物在0.50～50.0 mg/L的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.9999，標(biāo)準(zhǔn)擬合方程為y=1.75×105x+3.39×103。根據(jù)3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算出賴丙氨酸的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為3.33 mg/kg和10.0 mg/kg。

2.3.2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)烘焙及油炸類食品中均含有賴丙氨酸，因此取面包、薯片和餅干3類樣品作為代表性樣品，進(jìn)行3水平3平行的加標(biāo)試驗(yàn)，結(jié)果見表3。由表3可知，該方法加標(biāo)回收率范圍為86.3%～91.3%，RSD為1.47%～4.26%?？梢娫摲椒ň哂辛己玫臏?zhǔn)確度和精密度，適用于烘焙及油炸類食品中賴丙氨酸的測(cè)定。

表3 不同烘焙及油炸類食品中賴丙氨酸的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）

2.4 目標(biāo)物的確證

氨基酸分析儀法采用保留時(shí)間定性，當(dāng)檢出結(jié)果存在不確定因素時(shí)，可采用LC-MS/MS進(jìn)一步確證，儀器參數(shù)見“1.4.2”，其多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）圖見圖2，賴丙氨酸目標(biāo)物可能裂解途徑見圖3。

圖2 賴丙氨酸的MRM圖

圖3 賴丙氨酸可能裂解途徑

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本方法對(duì)市售面包、薯片、餅干、麻花、蛋糕及沙琪瑪共計(jì)30批次樣品進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 市售焙烤及油炸類食品中賴丙氨酸的實(shí)測(cè)含量（n=3）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，油炸類食品中賴丙氨酸的含量遠(yuǎn)高于焙烤類，油炸類食品薯片、麻花和沙琪瑪?shù)戎匈嚤彼岷吭?9.5～250.7 mg/kg之間。焙烤類食品面包、蛋糕、餅干賴丙氨酸的含量在 11.2～101.6 mg/kg之間。結(jié)果也表明同類食品中生產(chǎn)工藝的不同，如加熱溫度的高低、時(shí)間的長(zhǎng)短等也會(huì)使產(chǎn)品中賴丙氨酸含量有很大區(qū)別，如采用較低溫度制作的蒸蛋糕（蛋糕1和蛋糕5）中賴丙氨酸的含量明顯低于高溫烘烤的蛋糕（蛋糕5）。

目前，國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)尚未對(duì)賴丙氨酸含量進(jìn)行限制，但其潛在的危害性不容小覷，因此，建議有關(guān)部門對(duì)焙烤及油炸類食品中的賴丙氨酸進(jìn)行監(jiān)測(cè)，促使生產(chǎn)企業(yè)優(yōu)化生產(chǎn)工藝條件，減少生產(chǎn)過程中賴丙氨酸的生成。

3 討論

賴丙氨酸的形成機(jī)制主要包括2步：第一步是蛋白質(zhì)中的胱氨酸、半胱氨酸、絲氨酸或磷絲氨酸殘基通過β-消除反應(yīng)生成脫氫丙氨酸殘基；第二步是含有共軛雙鍵的脫氫丙氨酸殘基與蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基ε-氨基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)生成賴丙氨酸[16,20]。加熱和堿處理是形成賴丙氨酸的2大因素，隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)食品加工方式、食品組分、滅菌方式、食品儲(chǔ)存條件等都會(huì)促使賴丙氨酸的生成，但賴丙氨酸形成是可以在食品加工過程中通過控制加工工藝進(jìn)行控制。如適度降低pH值，減少游離氨基酸的生成，控制蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生[8,10]；在保證食物質(zhì)量的基礎(chǔ)之上，降低加熱溫度，縮短加熱時(shí)間[17,21]；在生產(chǎn)過程中加入碳水化合物使其與蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，消耗賴氨酸的ε-氨基[22]；使用高壓條件使蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，阻礙氨基酸之間的交聯(lián)；減少產(chǎn)品的貨架期[23]等均能有效控制食品加工過程中賴丙氨酸的產(chǎn)生。

4 結(jié)論

本文建立了焙烤和油炸食品中賴丙氨酸的氨基酸分析儀檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法賴丙氨酸的定量限為10.0 mg/kg，加標(biāo)回收率為86.3%～91.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.47%～4.26%，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，還可以同時(shí)測(cè)定多種氨基酸，可應(yīng)用于焙烤和油炸食品中賴丙氨酸含量的測(cè)定，對(duì)優(yōu)化食品加工工藝條件、保證食品安全及保障消費(fèi)者身體健康具有重要的指導(dǎo)意義。