5個品種草莓莖尖組培快繁體系的建立

毛 敏, 彭安妹, 徐夢琴, 何克勤, 胡能兵, 崔廣榮

(安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院,安徽 鳳陽 233100)

草莓(FragariaⅹananassaDuch.)為薔薇科(Rosaceae)、草莓屬(Fragaria)、多年生的草本植物[1],是一種非常重要的經(jīng)濟(jì)作物[2]。草莓栽培具有短周期、容易管理、強(qiáng)適應(yīng)性等特點(diǎn),在促進(jìn)農(nóng)民增產(chǎn)增收中發(fā)揮著重要作用[3-4]。如今中國在草莓總產(chǎn)量和栽培面積方面,已居于世界前列[5]。

草莓的繁殖方式主要是無性繁殖,匍匐莖繁殖是其最常見的繁殖方式。草莓栽培生產(chǎn)中常見問題是易受病毒侵染,侵染草莓的病毒主要有草莓斑駁病毒、草莓鑲脈病毒、草莓輕型黃邊病毒、草莓皺縮病毒和草莓潛隱環(huán)斑病毒[6]。感染病毒的植株易造成復(fù)合感染,導(dǎo)致草莓植株生長速度變慢、葉片不能正常展開、果實(shí)逐漸變小、果實(shí)的品質(zhì)變差等,一般能使草莓的產(chǎn)量減少30%～80%[7]。病毒病已經(jīng)成為草莓生產(chǎn)上的主要病害之一,且至今沒有發(fā)現(xiàn)任何特效藥物或者通過有效的田間管理措施能防治病毒病[8]。運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)培育草莓脫毒苗,已經(jīng)成為目前恢復(fù)草莓品種特性和維持草莓優(yōu)良性狀的有效途徑。根據(jù)組織培養(yǎng)選取的外植體不同,分為莖尖培養(yǎng)、葉片培養(yǎng)、葉柄培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)及胚培養(yǎng)[9-14]。綜合來看,草莓莖尖培養(yǎng)脫毒效果最好,是目前大規(guī)模生產(chǎn)培育草莓脫毒苗最廣泛、最有效的途徑[15]。

組培試驗(yàn)中常用的培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基,一般草莓外植體的培育采用MS培養(yǎng)基,同時需要配合使用細(xì)胞分裂素和生長素。穆廷云[16]研究發(fā)現(xiàn)不同種類不同劑量的生長調(diào)節(jié)劑,可以對草莓腋芽的發(fā)育方向產(chǎn)生影響。董敬超[17]、羅靜靜等[18]、王艷[19]研究結(jié)果表明,不同品種草莓因基因型不同,適合莖尖培養(yǎng)的附加激素也不同。因此,在對不同品種的草莓進(jìn)行莖尖培育時,要選擇適合的激素種類和劑量。

安徽地區(qū)的草莓種苗大多為本地留種,主要靠自繁自育的栽培模式,長期的無性繁殖方式和連續(xù)多年栽培沒有進(jìn)行種苗脫毒,使草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)受到了嚴(yán)重的影響。本試驗(yàn)通過實(shí)地考察安徽省草莓主產(chǎn)區(qū)長豐和阜陽地區(qū)相關(guān)基地,選擇本地主栽的‘紅顏’‘紅花’‘天仙醉’‘越豐’‘雪兔’等5個品種為材料,建立5個不同品種草莓的莖尖脫毒培育快繁體系,旨在提升本地區(qū)草莓優(yōu)質(zhì)種苗的生產(chǎn)水平,擴(kuò)大脫毒苗的使用面積,為促進(jìn)草莓產(chǎn)業(yè)綠色健康發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 栽種在大棚里的草莓品種‘紅顏’‘紅花’‘天仙醉’‘越豐’‘雪兔’母株的匍匐莖。

1.1.2 基本培養(yǎng)基 MS+5 g/L瓊脂粉+30 g/L蔗糖。

1.1.3 主要藥品 植物生長調(diào)節(jié)劑6-芐基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和激動素(KT)等化學(xué)藥品購于上海稼豐園藝用品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)條件 在基本培養(yǎng)基中添加不同種類、不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑,用1.0 mol/L KOH溶液調(diào)節(jié),pH為5.8～6.0,分裝后在121 ℃條件下滅菌20 min,備用。培養(yǎng)室溫度控制在25 ℃,光照時間為12 h/d。

1.2.2 無菌苗獲取 從田間選取生長旺盛、無病蟲害的草莓植株匍匐莖,剪取長度為5～8 cm莖段,用洗衣粉溶液浸泡10 min,流水反復(fù)清洗直至干凈。將瀝干水后的匍匐莖用無菌水清洗2～3遍;用75%乙醇浸泡30 s,無菌水再清洗2～3遍,用0.1%氯化汞浸泡(浸泡時間見表1),最后用無菌水清洗5～6遍。將消毒后的材料在顯微解剖鏡下進(jìn)行莖尖剝離,剝?nèi)￠L0.2～0.4 mm的莖尖接種到培養(yǎng)基中(基本培養(yǎng)基+0.2 mg/L 6-BA+0.02 mg/L IBA)。每處理接種10瓶,每瓶3個外植體。重復(fù)3次,30 d后統(tǒng)計(jì)苗的再生情況。

表1 不同氯化汞消毒時間對草莓莖尖分化的影響

1.2.3 試管苗增殖 將莖尖培養(yǎng)30 d獲得的無菌芽苗分切成單株,接種于添加了不同濃度、不同種類的植物生長調(diào)節(jié)物的增殖培養(yǎng)基中,共36個植物生長調(diào)節(jié)劑處理和1個空白對照處理,每個處理接種10瓶,每瓶接種3株,重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。

1.2.4 試管苗生根 選取繼代培養(yǎng)后長勢較為健壯、高度3～4 cm的芽苗,去除根部殘留物及多余莖葉,接入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基采用不加植物生長調(diào)節(jié)劑基本培養(yǎng)基,觀察生根情況。

1.2.5 試管苗移栽 選取根部健壯、根長2～3 cm的組培苗進(jìn)行穴盤移栽?；|(zhì)成分質(zhì)量比為草炭土∶珍珠巖∶蛭石=3∶1∶1,移栽時先將草莓苗根部的培養(yǎng)基洗凈,放于0.1%多菌靈溶液中浸泡10 min,移栽至穴盤,基質(zhì)噴灑透水,蓋上透明薄膜及遮陽網(wǎng)。前期保證水分供應(yīng)充足,14 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氯化汞消毒時間對草莓莖尖分化的影響

由圖1和表1可知,在75%乙醇消毒相同時間下,0.1%氯化汞處理時間長短與草莓莖尖的成活率和污染率存在一定的關(guān)系。當(dāng)氯化汞處理時間為2 min時,各個品種草莓莖尖污染率最高,其中‘紅顏’的污染率為40.00%,‘紅花’為33.33%,‘天仙醉’為40.00%,‘越豐’為46.67%,‘雪兔’為53.33%;隨著氯化汞處理時間的增加,各草莓品種莖尖污染率逐漸呈降低趨勢,成活率呈現(xiàn)先升高后降低趨勢,且均在處理6 min時成活率最高,其中‘紅顏’為66.67%,‘紅花’為73.33%,‘天仙醉’為73.33%,‘越豐’為66.67%,‘雪兔’為60.00%。

圖1 不同氯化汞消毒時間對草莓莖尖分化的影響Fig.1 Effects of different mercuric chloride disinfection time on shoot tip differentiation of strawberry

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA和IBA組合對各品種草莓試管苗增殖的影響

從表2可知,培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA和IBA不同濃度組合對5種草莓苗的增殖影響不同?？傮w上看,IBA濃度相同時,隨著6-BA濃度的增加,增殖系數(shù)呈現(xiàn)先增后減的趨勢;當(dāng)6-BA濃度一定時,隨著IBA濃度逐漸增大,增值系數(shù)有逐漸降低的趨勢,但各品種表現(xiàn)略有差異。植物生長調(diào)節(jié)劑0.4 mg/L 6-BA+0.06 mg/L I-BA組合時,‘紅顏’最高增殖系數(shù)為5.38;植物生長調(diào)節(jié)劑為0.6 mg/L 6-BA+0.03 mg/L IBA組合時,‘紅花’最高增殖系數(shù)為6.44;植物生長調(diào)節(jié)劑為0.2 mg/L 6-BA+0.06 mg/L IBA組合時,‘天仙醉’最高增殖系數(shù)為3.95;植物生長調(diào)節(jié)劑為0.2 mg/L 6-BA+0.06 mg/L I-BA組合時,‘越豐’最高增殖系數(shù)為5.75;植物生長調(diào)節(jié)劑為0.2 mg/L 6-BA+0.06 mg/L IBA組合時,‘雪兔’最高增殖系數(shù)為4.58。

表2 6-BA和IBA組合對草莓試管苗增殖的影響

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA和NAA組合對各品種草莓試管苗增殖的影響

表3顯示,5個草莓品種在植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA和NAA組合中增殖效果較差。當(dāng)6-BA濃度一定的情況下,隨著NAA濃度的提高各品種草莓增殖系數(shù)有降低的趨勢; 當(dāng)NAA濃度一定的情況下,隨著6-BA濃度的變化各草莓品種增殖系數(shù)變化不明顯。在各組合中,5個草莓品種的增殖系數(shù)在不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合中也存在著一定的差異,其中‘紅顏’增殖系數(shù)最高為3.12;‘紅花’增殖系數(shù)最高為4.18;‘天仙醉’增殖系數(shù)最高為2.60;‘越豐’增殖系數(shù)最高為2.60;‘雪兔’增殖系數(shù)最高為3.08。

表3 6-BA和NAA組合對草莓試管苗增殖的影響

2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑KT和IBA組合對各品種草莓試管苗增殖的影響

從表4可知,除‘紅花’外,培養(yǎng)基中KT和IBA各種組合對其他4個草莓品種增殖影響并不明顯,與空白對照相比,培養(yǎng)基中添加一定量的植物生長調(diào)節(jié)劑IBA或KT對草莓增殖也有一定的促進(jìn)作用,但植物生長調(diào)節(jié)劑濃度變化對增殖系數(shù)影響不大。培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑為1.5 mg/L KT+0.06 mg/L IBA組合時,‘紅顏’增殖系數(shù)最高為4.00;植物生長調(diào)節(jié)劑為1.0 mg/L KT+0.03 mg/L IBA組合時,‘紅花’增殖系數(shù)最高為5.08;植物生長調(diào)節(jié)劑為1.0 mg/L KT+0.03 mg/L IBA組合時,‘天仙醉’增殖系數(shù)最高為3.50;植物生長調(diào)節(jié)劑為1.0 mg/L KT+0.03 mg/L IBA組合時,‘越豐’增殖系數(shù)最高為3.15;植物生長調(diào)節(jié)劑為1.5 mg/L KT+0.06 mg/L IBA組合時,‘雪兔’增殖系數(shù)最高為2.70。

表4 KT和IBA組合對草莓試管苗增殖的影響

2.5 植物生長調(diào)節(jié)劑KT和NAA組合對各品種草莓試管苗增殖的影響

表5表明,植物生長調(diào)節(jié)劑KT和NAA組合對草莓增殖效果也不好,部分組合增殖效果與對照接近。其中‘紅顏’增殖系數(shù)最高為2.50;‘紅花’增殖系數(shù)最高為3.81;‘天仙醉’增殖系數(shù)最高為3.15;‘越豐’增殖系數(shù)最高為2.41;‘雪兔’增殖系數(shù)最高為2.70。而在2類植物生長調(diào)節(jié)劑高濃度組合(1.5 mg/L KT+0.09 mg/L IBA)時,各草莓品種增殖系數(shù)與空白對照接近,甚至低于空白對照,表現(xiàn)出一定的增殖抑制效應(yīng)。

表5 KT和NAA組合對草莓試管苗增殖的影響

綜合比較表2～5結(jié)果,用于草莓品種‘紅顏’‘紅花’‘天仙醉’‘越豐’‘雪兔’脫毒試管苗增殖的植物生長調(diào)節(jié)劑組合應(yīng)首選6-BA和IBA組合,最適合上述5個品種脫毒試管苗的植物生長調(diào)節(jié)劑組合分別為MS+0.4 mg/L 6-BA+0.06 mg/L IBA、MS+0.6 mg/L 6-BA+0.03 mg/L IBA、MS+0.2 mg/L 6-BA+0.06 mg/L IBA、MS+0.2 mg/L 6-BA+0.03 mg/L IBA、MS+0.2 mg/L 6-BA+0.06 mg/L IBA。在基本培養(yǎng)基中添加上述植物生長調(diào)節(jié)劑組合,各品種草莓不僅增殖系數(shù)最高,且苗長勢也較好,生產(chǎn)中可直接借鑒和應(yīng)用。但6-BA濃度也不宜過高,在6-BA質(zhì)量濃度達(dá)到0.6 mg/L時,‘紅顏’‘天仙醉’‘雪兔’等3個品種試管苗均出現(xiàn)了不同程度的莖稈發(fā)紅,苗老化、發(fā)脆的現(xiàn)象,增殖系數(shù)也出現(xiàn)了下降(圖2A)。5個品種的草莓試管苗在不加任何植物調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中,苗增殖系數(shù)不高,雖葉色濃綠,但長勢偏矮(圖2B)。另外,在5個草莓品種試管苗增殖生產(chǎn)試驗(yàn)中不宜添加NAA,各品種試管苗均出現(xiàn)了不同程度的愈傷組織產(chǎn)生,且隨著NAA濃度的升高,愈傷組織形成越多(圖2D)。

圖2 不同處理草莓試管苗的不同表現(xiàn)Fig.2 Different performance of strawberry test tube seedlings in different treatments注:A為6-BA濃度過高莖稈發(fā)紅、葉片發(fā)脆;B為不添加植物調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基正常試管苗;C為正常增殖的試管苗;D為添加高濃度NAA時形成的愈傷。

2.6 不同品種草莓試管苗移栽成活率比較

將生根后的草莓試管苗移栽后發(fā)現(xiàn)(圖3),不同品種的試管苗在相同的生根條件下,成活率表現(xiàn)不同(表6)。

表6 不同品種草莓移栽成活率比較

圖3 草莓試管苗生根煉苗狀況Fig.3 Rooting and seedling refining of strawberry test tube seedlings

3 結(jié)論與討論

在草莓組織培養(yǎng)快繁過程中,消毒劑的消毒效果在很大程度上影響草莓組織培養(yǎng)是否成功,相同濃度的氯化汞處理時間不同,對莖尖的消毒效果也不同。隨著氯化汞消毒時間的增長,外植體的污染率逐漸降低,但同時外植體的成活率也逐漸降低,這可能是氯化汞對外植體本身活力造成了不可逆轉(zhuǎn)的傷害引起的。因此,選擇適合的氯化汞消毒時間對試驗(yàn)的成功至關(guān)重要。本試驗(yàn)表明,75%乙醇30 s加上0.1%氯化汞消毒6 min是該試驗(yàn)草莓莖尖消毒的最佳方式,與郭靖[20]的研究結(jié)果基本一致。

植物調(diào)節(jié)劑的種類、濃度以及組合方式是影響植物組織能否高效再生的關(guān)鍵,也是植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)試驗(yàn)中不斷探索的課題,組織培養(yǎng)能夠順利進(jìn)行就是通過外源激素對植物生長和分化過程調(diào)節(jié)的結(jié)果[21]。前人研究結(jié)果表明,草莓莖尖的離體發(fā)育過程受多種激素共同協(xié)作調(diào)控[22-23]。本研究結(jié)果顯示,在草莓芽苗的增殖過程中,不同品種對植物生長調(diào)節(jié)劑的種類、使用濃度的需求不同。顏昌敬[24]研究發(fā)現(xiàn),草莓試管苗生根很容易,在不添加任何激素的培養(yǎng)基上就能生出大量根系;張建盈等[25]發(fā)現(xiàn),不添加IBA的1/2MS培養(yǎng)基是‘白雪公主’草莓最適宜的生根培養(yǎng)基,生根率達(dá)100%。本研究雖然沒有做草莓生根培養(yǎng)基的篩選,但在增殖過程中,試管苗在不同植物調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)基中生根狀態(tài)也不同。為了使試管苗在移栽之前體內(nèi)激素盡可能的低,本試驗(yàn)以不加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的基本培養(yǎng)基為生根培養(yǎng)基,生根率也可達(dá)100%,且所有品種的草莓試管苗長勢健壯,顏色濃綠,根系粗壯。