超聲造影表現(xiàn)評(píng)估乳腺癌患者血管生成擬態(tài)的可行性及其與Ki-67 增殖指數(shù)的關(guān)系

宋鵬媛，劉麗娜，慈麗娜，王 卓，付趙虎，張鴻瑞

乳腺癌（breast cancer）是一種發(fā)病率和致死率均極高的惡性腫瘤，是導(dǎo)致全球女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，且其發(fā)病率仍在不斷增長[1，2]。 現(xiàn)已有大量研究證實(shí)，血管生成對(duì)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程有著重要的影響。傳統(tǒng)的抗血管生成治療對(duì)乳腺癌的治療效果已十分確切，但其療效始終較差。有文獻(xiàn)顯示[3，4]，部分患者在病程早期， 腫瘤大小未超過臨床體積時(shí)，已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移， 甚至抗血管治療促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展。這表明除腫瘤血管生成以外，可能有其他途徑為腫瘤細(xì)胞的增殖生長提供了養(yǎng)分。血管生成擬態(tài)（vascular mimicry，VM）是一種新的腫瘤血液運(yùn)輸途徑，主要由腫瘤細(xì)胞包圍而成。腫瘤細(xì)胞通過分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分和自身塑形來圍成管道結(jié)構(gòu)，在惡性程度高和易發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞中普遍存在VM[5]。有文獻(xiàn)指出[6~8]，在卵巢癌、骨肉瘤、肺癌等惡性腫瘤中存在VM，且存在VM 的惡性腫瘤患者的預(yù)后均較差，生存率普遍偏低。 VM 有望成為治療惡性腫瘤的新靶點(diǎn)，但其具體形成機(jī)制尚未明確。Ki-67 是一種增殖細(xì)胞核相關(guān)抗原， 其功能與細(xì)胞的增殖過程密切相關(guān)，Ki-67 的表達(dá)水平越高，表明癌細(xì)胞增殖活躍度越高，侵襲和轉(zhuǎn)移能力也越強(qiáng)[9]。 Ki-67 可特異性地反映腫瘤細(xì)胞的增殖指數(shù)。目前關(guān)于超聲造影評(píng)估乳腺癌患者VM 的可行性及VM 與Ki-67 增殖指數(shù)的關(guān)系分析研究較少，筆者研究以186 例乳腺癌患者作為研究對(duì)象探討其超聲圖像特征，便于輔助臨床鑒別乳腺癌。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2018 年3 月至2020 年3 月在邢臺(tái)市第三醫(yī)院收治的經(jīng)手術(shù)病理診斷為乳腺癌患者186 例，均為女性，年齡30 ～67 歲，平均年齡54.38 歲（標(biāo)準(zhǔn)差10.47 歲）；腫瘤直徑1.3 ～4.3 cm，平均直徑2.87 cm（標(biāo)準(zhǔn)差1.54 cm）；腫瘤臨床分期，Ⅰ期51 例，Ⅱ期69 例， Ⅲ期29 例， Ⅳ期37 例； 腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移87例，無轉(zhuǎn)移99 例。均于術(shù)前完善常規(guī)超聲和超聲造影檢查，術(shù)后標(biāo)本行病理檢查。 所有患者均行改良根治術(shù)，臨床資料完整。 所有患者及其家屬均知曉該研究方案且簽署同意書，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)已批準(zhǔn)該方案實(shí)施。

選擇標(biāo)準(zhǔn)： ①均經(jīng)病理學(xué)明確診斷為乳腺癌患者，且均為單病灶；②均接受改良根治術(shù)治療；③術(shù)前均完善常規(guī)超聲和超聲造影檢查；④超聲檢查前均無化學(xué)治療、放射治療及內(nèi)分泌治療史，未行空心針活檢；⑤臨床資料完整，且依從性較好。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心肝腎功能不全者；②造血功能存在障礙者；③對(duì)造影劑過敏者；④合并乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，或其他部位原發(fā)灶者；⑤雙側(cè)乳腺病灶或一側(cè)乳腺多病灶者。

1.2 方法

1.2.1 超聲檢查

檢測(cè)儀器選用系統(tǒng)自帶軟件超聲造影匹配成像技術(shù)的意大利百勝M(fèi)yLab Class C 彩色多普勒超聲診斷儀，探頭為LA 522E 變頻線針探頭，調(diào)節(jié)頻率為3 ～13 MHz；先注入0.5 mL 0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）進(jìn)行“水化”處理，而后注入造影劑，取患者仰臥姿勢(shì)，解開衣衫，暴露雙側(cè)乳房，應(yīng)用常規(guī)超聲模式觀察并記錄其灰階和血流圖像特征，可根據(jù)血流分布情況選定病灶最佳切面。固定探頭，并調(diào)整為超聲造影模式，設(shè)置造影參數(shù)， 將配置完成的4.8 mL 造影劑混懸液經(jīng)肘靜脈注入患者體內(nèi)，以0.9 %氯化鈉溶液（生理鹽水）進(jìn)行沖管，并將造影全過程記錄存盤。

1.2.2 圖像分析

參照文獻(xiàn)[10]中超聲造影觀察指標(biāo)，觀察實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)造影圖像達(dá)峰時(shí)整個(gè)病灶內(nèi)造影劑的分布情況，如造影劑分布均勻性、 有無穿通支血管、 增強(qiáng)強(qiáng)度、范圍、形式、形態(tài)及模式等。所有圖像分析均由超聲造影經(jīng)驗(yàn)＞3 年的醫(yī)師進(jìn)行，并由另1 名相同資歷的醫(yī)師對(duì)結(jié)果進(jìn)行再次核實(shí)，取2 名醫(yī)師的共同意見。

1.2.3 術(shù)后病理檢查

1.2.3.1 蘇木精-伊紅染色和CD34-高碘酸-希夫反應(yīng)雙染色 （1）蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法：以4%甲醛溶液固定標(biāo)本后，行石蠟包埋、切片、HE 染色。 待水化后，以蘇木精染核、碳酸鋰液返藍(lán)處理。 所有操作均參照試劑盒說明書執(zhí)行，置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

（2）CD34-高碘酸-希夫反應(yīng)雙染色：組織切片二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色完全后，終止顯色反應(yīng)，將切片置于過碘酸溶液中進(jìn)行氧化反應(yīng)（室溫條件下）5 min，蒸餾水漂洗3 次，而后將Schiff液滴加至組織塊上進(jìn)行避光反應(yīng)，15 min 后， 以蘇木精襯染、分化液分化、樹膠封片，完成所有染色步驟。

1.2.3.2 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片脫蠟至水化，根據(jù)SP 法執(zhí)行操作， 將Ki-67、CD34 第一抗體分別滴加至不同載玻片同一個(gè)組織塊的切片上，4 ℃條件下孵育過夜， 室溫下孵育相應(yīng)的抗體15 min， 而后DAB 顯色、蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，觀察Ki-67陽性表達(dá)情況。

1.2.3.3 判定標(biāo)準(zhǔn) VM 陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：CD34 染色結(jié)果呈陰性的腫瘤細(xì)胞構(gòu)成含有血細(xì)胞的管腔，且其高碘酸-希夫反應(yīng)染色結(jié)果為陽性。

Ki-67 陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核呈棕黃色，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[11]。 根據(jù)陽性細(xì)胞占比進(jìn)行評(píng)分，占比不高于4%為0 分； 占比5%～25 %為1 分； 占比26%～50%記為2 分； 占比51%～75%記為3 分；占比不低于76%記為4 分。 而后根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。 0 分：未著色；1 分：黃色；2 分：棕黃色；3 分：棕褐色。每個(gè)標(biāo)本的表達(dá)強(qiáng)度根據(jù)兩項(xiàng)評(píng)分乘積進(jìn)行分級(jí)：1 級(jí)為陰性（-）；2 級(jí)為弱陽性（+）；3 級(jí)為中度陽性（++）；4 級(jí)為強(qiáng)陽性（+++）；低于3 分記為低表達(dá)；≥4 分記為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示， 行χ2檢驗(yàn)。 預(yù)測(cè)評(píng)估價(jià)值采用受試者工作特性（receiver operating characteristic，ROC）曲線。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.01 為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌VM 陽性及陰性患者臨床病理特征比較

186 例乳腺癌患者， 其中VM 陽性患者48 例（25.81%）。腫瘤平均直徑為（2.87±1.54）cm。根據(jù)患者的VM 診斷結(jié)果將其分為VM 陽性組 （n=48）和VM 陰性組（n=138），兩組腫瘤直徑、臨床分期及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征對(duì)比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=31.908、31.213、15.042，P ＜0.01）。 見表1。

表1 乳腺癌VM 陽性組與VM 陰性組患者臨床病理特征比較Tab.1 Comparison of clinical pathological characteristics between 2 groups

2.2 超聲影像表現(xiàn)

2.2.1 常規(guī)超聲表現(xiàn)

常規(guī)超聲顯示病灶多呈低回聲， 形態(tài)不規(guī)整，邊界不清晰（90.32%，168/186），其中31 例患者腫塊內(nèi)部可見鈣化灶，呈斑片狀或點(diǎn)狀。 156 例患者腫塊內(nèi)部及其周邊可見豐富彩色血流信號(hào)，且可見穿通支。

2.2.2 VM 陽性組與VM 陰性組患者超聲造影特征比較

VM 陽性組患者的超聲造影特征為不規(guī)整形態(tài)、不清晰邊界及快進(jìn)快退和快進(jìn)慢退增強(qiáng)模式；VM 陰性組患者的超聲造影特征為形態(tài)規(guī)整、 邊界清晰，以及慢進(jìn)慢退和慢進(jìn)快退增強(qiáng)模式。 兩組間增強(qiáng)形態(tài)、增強(qiáng)邊界、增強(qiáng)模式對(duì)比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)意義（χ2=38.041、52.926、32.534，P ＜0.01）。 兩組造影均勻性、增強(qiáng)強(qiáng)度等超聲造影特征對(duì)比， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。 見表2 和圖1、2。

圖1 VM 陽性組超聲造影圖和病理圖Fig.1 Images of contrast-enhanced ultrasound and pathological in VM-positive group

圖2 VM 陰性組超聲造影圖和病理圖Fig.2 Images of contrast-enhanced ultrasound and pathological in VM-negative group

表2 VM 陽性組與VM 陰性組患者超聲造影特征比較例（%）Tab.2 Comparison of contrast-enhanced ultrasound features between 2 groupscases（%）

2.3 超聲造影特征鑒別診斷VM 陽性的ROC 曲線分析

ROC 曲線分析結(jié)果顯示， 超聲造影增強(qiáng)形態(tài)、增強(qiáng)邊界、 增強(qiáng)模式診斷VM 陽性的ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.746、0.778、0.682， 其中增強(qiáng)邊界的診斷價(jià)值最高， 準(zhǔn)確度為86.2%，靈敏度為69.4%，特異度為91.5%。見圖3、表3。

圖3 超聲造影特征鑒別診斷VM 陽性的ROC 曲線Fig. 3 ROC curve of contrast-enhanced ultrasound features in differential diagnosis of VM-positive

表3 超聲造影特征鑒別診斷VM 陽性的診斷效能Tab.3 Diagnostic efficacy of contrast-enhanced ultrasound features in differential diagnosis of VM-positive

2.4 乳腺癌病理組織中Ki-67 的表達(dá)情況與VM表達(dá)的相關(guān)性

Ki-67 的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果示，Ki-67 高度表達(dá)，表達(dá)率為70.97%（132/186）。 Ki-67 高表達(dá)組中VM 陽性率為43.94%（58/132）， 較Ki-67 低表達(dá)組VM 陽性率20.37%（11/54）明顯偏高（χ2=9.123，P ＜0.05）。 見圖4。

圖4 VM 陽性組與VM 陰性組病理組織中Ki-67 的表達(dá)病理圖Fig.4 Images of Ki-67 expression in pathological tissues of VM-positive group and VM-negative group

3 討論

新生血管的生成是腫瘤細(xì)胞增殖生長的關(guān)鍵所在，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)2 ～3 cm 時(shí)，為滿足腫瘤的生長所需，腫瘤血管的生長速度會(huì)顯著加快。 內(nèi)皮依賴性血管、馬賽克血管及VM 是目前已知的3 種惡性腫瘤血管供應(yīng)模式。 其中VM 是一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤血管模式，其形成無需依賴血管內(nèi)皮細(xì)胞，而是由高侵襲性腫瘤細(xì)胞經(jīng)自身變形后圍成[12，13]。 此種由腫瘤細(xì)胞圍成的管狀結(jié)構(gòu)與真正的血管功能十分相似，在管腔型乳腺癌、前列腺癌及卵巢癌等多種惡性腫瘤中均已發(fā)現(xiàn)VM 的存在。 VM 可使得腫瘤細(xì)胞不受血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障作用的影響， 與血液直接接觸進(jìn)而發(fā)生轉(zhuǎn)移[14]?，F(xiàn)階段臨床上針對(duì)VM 的檢測(cè)大多局限于大體病理切片和分子影像實(shí)驗(yàn)，超聲造影表現(xiàn)評(píng)估乳腺癌患者VM 的可行性仍有待進(jìn)一步探討。 超聲造影可輔助臨床了解腫瘤病變病灶內(nèi)部的微循環(huán)灌注情況，便于診斷腫瘤性疾病[15，16]。

筆者研究186 例乳腺癌中48 例VM 陽性患者，VM 陽性率為25.81%。 對(duì)比VM 陽性組和VM 陰性組的臨床病理特征，結(jié)果顯示，兩組患者的腫瘤直徑、臨床分期及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況差異顯著，其中VM陽性組腫瘤直徑＞2 cm，合并腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期較晚的患者人數(shù)明顯多于VM 陰性組， 這表明VM 具有較高的侵襲性。

筆者研究通過超聲造影表現(xiàn)來評(píng)估乳腺癌患者的VM 表達(dá)情況， 結(jié)果顯示，VM 陽性組患者的超聲造影特征與VM 陰性組間差異存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，增強(qiáng)模式明顯不同。分析其原因可能是因?yàn)槟[瘤中心和腫瘤邊緣地帶的VM 較多， 加上VM 結(jié)構(gòu)多不規(guī)則，彼此鏈接構(gòu)成環(huán)狀網(wǎng)絡(luò)通路，并活躍度較高，故在形態(tài)上呈現(xiàn)為形狀不規(guī)則、邊界不清晰[17，18]。此外，VM呈陽性的腫瘤可能會(huì)使得乳腺癌細(xì)胞的侵襲性增強(qiáng)。但筆者研究中VM 陽性病灶超聲造影結(jié)果中，未見病灶擴(kuò)大或內(nèi)部充盈缺損，這可能與VM 具有一定的血液運(yùn)行功能，可保障血液供應(yīng)，進(jìn)而未導(dǎo)致缺血壞死的發(fā)生。 此外，VM 主要是對(duì)腫瘤細(xì)胞的血液運(yùn)行轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用，并非是促進(jìn)其周邊浸潤，因此也未見其周邊出現(xiàn)邊緣擴(kuò)大的情況。

筆者研究通過繪制ROC 曲線對(duì)各因素鑒別VM陽性的診斷效能進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，超聲造影增強(qiáng)形態(tài)、 增強(qiáng)邊界及增強(qiáng)模式診斷VM 陽性的ROC AUC 分別為0.746、0.778 和0.682， 其中增強(qiáng)邊界的診斷價(jià)值最高，準(zhǔn)確度為86.2%，靈敏度為69.4%，特異度為91.5%。這表明VM 形成的不規(guī)則管道樣結(jié)構(gòu)可影響腫瘤的形態(tài)，即可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞形態(tài)傾向不規(guī)整，邊界模糊；且VM 的形成對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖生長具有顯著的促進(jìn)作用，使其侵襲性明顯增強(qiáng)，在超聲造影圖像中便表現(xiàn)為快進(jìn)快退模式。 由此可見，超聲造影表現(xiàn)評(píng)估乳腺癌患者VM 的可行性較高。

Ki-67 是一種與細(xì)胞增殖和復(fù)制密切相關(guān)的增殖細(xì)胞核蛋白抗原，其表達(dá)濃度與細(xì)胞周期的變化相關(guān)。 Ki-67 是反映腫瘤增殖活力的敏感指標(biāo)，其表達(dá)水平與惡性腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展及分化過程均顯著相關(guān)。 劉月平[19]指出，乳腺癌患者腫瘤組織中的Ki-67與病情發(fā)展呈正相關(guān)。 任愛雄等[20]研究也得出了相似的結(jié)論。 崔剛等[21]指出，Ki-67 與血管內(nèi)皮生長因子、Flt-1 等指標(biāo)無明顯相關(guān)性。 與VM 相似，Ki-67 也可促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、浸潤，加速腫瘤進(jìn)展，降低傳統(tǒng)抗腫瘤血管治療效果。 筆者研究結(jié)果顯示，Ki-67 高表達(dá)組中VM 的陽性率較低表達(dá)組顯著偏高。這表明Ki-67 與VM 兩者可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移過程具有協(xié)同促進(jìn)的作用，有望成為輔助臨床診斷乳腺癌的參考指標(biāo)。

綜上所述，VM 和Ki-67 在乳腺癌患者中均高度表達(dá)， 且兩者的表達(dá)水平存在一定的聯(lián)系，Ki-67 可能參與了VM 的生成過程；超聲造影表現(xiàn)對(duì)乳腺癌患者VM 的診斷價(jià)值較高， 可輔助臨床鑒別VM 陽性者。 但筆者研究還存在較大局限性，一方面筆者研究的樣本量較小， 研究結(jié)論仍需擴(kuò)大化試驗(yàn)驗(yàn)證準(zhǔn)確度；另一方面未能深入探討Ki-67 是否參與VM 的生成過程及具體參與機(jī)制，未來將針對(duì)以上問題，展開更深入研究。