枯草芽孢桿菌降解油茶餅中茶皂素及成分變化

羅彥玉,王磊,鄒春霞,賈玉龍

(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院,貴州 貴陽,550000)

油茶餅是油茶籽榨油后的副產(chǎn)物,茶油的普及造成其產(chǎn)量增加,在中國每年約產(chǎn)生1 000萬t[1]。油茶餅含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖和多酚[2],具有很高的經(jīng)濟(jì)價值,是潛在的飼料資源。但其因含茶皂素、單寧,會呈現(xiàn)苦、澀味,有刺激性,會影響動物吸收導(dǎo)致飼用價值低[3]。目前關(guān)于油茶餅的研究主要是通過溶劑提取酚類、多糖、茶皂素等開發(fā)其特性價值,從而實(shí)現(xiàn)油茶油工業(yè)廢棄物的再利用[4-6]。但這對油茶餅的整體利用率極低,耗費(fèi)溶劑、造成原料營養(yǎng)流失的同時,濾渣也會造成環(huán)境污染,于是實(shí)現(xiàn)其資源利用最大化應(yīng)從降解茶皂素的角度出發(fā)。

微生物發(fā)酵法是目前最為常見的方法,已有研究證明芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、檸檬酸桿菌屬等含皂素降解酶,對茶皂素有降解效果[3, 7-8],其中芽孢桿菌的發(fā)酵效果良好[9]。CHANG 等[10]用混合培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌和黑曲霉固態(tài)發(fā)酵降解油茶粕中茶皂素,最佳條件發(fā)酵4 d降解率為(67.84±0.23)%。黃浦等[11]用地衣芽孢桿菌與銅綠假單胞菌混合發(fā)酵降解茶皂素,優(yōu)化后發(fā)酵12.8 d降解率達(dá)到(73.76±0.63)%。研究表明,用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵,最優(yōu)條件下茶皂素降解率均低于70%[12-13]。鑒于此,本研究旨在研究單菌降解效果更好、發(fā)酵時間更短、操作更簡便的固態(tài)發(fā)酵油茶餅的最優(yōu)條件。

考慮到枯草芽孢桿菌有顯著的益生菌潛力[14],會加快腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、抑制有害菌種及促進(jìn)禽畜生長等[15-16],故本研究通過單因素、響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化降解茶皂素的發(fā)酵條件,并對比此時發(fā)酵終點(diǎn)各物質(zhì)含量。一是有助于發(fā)酵期間菌株良好生長,以達(dá)到所需目的,提高茶皂素降解率和降低能耗對于工業(yè)生產(chǎn)具有重要意義;二是綜合評價最優(yōu)條件下其營養(yǎng)物質(zhì)變化規(guī)律,為我國油茶餅綜合利用提供實(shí)際參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶餅,貴州恒生源有限公司;枯草芽孢桿菌,自然發(fā)酵的油茶餅中篩選所得,菌株保藏編號CCTCCM 2022623。營養(yǎng)瓊脂(去除瓊脂則為營養(yǎng)肉湯)、茶皂素標(biāo)品(≥98%),貴州慕為美生物有限公司;無水乙醇、NaCl、香草醛、Na2CO3、HCl、福林酚、AlCl3等化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectra Max190型光吸收酶標(biāo)儀,美谷分子儀器有限公司;H2-16KR型冷凍離心機(jī),湖南可成儀器設(shè)備有限公司;L-8800氨基酸自動分析儀,日立公司;SCIENTZ-18 N 型冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;JK9870型全自動凱氏定氮儀,上海儀電分析儀器有限公司;BSA224S分析天平,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;HH-6恒溫水浴鍋,江蘇金壇市金城國盛實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種子液制備

1.3.2 樣品前處理

油茶餅干燥粉碎,40目篩,按比例與水拌勻,121 ℃滅菌20 min。

1.3.3 茶皂素含量測定

參照田漫漫等[17]的方法提取茶皂素;用香草醛-硫酸顯色法[3]測定茶皂素含量,稍作改動:0.5 mL提取液加0.5 mL 8%香蘭素-乙醇溶液,置冰水浴加4 mL 77% H2SO4溶液輕微晃動搖勻,60 ℃水浴10 min,冷卻至室溫,550 nm記錄吸光度。取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的1 mg/mL茶皂素標(biāo)品溶液補(bǔ)水至0.5 mL同上步驟作標(biāo)準(zhǔn)曲線。降解率按公式(1)計(jì)算:

(1)

式中:X,茶皂素降解率,%;w0,發(fā)酵前油茶餅中茶皂素含量,mg/g;w,發(fā)酵后油茶餅中茶皂素含量,mg/g。

1.4 單因素試驗(yàn)

初始條件:發(fā)酵時間2 d,溫度37 ℃,接種量10%,翻樣(間隔12 h)。分別設(shè)置初始含水量70%、80%、90%、100%、110%、120%;發(fā)酵溫度25、28、31、34、37、40 ℃;接種量2%、4%、6%、8%、10%、12%;發(fā)酵時間12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h。每確定一個因素再進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

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1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

1.5.1 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)中得到的對茶皂素降解率影響較大的因素——含水量(A)、接種量(B)和發(fā)酵溫度(C)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

1.5.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

對響應(yīng)面所得最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證,判定其結(jié)果是否可信。

1.6 成分測定

1.6.1 基本成分

灰分測定參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總灰分的測定》;蛋白質(zhì)測定參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》;脂肪測定參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》;粗纖維測定參照GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》;單寧測定參照 NY/T 1600—2008《水果、蔬菜及其制品中單寧含量的測定 分光光度法》;還原糖測定使用DNS法[18],稍改動,1 mL待測液加1 mL水、1.5 mL DNS試劑,混勻,沸水浴5 min,冷卻加水至10 mL,540 nm測吸光度。

1.6.2 游離氨基酸

樣品前處理參照WEN等[19]的方法,稍作修改,樣品按體積比1∶50加入0.01 mol/L的鹽酸,超聲波浸泡30 min,過濾,上清液按體積比1∶1加入8%的磺基水楊酸,搖勻放置10 min,10 000 r/min離心10 min,上清液過膜(0.22 μm),上機(jī)測定。

1.6.3 活性成分

總糖參照蒽酮硫酸法[20];多糖參照苯酚硫酸法[21]。

總酚參照Folin-Ciocalteau法[22],稍作修改:0.5 mL提取物按V(樣品)∶V(80%甲醇)=1∶10,40 ℃超聲波浸提1 h,循環(huán)3次,過濾定容到50 mL,加水7.5 mL、福林酚0.5 mL、20%的Na2CO31.5 mL混勻黑暗反應(yīng)30 min,765 nm讀數(shù)。取0.1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL按1.3.3節(jié)的方法作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總黃酮采用硝酸鋁比色法[23],1.0 mL提取物按V(樣品)∶V(60%乙醇)=1∶30,浸泡過夜,45 ℃超聲波45 min,重復(fù)提取,定容至100 mL,分別加10%的Al(NO3)3、5%的NaNO2各0.3 mL,搖勻,黑暗放10 min;加4%的NaOH 3.5 mL,定容到10 mL,黑暗放30 min,510 nm測定吸光度。質(zhì)量濃度為1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL按1.3.3節(jié)的方法作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel和SPSS 26.0軟件數(shù)據(jù)處理,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,利用Design-Expert 13軟件完成響應(yīng)面優(yōu)化,利用Origin 2021軟件中的Heat Map with Dendrogram APP進(jìn)行聚類熱圖的繪制。各組重復(fù)3次,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 初始含水量對茶皂素降解率的影響

初始含水量是固態(tài)發(fā)酵的一個重要影響因素,低水分時微生物生長會最小化,高水分時基質(zhì)會被水占據(jù)導(dǎo)致氧氣被排出[24]。圖1-a中90%含水量時降解率達(dá)到66.29%,最適合固態(tài)發(fā)酵降解茶皂素。高于90%時降解率持續(xù)降低,這可能是由于含水量增加使混勻后的油茶餅黏度增加通氣量減少的原因引起的,含水量過低也會影響茶皂素的降解,因此初始含水量選擇90%。

a-初始含水量;b-發(fā)酵溫度;c-接種量;d-發(fā)酵時間圖1 不同單因素對茶皂素降解率的影響Fig.1 Effects of different single factors on degradation rate of tea saponin注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.1.2 發(fā)酵溫度對茶皂素降解率的影響

影響微生物生長的所有生態(tài)生理參數(shù)中最重要的是溫度,其通過影響酶活性對微生物生長、代謝產(chǎn)物的積累產(chǎn)生作用[25]。圖1-b中隨溫度升高菌株對茶皂素的降解率呈現(xiàn)先升后降的趨勢,這是因?yàn)楦邷貢姑甘Щ?低溫會影響菌體生長和產(chǎn)酶速度。37 ℃時茶皂素降解率達(dá)到61.06%顯著高于其他溫度,因此發(fā)酵溫度選擇37 ℃。

2.1.3 菌株接種量對茶皂素降解率的影響

菌株生長速度與接種量直接相關(guān),接種量將影響菌株的降解能力。圖1-c中接種量10%時降解率達(dá)到最大值63.61%。接種量2%～10%時,降解率隨接種量增加而增加,原因是細(xì)菌數(shù)增加縮短了對數(shù)期,其通過種內(nèi)互助快速適應(yīng)新環(huán)境,生長良好,提高降解率。而超過10%時,營養(yǎng)物質(zhì)缺乏使得菌株相互競爭,降解率停止增加甚至減少[26]。故選擇10%的接種量。

2.1.4 發(fā)酵時間對茶皂素降解率的影響

圖1-d是發(fā)酵時間對菌株茶皂素降解率的影響。發(fā)酵前期,隨時間推移降解率一直升高,這是因?yàn)榫戤a(chǎn)生的某些酶類對油茶餅中大分子物質(zhì)進(jìn)行分解[8],促進(jìn)了菌株生長。而60 h后降解率開始逐漸下降,這是營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡,后期不足以供菌體正常生長所致。60、72、84 h時,茶皂素降解率均在60%以上且無顯著性差異,但實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)酵周期較短為好,故確定發(fā)酵時間為60 h,此時降解率為64.99%。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

單因素試驗(yàn)中已確定發(fā)酵時間為60 h,為進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件,利用初始含水量(80%～100%)、發(fā)酵溫度(34～40 ℃)、接種量(8%～12%)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),降解率為響應(yīng)值,其Box-Bnhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Design and results of response surface experiment

回歸方程方差分析結(jié)果見表2,模型極顯著、失擬項(xiàng)不顯著、相關(guān)系數(shù)R2接近于1,表明本試驗(yàn)?zāi)Ｐ秃侠?、可靠性較高。由F值得各因素對降解率的影響順序?yàn)?發(fā)酵溫度(B)>接種量(C)>初始含水量(A)。茶皂素降解率(Y)的二次回歸方程:Y=69.80-0.91A-4.02B+3.82C-1.31AB-2.80AC-2.57BC-0.71A2-8.17B2-11.43C2。加以軟件分析得最佳條件為初始含水量83.669%,發(fā)酵溫度36.301 ℃,接種量10.535%,降解率預(yù)測值71.230%?？紤]實(shí)際操作,確定初始含水量83.7%、發(fā)酵溫度36.3 ℃、接種量10.5%進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),茶皂素降解率為72.18%,接近預(yù)測值,證明本試驗(yàn)的優(yōu)化方法可信。

表2 回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance of regression model

2.3 基本成分變化

如表3所示,發(fā)酵后茶皂素和單寧含量分別顯著降低72.18%、27.27%。發(fā)酵后僅剩6.24%的茶皂素,含量較低,將其添加于飼料中可能會具有改善動物生長性能的潛力[27]。粗蛋白和粗脂肪增加了26.89%和33.48%,粗蛋白增加是由于微生物會向胞外分泌多肽和酶蛋白等物質(zhì)[28]。粗脂肪增加是因?yàn)橛筒栾灠l(fā)酵時某些營養(yǎng)物質(zhì)可能會降解成小分子物質(zhì),如醇和酸發(fā)生酯化反應(yīng),形成酯類物質(zhì),使得乙醚提取物增多[29]。發(fā)酵過程中,基本成分比例會發(fā)生變化,如油茶餅中某些物質(zhì)會被菌株當(dāng)做碳源以供營養(yǎng)所需。而粗纖維和還原糖的變化是由于枯草芽孢桿菌產(chǎn)生纖維素酶,將纖維素降解成低分子還原糖所引起。相比發(fā)酵前,油茶餅發(fā)酵后不良屬性被改善,抗?fàn)I養(yǎng)因子大量降解使得苦、澀味消失,適口性變好;含有營養(yǎng)價值更高的蛋白、脂肪,可用于生產(chǎn)生物發(fā)酵飼料[3],在動物蛋白飼料方面具有一定的應(yīng)用前景。

表3 油茶餅發(fā)酵前后的基本成分Table 3 Basic components of C. oleifera cake before and after fermentation

2.4 游離氨基酸變化

發(fā)酵前后油茶餅的游離氨基酸變化情況見圖2,共16種氨基酸,含7種必需氨基酸。熱圖表明2個樣品的氨基酸含量差異顯著,發(fā)酵后油茶餅總氨基酸含量顯著降低31.42%,必需氨基酸顯著增加16.18%,其中蛋氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸分別顯著增加27倍、1.41倍、1.39倍,這和DAI等[28]用枯草芽孢桿菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵豆粕后必需氨基酸含量增加的研究結(jié)果一致。其他氨基酸如天冬氨酸增加(1.17倍)和甘氨酸降低(57.83%)與YAO等[30]研究相似,枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕后其含量會顯著增加和減少,這是大分子蛋白質(zhì)水解所引起的。天冬氨酸由小分子肽(2～20個氨基酸殘基)和游離氨基酸組成[31],可直接被動物腸道系統(tǒng)吸收,側(cè)方面也證實(shí)發(fā)酵油茶餅可作為飼料的潛在可能性。此外,丙氨酸、精氨酸分別急劇下降70.50%和58.97%,造成總氨基酸的整體下降,這是由于最優(yōu)工藝下菌株長勢良好,消耗過多氨基酸所引起。氨基酸可提供微生物生長所需營養(yǎng),也是重要的呈味物質(zhì),與產(chǎn)品風(fēng)味密切相關(guān)。異亮氨酸、組氨酸、精氨酸等是苦味氨基酸[32],其含量降低表明苦味有所減少,這與2.3節(jié)中茶皂素大幅度降解相對應(yīng),減少了牲畜拒食的可能性?？偟膩碚f,微生物發(fā)酵會使氨基酸有不同程度的變化,如CHEN等[33]發(fā)現(xiàn)納豆芽孢桿菌在不同發(fā)酵時間下大豆粉氨基酸會產(chǎn)生顯著差異。

圖2 油茶餅發(fā)酵前后氨基酸含量的熱圖Fig.2 Heatmap of amino acid content in C. oleifera cake before and after fermentation注:DZB為發(fā)酵前,FJB為發(fā)酵后。

2.5 活性成分變化

黃酮、總酚和糖類是油茶餅最主要的活性成分。表4中總糖和多糖顯著下降28.22%和23.66%,這說明菌株將油茶餅中的糖類當(dāng)作了自身生長所需的碳源,不斷消耗造成了大量減少。這與WAGNER等[34]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌可以降解或使用碳水化合物作為發(fā)酵中自身代謝的能量來源的觀點(diǎn)一致。多糖中葡萄糖是主要的組成單糖之一,可用于菌株的生物合成和代謝,這也是造成其含量下降的原因。多酚和類黃酮是科學(xué)研究中經(jīng)常評估的生物活性化合物,由分析可知枯草芽孢桿菌發(fā)酵油茶餅后總酚和總黃酮含量分別增加了5.56%和30.88%。這與XU等[35]和DAI等[28]的研究一致,大豆發(fā)酵產(chǎn)品與原料的總酚與黃酮含量存在差異;枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕會使總酚和類黃酮含量顯著增加。芽孢桿菌能代謝纖維素并釋放酚類化合物,因?yàn)榉宇惢衔锱c纖維素酶和果膠酶的產(chǎn)生之間具有強(qiáng)烈的相關(guān)性[36];在發(fā)酵時,微生物會產(chǎn)生各種酶類分解植物細(xì)胞的細(xì)胞壁成分,實(shí)現(xiàn)酯鍵水解,釋放酚類物質(zhì),使得總酚含量增加。酚類物質(zhì)是最大的次生代謝物組分之一,也是非必需膳食成分的主要組分,具有廣泛的生物特性,如抗氧化、抗炎和抗癌活性[37]。而發(fā)酵后活性成分增加,為較高市場價值功能性食品、藥物等產(chǎn)品的生產(chǎn)創(chuàng)造了新的契機(jī)。

表4 油茶餅發(fā)酵前后的活性成分Table 4 Active components of C. oleifera cake before and after fermentation

3 結(jié)論與討論

本研究利用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵油茶餅,通過響應(yīng)面優(yōu)化得到降解茶皂素的最佳工藝為初始含水量83.7%,發(fā)酵溫度36.3 ℃,接種量10.5%,發(fā)酵時間60.0 h,此時降解率達(dá)到72.18%。而后對比發(fā)酵終點(diǎn)各類物質(zhì)含量,結(jié)果表明:發(fā)酵會使油茶餅中茶皂素、單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子顯著降低;粗蛋白、粗脂肪、還原糖、必需氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)顯著增加;黃酮等主要活性成分顯著增多,糖類物質(zhì)顯著減少;此外粗纖維、灰分含量也產(chǎn)生變化。綜上,本研究證實(shí)枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵可以一定程度提升油茶餅的營養(yǎng)與活性成分含量,有利于其在發(fā)酵產(chǎn)品中的應(yīng)用與發(fā)展。