基于表面增強(qiáng)拉曼光譜和偶氮偶聯(lián)反應(yīng)對(duì)組氨酸的靈敏檢測(cè)

關(guān) 琦，顏賢仔，余莉莉，王翠萍，曾 佩，張 歡，王純榮

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045）

氨基酸是一種在自然界中普遍存在的具有羧基（—COOH）和氨基（—NH2）的有機(jī)酸，是組成蛋白質(zhì)的基本單位，是生命代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)[1-2]，是維持人體正常生理活性的物質(zhì)，在人體內(nèi)氨基酸可以幫助調(diào)節(jié)自身的免疫力。其中，組氨酸（histidine，His）作為一種半必需氨基酸，對(duì)于嬰幼兒及動(dòng)物的成長(zhǎng)尤其重要；可作為生化試劑和藥劑，還可作為治療心臟病、貧血和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的藥物[3]；His可以通過組胺作用參與神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)；His可以擴(kuò)張血管、降低血壓，在臨床上可用于心絞痛、心功能不全等疾病的治療。因此，對(duì)His的快速檢測(cè)具有重要意義。

目前，氨基酸的檢測(cè)方法主要是分光光度法[4-5]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6]、高效液相色譜法[7-8]、毛細(xì)管電泳法[9-10]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-13]和氨基酸自動(dòng)分析儀[14-16]等；這些檢測(cè)方法存在需要大量繁瑣的樣品前處理和分析時(shí)間較長(zhǎng)等問題。因此，迫切需要建立一種靈敏、快速和穩(wěn)定的氨基酸檢測(cè)方法。

表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）是一種可以提供分子振動(dòng)的專屬性指紋信息并進(jìn)行多重識(shí)別的高靈敏度的振動(dòng)光譜技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)快速、無損和原位檢測(cè)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用到化學(xué)、物理學(xué)、生命科學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域中[17-18]；其中SERS性能優(yōu)異、穩(wěn)定性好和靈敏度高的基底可以對(duì)所測(cè)樣品起到很好的信號(hào)增強(qiáng)效果[19-20]。此外，通過衍生化反應(yīng)有可能進(jìn)一步提高拉曼光譜增強(qiáng)效果，F(xiàn)an Min等[21]采用偶氮偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)合SERS對(duì)正常人和結(jié)腸癌患者血清中的色氨酸含量進(jìn)行檢測(cè)和比較，檢出限低于國家標(biāo)準(zhǔn)。有研究表明，在強(qiáng)酸條件下，胺類物質(zhì)（—NH2）可通過偶氮偶聯(lián)反應(yīng)被氧化為重氮鹽，并與酚類、苯胺和一些雜環(huán)化合物在堿性或中性溶液中發(fā)生偶聯(lián)，生成偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）；此化學(xué)反應(yīng)可以生成擁有大拉曼散射截面的生色團(tuán)，這為增強(qiáng)拉曼檢測(cè)信號(hào)提供了可能[22-23]；Yu Shihua等[24]應(yīng)用偶氮偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)合SERS對(duì)沙丁胺醇進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為2.39 pg/mL。Li Li等[25]將偶氮偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)合SERS對(duì)嬰兒奶嘴中的N-甲基苯胺進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為0.5 mg/L。

本實(shí)驗(yàn)通過將偶氮偶聯(lián)反應(yīng)和SERS結(jié)合的方法對(duì)His進(jìn)行檢測(cè)。以氫氟酸刻蝕法制成的銀枝晶為SERS活性基底，并挑選3 種不同的重氮組分分別與His進(jìn)行偶氮偶聯(lián)反應(yīng)，探討重氮組分種類、固相萃取時(shí)間、Na2CO3質(zhì)量濃度和重氮組分濃度等對(duì)衍生化反應(yīng)產(chǎn)物SERS信號(hào)的影響，探出His的檢出限，并根據(jù)His含量制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性擬合分析，又將此方法應(yīng)用到實(shí)際樣品檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅富士蘋果 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)超市。

硅片（單晶硅）深圳市瑞格銳思科技有限公司；硝酸銀（分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2-氟-4-巰基苯胺（2-fluoro-4-mercaptoaniline，2-F-PATP）（分析純）上海韶遠(yuǎn)試劑有限公司；NaNO2、Na2CO3、丙酮、40%氫氟酸、3-氨基芐胺（3-aminobenzylamine，3-ABL）、3-苯胺磺酸（3-anilinosulfonic acid，3-ACID）、His（均為分析純） 上海阿拉丁生化科技有限公司；實(shí)驗(yàn)中用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

DXR2激光顯微共焦拉曼光譜儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；SU8010場(chǎng)發(fā)掃描電鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 銀枝晶基底的制備

參考文獻(xiàn)[26-27]的方法。取0.5 cm×0.5 cm大小的硅片用去離子水、丙酮超聲清洗15 min后，將晾干后的硅片在10%氫氟酸溶液中浸泡30 min進(jìn)行酸刻蝕；將刻蝕后的硅片放入2 mol/L硝酸銀和40%氫氟酸（1∶50，V/V）的混合溶液中，浸泡10 min，銀離子被還原成銀，在硅片表面形成一層均勻的銀納米，用去離子水淋洗后，60 ℃烘干，備用。

1.3.2 溶液配制

1×10-5mol/L His溶液：稱取所需His固體的質(zhì)量，加入少量去離子水和鹽酸溶解His，再置于100 mL容量瓶用去離子水定容；4×10-3mol/L 3-ABL/3-ACID/2-F-PATP溶液：稱取所需3-ABL/3-ACID/2-F-PATP的質(zhì)量，用0.12 mol/L鹽酸溶液配制，記為試劑A；質(zhì)量濃度5 g/100 mL NaNO2溶液：稱取所需NaNO2固體的質(zhì)量，加入去離子水溶解并置于100 mL容量瓶中定容，記為試劑B；質(zhì)量濃度10 g/100 mL Na2CO3溶液：稱取所需Na2CO3固體的質(zhì)量，加入去離子水溶解并置于100 mL容量瓶中定容，記為試劑C。以上試劑其他濃度均用去離子水逐級(jí)稀釋，并均放置在4 ℃保存。蘋果切塊榨汁過濾后備用。

1.3.3 偶氮偶聯(lián)反應(yīng)及拉曼光譜信號(hào)采集與數(shù)據(jù)處理

偶氮偶聯(lián)反應(yīng)過程是在冰水浴的磁力攪拌條件下進(jìn)行，試劑A、B、C、His的體積比為1∶1∶1∶2，按照順序加入試劑后，在磁力攪拌下反應(yīng)5 min，然后將銀枝晶基底放入反應(yīng)所得的衍生產(chǎn)物溶液中浸泡，進(jìn)行固相萃取[28]，取出晾干后進(jìn)行拉曼檢測(cè)。拉曼光譜儀采集參數(shù)：激光波長(zhǎng)785 nm，激光能量5 mW，分辨率5 cm-1，單次采集曝光時(shí)間為2 s，光譜掃描范圍為500～2000 cm-1。光譜數(shù)據(jù)采用TQ 9.7軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 SERS基底的結(jié)構(gòu)特征

銀枝晶基底是由氫氟酸刻蝕法制備，采用SU8010場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡對(duì)銀枝晶的表面形貌進(jìn)行表征。圖1顯示銀枝晶的形貌如樹枝狀，表面被密集覆蓋，有很多潛在的“熱點(diǎn)”[29-32]，在作為SERS活性基底方面有很大的應(yīng)用潛力。

圖1 銀枝晶的SEM圖片F(xiàn)ig.1 SEM photos of silver dendrite

2.2 銀枝晶基底的穩(wěn)定性檢測(cè)

SERS基底性能的穩(wěn)定性對(duì)其應(yīng)用具有顯著影響。圖2中檢測(cè)結(jié)果都是在2-F-PATP濃度為1×10-3mol/L、Na2CO3質(zhì)量濃度為6 g/100 mL和固相萃取5 min條件下完成；圖2A中15 個(gè)基底上均可檢測(cè)到His偶氮偶聯(lián)反應(yīng)后的偶氮產(chǎn)物的2 個(gè)特征峰，拉曼光譜強(qiáng)度比較穩(wěn)定；由圖2B可以看到，His偶氮產(chǎn)物在同一基底上特征峰為1432 cm-1處的拉曼光譜強(qiáng)度變化，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為2.38%，平均強(qiáng)度變化小于10%。以上結(jié)果可以表明銀枝晶作為SERS基底用于檢測(cè)His有較好的穩(wěn)定性。

圖2 在15 個(gè)基底上測(cè)得His偶氮產(chǎn)物的SERS光譜圖（A）及同一基底15 個(gè)位置1432 cm-1處的拉曼光譜強(qiáng)度圖（B）Fig.2 SERS spectra of the histidine azo product measured on 15 substrates (A),Raman spectral intensity at 1432 cm-1 for 15 positions on the same substrate (B)

2.3 His常規(guī)拉曼光譜

如圖3所示，His固體拉曼光譜中1092 cm-1處特征峰為面內(nèi)C—H彎曲振動(dòng)峰，1178 cm-1處特征峰為C—N伸縮振動(dòng)峰，1272 cm-1處特征峰為面內(nèi)C—C彎曲振動(dòng)峰，1321 cm-1處特征峰來自CH2搖擺[33]。圖3中，His溶液濃度為10-3mol/L，其拉曼光譜檢測(cè)時(shí)使用銀枝晶基底。研究顯示，His溶液基本檢測(cè)不到其特征峰拉曼光譜。因此，檢測(cè)His的拉曼光譜需要改進(jìn)檢測(cè)方法。

圖3 His常規(guī)拉曼光譜Fig.3 Conventional Raman spectra of His

2.4 重氮組分的篩選

將同一濃度His分別與3 種重氮組分進(jìn)行偶氮偶聯(lián)反應(yīng)。選取其中出現(xiàn)偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）特征峰[34]在1380～1440 cm-1范圍內(nèi)，拉曼光譜指紋圖譜清晰，且SERS信號(hào)增強(qiáng)效果顯著的重氮組分。從圖4可以看出，空白銀枝晶基底的光譜圖接近平線，因此在利用銀枝晶基底對(duì)His偶氮產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)沒有影響。在3 種重氮組分中，3-ABL與His偶氮偶聯(lián)反應(yīng)后其產(chǎn)物在1001、1139、1227、1399 cm-1和1595 cm-1處出現(xiàn)拉曼光譜特征峰。其中，His偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）特征峰為1399 cm-1，不過該峰的拉曼光譜信號(hào)強(qiáng)度較低（圖4A）。當(dāng)3-ACID用作重氮組分與His偶氮偶聯(lián)反應(yīng)后在995、1190、1384 cm-1和1589 cm-1處出現(xiàn)拉曼光譜特征峰。其中，His偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）特征峰為1384 cm-1，其拉曼光譜信號(hào)強(qiáng)度不高，且特征峰不明顯（圖4B）。2-F-PATP用作重氮組分時(shí)，與His偶氮偶聯(lián)反應(yīng)后在1064、1209、1246、1335、1387、1432 cm-1和1586 cm-1處出現(xiàn)拉曼光譜特征峰，可以在1387 cm-1和1432 cm-1發(fā)現(xiàn)His偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）特征峰，且特征峰處的拉曼光譜信號(hào)比較顯著（圖4C）。根據(jù)偶氮產(chǎn)物特征峰的拉曼光譜信號(hào)強(qiáng)弱以及拉曼指紋圖譜形狀，最終選取2-F-PATP進(jìn)行后續(xù)研究。

圖4 3-ABL（A）、3-ACID（B）和2-F-PATP（C）與His偶氮產(chǎn)物SERS光譜Fig.4 SERS spectra of the azo products of 3-ABL (A),3-ACID (B) and 2-F-PATP (C) with His

2.5 固相萃取時(shí)間對(duì)偶氮產(chǎn)物SERS信號(hào)的影響

從圖5可以看出，固相萃取時(shí)間為5 min時(shí)，SERS信號(hào)最強(qiáng)，有比較顯著的效果，在萃取時(shí)間超過5 min后，SERS信號(hào)隨之減弱，得出固相萃取時(shí)間5 min為銀枝晶基底浸泡在His偶氮產(chǎn)物的溶液中萃取的適宜條件。

圖5 不同固相萃取時(shí)間的His偶氮產(chǎn)物SERS光譜Fig.5 SERS spectra of the histidine azo products with different solidphase extraction time

2.6 Na2CO3質(zhì)量濃度對(duì)偶氮產(chǎn)物SERS信號(hào)的影響

Na2CO3作用是調(diào)節(jié)重氮鹽溶液酸堿度，其含量對(duì)反應(yīng)有一定影響。圖6顯示：在5 種不同Na2CO3質(zhì)量濃度下，都會(huì)產(chǎn)生偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）的特征峰。根據(jù)圖6選取特征峰（1387 cm-1和1432 cm-1）的拉曼光強(qiáng)度變化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Na2CO3質(zhì)量濃度為6 g/100 mL時(shí)，SERS信號(hào)增強(qiáng)效果最好，因此選取此質(zhì)量濃度作進(jìn)一步研究。

圖6 不同質(zhì)量濃度Na2CO3對(duì)His偶氮產(chǎn)物影響的SERS光譜Fig.6 SERS spectra of the effects of different concentrations of Na2CO3 on histidine azo products

2.7 2-F-PATP濃度對(duì)偶氮產(chǎn)物SERS信號(hào)的影響

圖7顯示：在2-F-PATP濃度為0.25×10-3、0.5×10-3mol/L和4×10-3mol/L時(shí)，均未發(fā)現(xiàn)明顯的偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）的特征峰信號(hào)；在2-F-PATP濃度為0.5×10-3、1×10-3mol/L下，都產(chǎn)生了偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）的特征峰信號(hào)。其中2-F-PATP濃度為1×10-3mol/L時(shí)SERS信號(hào)增強(qiáng)效果更顯著。

圖7 不同濃度2-F-PATP與His偶氮產(chǎn)物的SERS光譜Fig.7 SERS spectra of the histidine azo products adding 2-fluoro-4-mercaptoaniline with different concentrations

2.8 His含量定量分析

用濃度為1×10-3mol/L的2-F-PATP作為重氮組分與不同濃度（10-21～10-13mol/L）的His進(jìn)行偶氮偶聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)中固相萃取時(shí)間5 min、Na2CO3質(zhì)量濃度6 g/100 mL。由圖8A可以看出，5 個(gè)濃度都可以檢測(cè)出偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）特征峰為1387 cm-1和1432 cm-1的SERS信號(hào)，并且隨著His濃度增加偶氮產(chǎn)物（—N＝N—）特征峰的SERS信號(hào)也有明顯增加趨勢(shì)；圖8B和C分別是以His濃度結(jié)合特征峰1387 cm-1和1432 cm-1處拉曼光譜強(qiáng)度制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以看出特征峰1387 cm-1和1432 cm-1處拉曼光譜強(qiáng)度與His溶液濃度線性相關(guān)性良好。線性擬合方程分別為y=173266.3855+7893.8895x和y=178462.959+8115.819x，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.97561和0.96884，均大于0.95，結(jié)果說明銀枝晶作為SERS基底靈敏度較高，將偶氮偶聯(lián)反應(yīng)和SERS結(jié)合的方法較可靠，可以用來對(duì)微量氨基酸進(jìn)行定量分析。

圖8 不同濃度His反應(yīng)得到的偶氮產(chǎn)物SERS光譜（A）及1387 cm-1（B）和1432 cm-1（C）處特征峰的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 SERS spectra of the azo product with different histidine concentrations (A),standard curve of the characteristic peak at 1387 cm-1 (B) and 1432 cm-1 (C)

2.9 實(shí)際樣品中的應(yīng)用

使用偶氮偶聯(lián)反應(yīng)對(duì)含有His殘基的不同濃度的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）、α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）和蘋果汁進(jìn)行拉曼檢測(cè)。從圖9A～C可以看出，直接檢測(cè)蛋白并未檢測(cè)到偶氮產(chǎn)物的特征峰；但在1 mg/L和0.1 mg/L的BSA、HAS和α-LA與2-F-PATP偶氮偶聯(lián)反應(yīng)后，都可以檢測(cè)出偶氮產(chǎn)物的特征峰并且SERS信號(hào)顯著。GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定》中液體樣品的His檢出限為2.4 mg/L[35]。紅富士蘋果的蛋白質(zhì)含量約為3 g/kg[36]，制成的蘋果汁稀釋105倍后蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度約為0.015 mg/L，而果汁中His含量遠(yuǎn)低于該國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的His檢測(cè)限。圖9D顯示，紅富士蘋果汁沒有明顯的拉曼光譜，而其稀釋105倍后與重氮組分2-F-PATP進(jìn)行偶聯(lián)偶聯(lián)反應(yīng)仍可以得到顯著的His偶氮產(chǎn)物SERS信號(hào)。以上研究表明本衍生化方法可以應(yīng)用到含His的實(shí)際樣品的檢測(cè)并且靈敏度較高。

圖9 BSA（A）、HSA（B）和α-LA（C）兩種質(zhì)量濃度蛋白偶氮偶聯(lián)反應(yīng)后SERS光譜及蘋果汁稀釋前后偶氮偶聯(lián)反應(yīng)后的偶氮產(chǎn)物和直接在基底上檢測(cè)蘋果汁的SERS光譜（D）Fig.9 SERS spectra of azo products after azo-coupling reactions of two proteins with different concentrations of BSA (A),HSA (B) and α-LA (C);SERS spectra of azo products after azo-coupling reaction before and after dilution of apple juice and SERS spectra of apple juice directly on the substrate (D)

3 結(jié)論

建立了SERS與偶氮偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)合快速靈敏檢測(cè)His的方法。發(fā)現(xiàn)在2-F-PATP濃度為1×10-3mol/L、Na2CO3質(zhì)量濃度為6 g/100 mL，并且固相萃取5 min后即可檢測(cè)到His偶氮產(chǎn)物明顯的拉曼光譜指紋圖譜，且特征峰拉曼光譜強(qiáng)度較高。本方法檢測(cè)His的檢出限為10-21mol/L。根據(jù)特征峰（1397 cm-1和1432 cm-1）對(duì)His進(jìn)行定量分析，His濃度與特征峰拉曼光譜強(qiáng)度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，R2分別為0.97561和0.96884，均大于0.95，具有良好的線性關(guān)系。使用本方法可對(duì)含有His殘基的BSA、HSA、α-LA和蘋果汁這些實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)。該方法靈敏度較高、操作簡(jiǎn)便、檢出限較低，在實(shí)際樣品檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。