正己烷與氯化鈣介導(dǎo)法聯(lián)產(chǎn)提取未破壁螺旋藻的藻藍(lán)蛋白和油脂

郭旭,魏登梟,鐘彩榮,蘭英,何勇錦,2,陳必鏈,2*

1(福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,福建 福州,350117)2(工業(yè)微生物教育部工程研究中心(福建師范大學(xué)),福建 福州,350117)

鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,含有藻藍(lán)蛋白、必需脂肪酸(如亞油酸、γ-亞麻酸)等多種高附加值活性物質(zhì),已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。MA等[1]研究表明,藻藍(lán)蛋白具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血脂和降血糖、抗血栓、抗病毒、調(diào)節(jié)腸道微生物群特性等多重功效。同時(shí),食用亞油酸和γ-亞麻酸可降低機(jī)體的膽固醇與血脂,具有促進(jìn)嬰幼兒認(rèn)知、延緩皮膚衰老等生物學(xué)功能[2]。因此,利用螺旋藻開(kāi)發(fā)藻藍(lán)蛋白、必需脂肪酸等高附加值制品是螺旋藻深加工研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

YU[3]利用螺旋藻提取藻藍(lán)蛋白的方法有浸泡法、反復(fù)凍融法、珠磨法、高壓均質(zhì)法、超聲波破碎法、溶菌酶法等。HADIYANTO等[4]采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取螺旋藻藻藍(lán)蛋白,在溫度52.5 ℃、提取時(shí)間42 min、超聲波頻率42 kHz條件下,獲得藻藍(lán)蛋白最佳得率為15.7%。KFERB?CK等[5]運(yùn)用脈沖電場(chǎng)和反復(fù)凍融組合技術(shù)成功提取了螺旋藻中的藻藍(lán)蛋白,并獲得了高純度的產(chǎn)品。與傳統(tǒng)的珠磨法相比,該方法將藻藍(lán)蛋白的提取率提高了90%。對(duì)于提取螺旋藻油脂,RIZWANUL等[6]也研發(fā)了有機(jī)溶劑提取、超聲波輔助提取、微波輔助提取、超臨界流萃取等方法。DE SOUSA等[7]使用水作為溶劑,利用微波輔助技術(shù)在620 W下連續(xù)提取3次,每次持續(xù)20 s,獲得大約35%的螺旋藻油脂產(chǎn)率。基于現(xiàn)有文獻(xiàn)資料,對(duì)于螺旋藻這類生物質(zhì)資源,研究者的提取方法僅提取螺旋藻中的藻藍(lán)蛋白或油脂。這無(wú)疑會(huì)導(dǎo)致螺旋藻另一種高附加值成份的浪費(fèi)。為此,亟需研發(fā)一種低碳經(jīng)濟(jì)的提取方法,實(shí)現(xiàn)螺旋藻藻藍(lán)蛋白和油脂的聯(lián)產(chǎn)提取,解決現(xiàn)有螺旋藻藻藍(lán)蛋白與油脂提取的技術(shù)瓶頸。

眾所周知,藻藍(lán)蛋白和油脂屬于螺旋藻胞內(nèi)產(chǎn)物。對(duì)于給定的某一提取方法,堅(jiān)韌的螺旋藻細(xì)胞壁會(huì)影響其提取性能[8]。已有研究指出,通過(guò)物理、化學(xué)或生物法破壁螺旋藻,可顯著提高提取性能[5]。但是,對(duì)于規(guī)?；瘧?yīng)用上,前處理破壁工藝無(wú)疑會(huì)增加其提取成本[9]。因此,本研究以未破壁的螺旋藻為原料,選擇食品級(jí)正己烷為有機(jī)溶劑,在室溫條件下,研發(fā)正己烷和鹽介導(dǎo)的提取法聯(lián)產(chǎn)提取藻藍(lán)蛋白和油脂。同時(shí)研究鹽類種類、正己烷-鹽類濃度、料液比等工藝參數(shù)對(duì)聯(lián)產(chǎn)提取藻藍(lán)蛋白和油脂性能的影響,優(yōu)化工藝參數(shù),以獲得最高的提取性能,為工業(yè)化聯(lián)產(chǎn)提取螺旋藻藻藍(lán)蛋白和油脂提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)藻粉,福清市新大澤螺旋藻有限公司。螺旋藻藻粉的總蛋白質(zhì)含量為54.12%,藻藍(lán)蛋白含量為9.91%,糖類化合物含量為18.79%,總油脂含量為13.10%。

CaCl2、NaCl、KCl、NH4Cl、MgCl2(均為分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;CH3COONa、CH3COOK、(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4、檸檬酸鈉、檸檬酸銨、KH2PO4、K2HPO4、正己烷(均為分析純),西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

SHA-B雙功能水浴搖床,江蘇中和實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠;SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;SCION-436氣相色譜儀,天美儀拓實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(上海)有限公司;K9840全自動(dòng)凱氏定氮儀,濟(jì)南海能儀器股份有限公司;BS224S電子秤,北京賽多利斯系統(tǒng)儀器有限公司;H11650-W湘儀離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;BX-51熒光顯微鏡,日本奧林巴斯公司。

1.3 正己烷-鹽介導(dǎo)法聯(lián)產(chǎn)提取未破壁的鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白和油脂

1.3.1 鹽類篩選

稱取0.5 g鈍頂螺旋藻藻粉放入50 mL離心管中,按照料液比1∶40(g∶mL)加入20 mL 50 g/L的CaCl2,再加入20 mL正己烷,在室溫條件下恒定轉(zhuǎn)速下反應(yīng)3 h。然后,將混合體系2 000 r/min離心10 min,以促進(jìn)相分離。取上層正己烷相,在真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)正己烷,得到鈍頂螺旋藻粗油脂。取下層含有藻藍(lán)蛋白的水相,測(cè)定可溶性的螺旋藻藻藍(lán)蛋白。評(píng)估不同鹽類對(duì)聯(lián)產(chǎn)提取螺旋藻藻藍(lán)蛋白和油脂提取率的影響,篩選獲得最適合的鹽類。

1.3.2 優(yōu)化工藝參數(shù)

在所得最適合的鹽類條件下,以藻藍(lán)蛋白和油脂的提取率為指標(biāo),優(yōu)化正己烷-鹽介導(dǎo)法聯(lián)產(chǎn)提取螺旋藻藻藍(lán)蛋白和油脂的工藝參數(shù)(鹽濃度、正己烷與懸浮液的體積比、料液比和提取時(shí)間),獲得鈍頂螺旋藻胞內(nèi)生物活性成分的最佳提取率。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 鈍頂螺旋藻藻粉基本成分的測(cè)定

采用SN/T 1113—2002 《進(jìn)出口螺旋藻粉中藻藍(lán)蛋白、葉綠素含量的測(cè)定方法》測(cè)定鈍頂螺旋藻藻粉中總藻藍(lán)蛋白的含量;采用氯仿-甲醇法測(cè)定鈍頂螺旋藻藻粉總油脂含量[10];采用硫酸-苯酚法測(cè)定鈍頂螺旋藻藻粉中總糖含量[11];采用GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測(cè)定》中凱氏定氮法,測(cè)定鈍頂螺旋藻藻粉中總蛋白質(zhì)含量;通過(guò)氣相色譜儀分析鈍頂螺旋藻粗油脂的脂肪酸組成成分。

1.4.2 藻藍(lán)蛋白和油脂提取率的測(cè)定

取體系下層水相樣品,使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)分別在652和620 nm下測(cè)定吸光值,藻藍(lán)蛋白的質(zhì)量濃度和提取率按公式(1)、公式(2)計(jì)算[12-13]:

(1)

(2)

式中:V1,水相的體積,mL;m1,鈍頂螺旋藻內(nèi)藻藍(lán)蛋白的質(zhì)量,g。

取上層正己烷相在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行旋蒸,將正己烷完全除去之后得到油脂,對(duì)獲得的油脂進(jìn)行稱重,其提取率的計(jì)算如公式(3)所示:

(3)

式中:m2,提取得到的鈍頂螺旋藻內(nèi)油脂的質(zhì)量,g;m3,鈍頂螺旋藻的總油脂質(zhì)量,g。

1.4.3 螺旋藻油脂肪酸組成分析

提取的螺旋藻藻油經(jīng)甲酯化后通過(guò)氣相色譜儀測(cè)定脂肪酸組成。氣相色譜條件[14]:色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣He;升溫程序?yàn)?00 ℃保持1 min,以40 ℃/min升溫至210 ℃,接著以20 ℃/min升溫至250 ℃,保持10 min;檢測(cè)器溫度260 ℃;注射口溫度250 ℃;分流比1∶40;進(jìn)樣量1 μL。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)處理使用Excel軟件,圖表繪制采用Origin Pro 8.5軟件,所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)。差異顯著性分析采用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)軟件,P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽類對(duì)聯(lián)產(chǎn)提取未破壁螺旋藻藻藍(lán)蛋白和油脂提取性能的影響

在室溫條件下,以未破壁鈍頂螺旋藻為原料,選擇食品級(jí)正己烷為有機(jī)溶劑,研究不同鹽類對(duì)聯(lián)產(chǎn)提取螺旋藻藻藍(lán)蛋白和油脂性能的影響,結(jié)果如表1所示。在所選擇的鹽類中,由正己烷和CaCl2介導(dǎo)的提取法表現(xiàn)出最高的螺旋藻藻藍(lán)蛋白和油脂的提取率,即62.47%和12.59%。LAUCERI等[15]也發(fā)現(xiàn)CaCl2可顯著提高藻藍(lán)蛋白的提取率。CaCl2具有較高的滲透活性,可以破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu),提高細(xì)胞膜的通透性[16-17],有利于胞內(nèi)藻藍(lán)蛋白油脂的釋放。因此,根據(jù)表1的結(jié)果,選擇正己烷-CaCl2介導(dǎo)的提取體系,進(jìn)一步優(yōu)化其聯(lián)產(chǎn)提取未破壁螺旋藻藻藍(lán)蛋白和油脂的工藝參數(shù)。

表1 不同鹽類聯(lián)產(chǎn)提取未破壁螺旋藻藻藍(lán)蛋白和油脂提取性能的影響Table 1 Effect of different salts on the extraction performance of phycocyanin and lipids from S. platensis using salt/n-hexane co-extraction

2.2 不同CaCl2質(zhì)量濃度對(duì)螺旋藻活性物質(zhì)聯(lián)產(chǎn)提取性能的影響

從圖1可知,當(dāng)提取體系的CaCl2質(zhì)量濃度從0提高到30 g/L,螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取率從32.23%提高到62.48%。但是,當(dāng)繼續(xù)提高提取體系的CaCl2濃度時(shí),藻藍(lán)蛋白提取率明顯呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是因?yàn)檫^(guò)高的CaCl2濃度可能使藻藍(lán)蛋白發(fā)生鹽析沉淀[18],導(dǎo)致其提取率下降。此外,圖1還表明,鈍頂螺旋藻油脂的提取率隨著CaCl2濃度的增加呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。在CaCl2質(zhì)量濃度為30～70 g/L時(shí),正己烷-CaCl2介導(dǎo)法提取螺旋藻油脂的提取率則無(wú)顯著差異。因此,最佳提取螺旋藻油脂的CaCl2濃度為30～70 g/L?；趫D1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇30 g/L CaCl2質(zhì)量濃度作為正己烷-CaCl2介導(dǎo)法聯(lián)產(chǎn)提取藻藍(lán)蛋白和油脂。

圖1 CaCl2濃度對(duì)提取性能的影響Fig.1 Influence of CaCl2 content on the extraction performance

2.3 正己烷與懸浮液的體積比對(duì)提取性能的影響

由圖2可知,隨著正己烷用量的增加,正己烷-CaCl2介導(dǎo)法提取螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取率無(wú)明顯變化(66.26%～68.77%)。這可能是因?yàn)?正己烷作為非極性有機(jī)溶劑,主要用于溶解中性油脂[19],不會(huì)對(duì)水相中的藻藍(lán)蛋白產(chǎn)生影響。當(dāng)正己烷與懸浮液體積比從0.5∶1提高到2∶1時(shí),正己烷-CaCl2介導(dǎo)法提取螺旋藻油脂的提取率從8.35%提高到24.73%(圖2);而繼續(xù)提高提取體系中正己烷的用量(2.5∶1),螺旋藻油脂的提取率無(wú)顯著變化。因此,選擇2∶1作為正己烷與懸浮液的最佳體積比。

圖2 正己烷與懸浮液的體積比對(duì)提取性能的影響Fig.2 Influence of ratio of n-hexane to suspension on the extraction performance

2.4 料液比對(duì)提取性能的影響

由圖3可知,當(dāng)料液比從1∶10降低到1∶60時(shí),正己烷-CaCl2介導(dǎo)法提取未破壁螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取率從52.19%提高到68.97%,這是因?yàn)殡S著液料比的增加,生物質(zhì)分子與溶質(zhì)分子的接觸得到了更充分的保證。同時(shí),增加提取液用量還可以提高溶劑分子在細(xì)胞中的擴(kuò)散速率,進(jìn)一步促進(jìn)了藻藍(lán)蛋白的有效提取[17]。繼續(xù)增加提取液用量(1∶80),藻藍(lán)蛋白的提取率呈下降趨勢(shì),這可能是在本研究中,固定提取體系的藻粉量后,隨著提取溶液量的增加,提取體系中的CaCl2濃度也隨之增加,引起提取的藻藍(lán)蛋白產(chǎn)生部分鹽析[18],降低了藻藍(lán)蛋白提取率。這些結(jié)果與余佳等[20]從葛仙米中提取藻膽蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相吻合。另外,鈍頂螺旋藻油脂的提取率隨著提取液用量的增加而持續(xù)增加,當(dāng)料液比從1∶10降低到1∶60時(shí),油脂提取率從13.82%提高到22.83%;繼續(xù)增加提取液用量(1∶80),油脂的提取率無(wú)顯著變化?；趫D3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇1∶60作為正己烷-CaCl2介導(dǎo)法聯(lián)產(chǎn)提取螺旋藻藻藍(lán)蛋白和油脂的最佳料液比。

圖3 料液比對(duì)提取性能的影響Fig.3 Influence of material-to-liquid ratios on the extraction performance

2.5 提取時(shí)間對(duì)提取性能的影響

提取時(shí)間的長(zhǎng)短是評(píng)判提取方法是否可進(jìn)行規(guī)?；瘧?yīng)用的重要參數(shù)。由圖4可知,當(dāng)提取時(shí)間從1 h增加到3 h時(shí),正己烷-CaCl2介導(dǎo)法提取未破壁螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取率顯著增加,從61.73%提高71.03%;隨后,提取時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)導(dǎo)致藻藍(lán)蛋白的提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)?加入30 g/L CaCl2時(shí),隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),CaCl2鹽類與提取的藻藍(lán)蛋白會(huì)持續(xù)相互作用,導(dǎo)致水相中的藻藍(lán)蛋白發(fā)生鹽析沉淀,降低水相的藻藍(lán)蛋白的濃度。此外,當(dāng)提取時(shí)間從1 h提高到3 h時(shí),正己烷-CaCl2介導(dǎo)法提取螺旋藻油脂的提取率從15.49%提高到26.19%(圖4),繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間,螺旋藻油脂的提取率無(wú)顯著變化。

關(guān)于油脂的提取率不同于藻藍(lán)蛋白提取率的變化情況,主要是因?yàn)?(1)藻藍(lán)蛋白和油脂是2種結(jié)構(gòu)不同的生物活性物質(zhì);(2)在所研發(fā)的正己烷-CaCl2提取體系中,提取所得的藻藍(lán)蛋白和油脂分別分布在提取體系的水相和有機(jī)相中;(3)CaCl2鹽類不會(huì)溶解于正己烷,因此不會(huì)干擾有機(jī)相中油脂的沉淀或分布。綜上,正己烷-CaCl2介導(dǎo)法最佳聯(lián)產(chǎn)提取螺旋藻藻藍(lán)蛋白和油脂的提取時(shí)間為3 h。

目前,科技工作者已研發(fā)了多種用于提取螺旋藻藻藍(lán)蛋白或油脂的提取方法,如反復(fù)凍融法、高速勻漿法、高壓乙醇提取法、超臨界CO2提取法等(表2)。

表2 不同提取方法提取螺旋藻生物活性物質(zhì)的比較Table 2 Comparison of extraction methods for bioactive substances from Spirulina biomass

與傳統(tǒng)反復(fù)凍融法相比,本研究的正己烷和CaCl2介導(dǎo)提取法可更有效地提取螺旋藻藻藍(lán)蛋白,但油脂提取率僅為26.19%,低于PINTO等[21]和YANG等[22]的結(jié)果。這可能是因?yàn)楸狙芯克x擇的有機(jī)溶劑為正己烷。今后將進(jìn)一步研發(fā)更有效的提取方法,實(shí)現(xiàn)高效地聯(lián)產(chǎn)提取螺旋藻藻藍(lán)蛋白和油脂。值得注意的是,本研究所研發(fā)的正己烷和CaCl2介導(dǎo)提取法,不僅可聯(lián)產(chǎn)提取螺旋藻藻藍(lán)蛋白和油脂,而且經(jīng)提取后還可以實(shí)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白和油脂的分離,對(duì)規(guī)?；瘧?yīng)用具有重要的意義。

2.6 正己烷與CaCl2介導(dǎo)法提取前后細(xì)胞破碎對(duì)比

提取前的螺旋藻呈現(xiàn)彎月的形狀(圖5-a),大小約為40 μm。在最優(yōu)的提取條件下,采用正己烷-CaCl2介導(dǎo)的一步法聯(lián)產(chǎn)提取螺旋藻藻藍(lán)蛋白和油脂,并對(duì)藻細(xì)胞進(jìn)行顯微觀察,發(fā)現(xiàn)提取后的藻細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則的細(xì)胞碎片(圖5-b),大小約為6 μm。由此可見(jiàn),正己烷CaCl2介導(dǎo)法所使用的CaCl2和正己烷作為提取介質(zhì)可有效地使螺旋藻細(xì)胞發(fā)生破壁作用,進(jìn)而使胞內(nèi)的藻藍(lán)蛋白和油脂分別溶解在水溶液和正己烷中,達(dá)到提取和分離的效果。

2.7 提取所得螺旋藻油脂的脂肪酸組成

如表3所示,鈍頂螺旋藻藻粉原料的主要脂肪酸是棕櫚酸(40.34%)、亞油酸(16.10%)和γ-亞麻酸(21.72%)。YANG等[22]發(fā)現(xiàn),螺旋藻主要脂肪酸含有45.82%的棕櫚酸、21.99%的亞油酸和23.99%的γ-亞麻酸略高于本研究結(jié)果;而OLIVEIRA等[27]研究表明,螺旋藻干粉中含有32.53%的棕櫚酸、13.86%的亞油酸和20.56%的γ-亞麻酸略低于本研究結(jié)果。值得注意的是,正己烷CaCl2介導(dǎo)法提取所得的螺旋藻油脂的棕櫚酸含量低于原料的值;但是,亞油酸和γ-亞麻酸含量確高于原料的值(表3)。這有可能是,鈍頂螺旋藻所合成的亞油酸和γ-亞麻酸主要分布在中性脂中[28]。本研究中,使用的正己烷屬于食品級(jí),經(jīng)蒸餾后收集的正己烷可進(jìn)行回收,去除正己烷所得的螺旋藻油脂可開(kāi)發(fā)成高附加值的藻油制品,應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。

3 結(jié)論

本文率先研發(fā)了一種正己烷和CaCl2介導(dǎo)的一步提取法,在室溫條件下,可聯(lián)產(chǎn)提取未破壁螺旋藻中的藻藍(lán)蛋白和富含多不飽和脂肪酸的油脂,并優(yōu)化其提取工藝。最佳聯(lián)產(chǎn)提取未破壁螺旋藻藻藍(lán)蛋白和油脂的工藝條件為CaCl2濃度為3%,正己烷和懸浮液的體積比為2∶1,料液比為1∶60,提取時(shí)間3 h。在最優(yōu)的提取工藝條件下,藻藍(lán)蛋白和油脂的最高提取率分別為71.06%和26.19%。正己烷-CaCl2介導(dǎo)的一步提取法可最大程度上聯(lián)產(chǎn)提取未破壁螺旋藻的藻藍(lán)蛋白和油脂,并達(dá)到藻藍(lán)蛋白和油脂的分離,實(shí)現(xiàn)螺旋藻生物質(zhì)的綜合利用。研究結(jié)果可推動(dòng)螺旋藻提取藻藍(lán)蛋白和/或油脂的發(fā)展,為我國(guó)螺旋藻深加工技術(shù)提供理論依據(jù)。雖然本研究所得的油脂提取率較低,今后將研發(fā)更高效的提取螺旋藻油脂的方法,最終達(dá)到一步聯(lián)產(chǎn)低碳高效提取螺旋藻藻藍(lán)蛋白和油脂的目的,突破現(xiàn)有螺旋藻深加工技術(shù)的技術(shù)瓶頸。