乳酸菌混合發(fā)酵在紅棗漿中的發(fā)酵特性研究

陳曉維,溫靖,肖更生,徐玉娟,吳繼軍,余元善,鄒波,李璐,卜智斌

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州,510610)

紅棗(ZiziphusjujubaMill.)為鼠李科棗屬植物果實(shí),原產(chǎn)于亞洲和南歐[1]。紅棗果實(shí)成熟后變?yōu)榧t色,呈橢圓形,略有光澤,有不規(guī)則褶皺,果質(zhì)松軟,果味甘甜,被列為“五果”(桃、梅、李、棗、杏)之一,素有“木本糧食”之稱[2]。紅棗富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素以及礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分。此外,紅棗中還存在許多化學(xué)成分,包括多糖、類黃酮、皂苷和環(huán)狀核苷酸等,這些化學(xué)成分已被證明具有多種生物活性,如抗炎、抗癌、抗氧化、對(duì)造血功能和大腦神經(jīng)有益并且具有調(diào)節(jié)腸道菌群作用等[3-4]。我國(guó)是全球主要的紅棗生產(chǎn)國(guó),產(chǎn)量占全球90%以上[5]。

乳酸菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群、增強(qiáng)人體免疫力、降低血清膽固醇等多種功能[6]。國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者利用干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等常見(jiàn)的乳酸菌對(duì)單一或復(fù)合果蔬汁進(jìn)行發(fā)酵,均取得了較好的效果[7-10]。發(fā)酵紅棗漿作為紅棗的一種加工產(chǎn)品,風(fēng)味獨(dú)特,棗香濃郁,保留了紅棗中的多酚、有機(jī)酸、多糖等功能成分,符合消費(fèi)者追求天然、健康的食品趨勢(shì),具有一定的市場(chǎng)效益與發(fā)展?jié)摿?。目?發(fā)酵紅棗漿的報(bào)道主要集中在不同乳酸菌的單株發(fā)酵特性、乳酸菌發(fā)酵工藝優(yōu)化、乳酸菌復(fù)合酵母菌發(fā)酵酒醋工藝等方面[10-12]。關(guān)于乳酸菌混合發(fā)酵紅棗漿的報(bào)道還比較少[13],且尚未見(jiàn)關(guān)于對(duì)不同乳酸菌混合發(fā)酵后紅棗漿的營(yíng)養(yǎng)功能成分(多酚、黃酮、多糖、抗壞血酸和有機(jī)酸等)和抗氧化活性變化的相關(guān)報(bào)道。

本文以紅棗漿為原料,通過(guò)添加3種不同益生菌(干酪乳桿菌和植物乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌)的復(fù)合菌進(jìn)行混合發(fā)酵,旨在為開(kāi)發(fā)新型功能性乳酸菌發(fā)酵紅棗漿提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駿棗(去核),新疆西圣果業(yè)有限公司;干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌,本實(shí)驗(yàn)室保藏;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2, 2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]、抗壞血酸、沒(méi)食子酸、蘆丁,上海源葉生物有限公司;MRS(de Man,Rogosa and Sharpe)肉湯、MRS瓊脂培養(yǎng)基,廣東環(huán)凱有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WF-A2000型榨汁機(jī),美的集團(tuán)公司;RP-101折光儀,日本愛(ài)宕有限公司;PB-10型pH計(jì),德國(guó)Sartorius公司;SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;SW-CJ-2FD無(wú)菌操作臺(tái),蘇州安康空氣技術(shù)有限公司;Biofuge Stratos Sorvall高速冷凍離心機(jī),美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;UV1800紫外分光光度計(jì),日本島津公司;UltraScan VIS 全自動(dòng)色差儀,美國(guó)HunterLab公司;HWS電熱恒溫水浴鍋,上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅棗漿的制備

挑選無(wú)霉變的去核紅棗,料水比1∶3(g∶mL)加入純凈水,在蒸籠中蒸煮20 min后用打漿機(jī)打漿,獲得的紅棗漿分裝到玻璃瓶中,將分裝好的紅棗漿放入水浴鍋中進(jìn)行滅菌處理(90 ℃,5 min)。殺菌后貯藏于-20 ℃冷庫(kù)中備用。

1.3.2 乳酸菌培養(yǎng)物制備

從-80 ℃冰箱中取出保藏的3種乳酸菌(干酪乳桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌)的甘油管,在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行MRS固體培養(yǎng)基中劃線,將劃線的MRS固體培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中,37 ℃培養(yǎng)48 h,挑取各乳酸菌的菌落分別接種于MRS液體培養(yǎng)基,置于振蕩培養(yǎng)箱于37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h至菌液吸光度(OD)為4。

1.3.3 紅棗漿的乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)

紅棗漿解凍后,置于超凈工作臺(tái)上,分別在已滅菌的250 mL三角瓶中加入100 g紅棗漿,每瓶分別接入干酪乳桿菌+植物乳桿菌、植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌+植物乳桿菌的乳酸菌培養(yǎng)物(接種量為紅棗漿質(zhì)量的1%),置于37 ℃的振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng),每8 h取樣1次,測(cè)定其菌落總數(shù);并根據(jù)繪制的微生物生長(zhǎng)曲線確定發(fā)酵終點(diǎn),測(cè)定發(fā)酵前后的理化指標(biāo)。

1.3.4 乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定

參考GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》采用稀釋倒平板法測(cè)定乳酸菌菌落總數(shù)。

1.3.5 pH和可滴定酸的測(cè)定

pH值使用pH計(jì)直接測(cè)定?？傻味ㄋ岬臏y(cè)定按照GB 12456—2021《食品中總酸的測(cè)定》,采用pH計(jì)電位滴定法進(jìn)行測(cè)定,總酸度以乳酸計(jì)。

1.3.6 紅棗漿色差的測(cè)定

采用色差儀測(cè)定紅棗漿樣品發(fā)酵前后的色澤(L、a和b值表示),結(jié)果用總色差ΔE表示,按公式(1)計(jì)算:

(1)

式中:L0、a0、b0表示未發(fā)酵紅棗漿的色澤參數(shù);L、a、b表示發(fā)酵紅棗漿的色澤參數(shù)。

1.3.7 總酚含量的測(cè)定

采用福林酚法測(cè)定[14],結(jié)果以沒(méi)食子酸當(dāng)量表示。

1.3.8 總黃酮的測(cè)定

參照WU等[15]的方法,稍作修改?？傸S酮含量用蘆丁表示。

1.3.9 多糖含量的測(cè)定

采用苯酚硫酸法測(cè)定[16],結(jié)果以葡萄糖表示。

1.3.10 有機(jī)酸和抗壞血酸的測(cè)定

參考WU等[15]的方法,采用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定?？箟难釞z測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,有機(jī)酸檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm,并采用外標(biāo)法定量。

1.3.11 DPPH自由基清除力的測(cè)定

參照Z(yǔ)OU等[17]的方法并略作修改,樣品清除DPPH自由基的能力以1 g樣品清除Trolox的質(zhì)量相當(dāng),以mg/g表示。

1.3.12 ABTS陽(yáng)離子自由基清除力的測(cè)定

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有的不同處理均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 23.0進(jìn)行方差分析,數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并用Origin 8.5.1軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌混合發(fā)酵期間紅棗漿中乳酸菌數(shù)量的變化

從圖1可知,在發(fā)酵0～24 h,乳酸菌活菌數(shù)呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng),發(fā)酵24 h后進(jìn)入穩(wěn)定的生長(zhǎng)期,3種復(fù)合乳酸菌的活菌數(shù)均可達(dá)到9.4 lg CFU/mL以上。其中,植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌復(fù)合發(fā)酵的紅棗漿中活菌數(shù)高于其余2組,這可能是由于不同乳酸菌種的差異所致。在發(fā)酵24 h后,3種復(fù)合乳酸菌在紅棗漿中的活菌數(shù)均呈下降趨勢(shì),這是由于紅棗漿中的碳源隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)被消耗以及乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸引起的環(huán)境變化,抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)[19]。綜上,紅棗漿營(yíng)養(yǎng)豐富,3種復(fù)合乳酸菌均能在紅棗漿中較好的生長(zhǎng)繁殖。為了使發(fā)酵紅棗漿中含有較高的益生菌活菌數(shù),選擇發(fā)酵24 h為發(fā)酵終點(diǎn),分析比較了不同乳酸菌混合發(fā)酵前后(發(fā)酵0 h和發(fā)酵24 h)對(duì)紅棗漿的理化指標(biāo)、營(yíng)養(yǎng)功能成分和抗氧化活性的影響。

2.2 不同乳酸菌混合發(fā)酵前后紅棗漿pH和可滴定酸的變化

由圖2可知,紅棗漿的最初pH值約為4.79。在發(fā)酵24 h后,3種混合乳酸菌發(fā)酵的紅棗漿中的 pH 值均呈下降趨勢(shì),這主要是由于在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了醋酸和乳酸等代謝物。其中,干酪乳桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵的紅棗漿的pH最大,而植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌發(fā)酵的紅棗漿的 pH 值最小。經(jīng)發(fā)酵24 h,紅棗漿pH值顯著降低,從而抑制乳酸菌菌株的生長(zhǎng)和繁殖,導(dǎo)致乳酸菌的生長(zhǎng)能力下降,與上述2.1節(jié)乳酸菌生長(zhǎng)曲線中發(fā)酵24 h后活菌數(shù)下降的趨勢(shì)一致。這些結(jié)果與之前對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵的紅棗汁的研究結(jié)果一致[19]。

a-pH;b-可滴定酸圖2 不同乳酸菌混合發(fā)酵后紅棗漿pH和可滴定酸的變化Fig.2 Changes in pH and titratable acids of jujube pulp after mixed fermentation with different strains

從圖2可知,紅棗漿的初始可滴定酸含量為4.29 mg/g。發(fā)酵24 h后,3種混合乳酸菌發(fā)酵紅棗漿所產(chǎn)生的可滴定酸均呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。3種乳酸菌混合發(fā)酵的紅棗漿在發(fā)酵后可滴定酸含量均達(dá)到6.7 mg/g(以乳酸計(jì))左右,產(chǎn)酸能力較為明顯,其中植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌混合發(fā)酵的紅棗漿總可滴定酸含量最高,但3組無(wú)顯著性差異。

2.3 不同乳酸菌混合發(fā)酵前后紅棗漿色差的變化

由圖3可知,發(fā)酵24 h后,不同乳酸菌混合發(fā)酵的紅棗漿的色差值大體上均呈增大的趨勢(shì)。其中,干酪乳桿菌+植物乳桿菌混合發(fā)酵的紅棗漿的色差值最大,為1.22;植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌混合發(fā)酵的紅棗漿的色差值最小,為0.21。環(huán)境(發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度)的影響、乳酸菌對(duì)紅棗漿的發(fā)酵利用以及相關(guān)物質(zhì)的產(chǎn)生,使得發(fā)酵后紅棗漿的色澤發(fā)生了一定的改變,但具體的變化原因與方式尚未明確,還需進(jìn)一步的探究[20]。研究顯示,經(jīng)植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌混合發(fā)酵對(duì)紅棗漿的色澤影響較小,發(fā)酵后紅棗漿的色澤與未發(fā)酵的紅棗漿顏色更接近。

圖3 不同乳酸菌混合發(fā)酵后紅棗漿色差的變化Fig.3 Changes of jujube pulp color difference after mixed fermentation with different strains

2.4 不同乳酸菌混合發(fā)酵前后紅棗漿總酚的變化

由圖4可知,在發(fā)酵24 h后,3種紅棗漿的總酚含量均呈上升趨勢(shì)。其中,植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌混合發(fā)酵的紅棗漿的總酚含量最高,為0.62 mg/g,而干酪乳桿菌+植物乳桿菌混合發(fā)酵的紅棗漿的總酚含量最低,為0.57 mg/g。王琪[21]報(bào)道了經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的紅棗汁的總酚濃度高于未發(fā)酵紅棗汁。RICCI等[22]對(duì)無(wú)花果汁進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵無(wú)花果汁的總酚含量高于未發(fā)酵組。發(fā)酵后紅棗漿中總酚含量的顯著增加可能是因?yàn)榘l(fā)酵使植物細(xì)胞釋放出一些可溶性或不可溶性的酚類化合物。

圖4 不同乳酸菌混合發(fā)酵后紅棗漿總酚的變化Fig.4 Changes in total phenolics of jujube pulp after mixed fermentation with different strains

2.5 不同乳酸菌混合發(fā)酵前后紅棗漿總黃酮的變化

如圖5所示,在發(fā)酵24 h后,3種紅棗漿的總黃酮含量均有所增加。其中,植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌混合發(fā)酵的紅棗漿的總黃酮含量最高,相比未發(fā)酵組增加了16.28%;而干酪乳桿菌+植物乳桿菌混合發(fā)酵的紅棗漿的總黃酮含量最低,增加了6.52%。-DOR-DEVIE等[23]也報(bào)道了乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生葡萄糖苷酶,有可能促進(jìn)了小麥和玉米秸稈提取物總黃酮含量的增加,與本研究結(jié)果一致。

圖5 不同乳酸菌混合發(fā)酵后紅棗漿總黃酮的變化Fig.5 Changes in total flavonoids of jujube pulp after mixed fermentation with different strains

2.6 不同乳酸菌混合發(fā)酵前后紅棗漿多糖的變化

紅棗多糖是紅棗中最重要的營(yíng)養(yǎng)功能成分之一,具有抗癌、抗炎、增強(qiáng)免疫力和保護(hù)肝臟等多種藥理活性[4]。如圖6所示,發(fā)酵24 h后,3種紅棗漿中多糖含量均明顯高于未發(fā)酵組。其中,植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌復(fù)合發(fā)酵的紅棗漿中多糖含量最高,與其余2組比較差異不顯著。發(fā)酵后紅棗漿多糖含量的增加可能是由于乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生胞外多糖。WANG等[24]研究報(bào)道了植物乳桿菌HW47和YW11能夠產(chǎn)生胞外多糖,與本研究結(jié)果一致。

圖6 不同乳酸菌混合發(fā)酵后紅棗漿多糖的變化Fig.6 Changes in polysaccharides of jujube pulp after mixed fermentation with different strains

2.7 不同乳酸菌混合發(fā)酵前后紅棗漿抗壞血酸和有機(jī)酸的變化

從表1可知,紅棗漿中的抗壞血酸含量經(jīng)發(fā)酵后略微下降但無(wú)顯著差異,說(shuō)明乳酸菌發(fā)酵對(duì)紅棗漿中的抗壞血酸影響較小。

表1 紅棗漿經(jīng)不同乳酸菌混合發(fā)酵后抗壞血酸和有機(jī)酸的變化 單位:mg/gTable 1 Changes in ascorbic and organic acids of jujube pulp after mixed fermentation with different strains

在發(fā)酵果蔬汁中,益生菌能分解糖生成有機(jī)酸,同時(shí)有機(jī)酸也是微生物的重要次生代謝產(chǎn)物[22]。紅棗漿中主要的有機(jī)酸分別是檸檬酸、草酸、酒石酸、蘋果酸、乙酸和乳酸,這與GUO等[25]的研究結(jié)果一致。發(fā)酵 24 h 后, 干酪乳桿菌+植物乳桿菌、植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌+鼠李糖乳桿菌這3組混合發(fā)酵組分別產(chǎn)生了3.69、3.40、3.30 mg/g的乳酸,此外還分別產(chǎn)生了1.26、1.06、1.08 mg/g的乙酸。XU等[8]也報(bào)道了隨著乳酸菌的生長(zhǎng),乳酸菌發(fā)酵的胡蘿卜、蘋果、橙子和紅棗的復(fù)合果蔬汁中乳酸含量增加,這主要與乳酸菌發(fā)酵分解糖或轉(zhuǎn)化檸檬酸和蘋果酸有關(guān)。3種不同乳酸菌混合發(fā)酵均表現(xiàn)出對(duì)檸檬酸有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化能力,但發(fā)酵后不同乳酸菌混合發(fā)酵結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異,紅棗漿的檸檬酸含量降低了84.15%左右。檸檬酸含量的降低可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵早期,乳酸菌將檸檬酸作為碳源被消耗的結(jié)果[19]。與檸檬酸的趨勢(shì)相似,經(jīng)乳酸菌混合發(fā)酵后,不同發(fā)酵組的紅棗漿中蘋果酸含量均呈下降趨勢(shì),其中干酪乳桿菌+植物乳桿菌轉(zhuǎn)化蘋果酸的能力比其余2組強(qiáng),但3組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。發(fā)酵后,紅棗漿蘋果酸含量降低可能與自身的蘋果酸經(jīng)過(guò)蘋果酸-乳酸發(fā)酵途徑被代謝轉(zhuǎn)化有關(guān)[19],經(jīng)發(fā)酵24 h后,紅棗漿中酒石酸含量有所增加,但與發(fā)酵前對(duì)比,差異不顯著。草酸經(jīng)發(fā)酵后含量也稍有下降,其中植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌發(fā)酵組的紅棗漿草酸含量最低,減少了20%。

2.8 不同乳酸菌混合發(fā)酵前后紅棗漿抗氧化活性的變化

由圖7可知,經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后,紅棗漿的DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基抗氧化能力均有所增強(qiáng)。其中,植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌混合發(fā)酵組的DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基抗氧化活性值顯著高于其余2組。發(fā)酵24 h后,紅棗漿的DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基抗氧化活性增強(qiáng)可能與發(fā)酵后多酚、黃酮等生物活性成分的增加有關(guān),與余偲等[26]的研究結(jié)果一致。以上結(jié)果表明,利用乳酸菌混合發(fā)酵可以提高紅棗漿中的抗氧化能力。

a-DPPH自由基清除活性;b-ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性圖7 不同乳酸菌混合發(fā)酵后紅棗漿抗氧化活性的變化Fig.7 Changes in antioxidant activity of jujube pulp after mixed fermentation with different strains

3 結(jié)論與討論

紅棗漿營(yíng)養(yǎng)豐富,3種不同乳酸菌兩兩混合均能在紅棗漿中較好的生長(zhǎng),在發(fā)酵24 h后,3個(gè)發(fā)酵組均進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期,活菌數(shù)均可達(dá)到9.4 lg CFU/mL。在紅棗漿發(fā)酵過(guò)程中,3種不同乳酸菌混合發(fā)酵組均能產(chǎn)酸,其中植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌的產(chǎn)酸能力較強(qiáng),但與其他2組無(wú)顯著差異。不同乳酸菌混合發(fā)酵后紅棗漿色澤存在差異,植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌混合發(fā)酵的紅棗漿色澤與未發(fā)酵的紅棗漿顏色更接近。而在不同乳酸菌混合發(fā)酵24 h后,紅棗漿中的總酚、總黃酮、多糖含量和抗氧化活性均呈上升趨勢(shì),并且不同乳酸菌混合發(fā)酵表現(xiàn)的能力差異很大,其中植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌在紅棗漿發(fā)酵24 h后對(duì)總酚、總黃酮、多糖含量和抗氧化活性優(yōu)于其余2個(gè)發(fā)酵組。此外,還對(duì)不同乳酸菌混合發(fā)酵后紅棗漿抗壞血酸和有機(jī)酸的差異進(jìn)行分析,發(fā)酵后紅棗漿中的檸檬酸、蘋果酸和草酸含量降低,乳酸和乙酸含量增加,抗壞血酸和酒石酸含量無(wú)明顯變化。綜上,紅棗漿應(yīng)以植物乳桿菌+鼠李糖乳桿菌混合發(fā)酵為宜。