植物乳桿菌LAB2對(duì)辣椒軟腐病的控制作用及辣椒貯藏品質(zhì)的影響

李曉芬,李廣,曾凱芳,2,易蘭花,2*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715)2(西南大學(xué) 食品貯藏與物流研究中心,重慶,400715)

辣椒(Capsicumspp.)是一種蔬菜,也是一種調(diào)味品,因營養(yǎng)價(jià)值豐富、口感獨(dú)特受到消費(fèi)者的喜愛和歡迎。我國是世界上辣椒栽培面積最大的國家,“十三五”以來,我國辣椒年播種面積占全國蔬菜總播種面積的8%～10%,產(chǎn)值約2 500億元,播種面積和產(chǎn)值均居蔬菜首位[1]。但辣椒采后損失巨大,常見的病害有果腐病(Fusariumsp.引起)、軟腐病(Erwinia引起)、炭疽病(Colletotrichumgloeosporioides引起)、黑斑病(Alternariaalternata引起)、疫病(Phytophthoracapsici引起)和灰霉病(Botrytiscinerea引起)。其中,軟腐病是辣椒采后最具毀滅性的細(xì)菌性病害[2]。果膠桿菌(Pectobacterium)是引發(fā)辣椒軟腐病的主要病原菌,它通過產(chǎn)生多種細(xì)胞壁降解酶導(dǎo)致蔬菜腐爛[3]。病原菌通過傷口或自然孔道侵染植物組織,采收和物流運(yùn)輸中產(chǎn)生的機(jī)械損傷能夠促進(jìn)病原菌的侵染,從而加重軟腐病造成的經(jīng)濟(jì)損失?？刂评苯凡珊筌浉〉陌l(fā)生是辣椒產(chǎn)業(yè)急需解決的問題。

目前,由微生物侵染引起的辣椒病害主要通過化學(xué)殺菌劑進(jìn)行防治。然而,化學(xué)殺菌劑控制軟腐病具有持久性差、環(huán)境污染、細(xì)菌菌群可產(chǎn)生耐藥性等問題[4],使得人們不斷地探索新型殺菌劑。拮抗微生物及其代謝產(chǎn)物被認(rèn)為有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)化學(xué)殺菌劑[5]。乳酸菌可以通過產(chǎn)生大量的有機(jī)酸、細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)來抑制食物腐敗微生物和致病微生物[6-7],且具有“一般被認(rèn)為是安全的(generally recognized as safe,GRAS)”安全等級(jí)[8]。此外,它們具有“合格的安全推定(qualified presumption of safety,QPS)”,能夠有選擇地對(duì)食品細(xì)菌性病原菌進(jìn)行納米級(jí)的抗菌防御,從而保障消費(fèi)者的安全[9]。因此,乳酸菌在食品貯藏保鮮中具有巨大的應(yīng)用潛力。乳酸菌及其代謝產(chǎn)物在果蔬貯藏領(lǐng)域已經(jīng)有了初步的應(yīng)用研究。VOIDAROU等[10]利用乳酸菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)梨、蘋果、桃、西紅柿、黃瓜、紅辣椒、白菜和胡蘿卜的致病微生物進(jìn)行了有效的控制。YI等[11]利用戊糖乳桿菌MS031對(duì)鮮切果蔬中食源性致病菌進(jìn)行了控制,對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和單核增生李斯特菌顯示出較好的抑菌活性。蔡文韜等[12]利用解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)辣椒進(jìn)行保鮮,可以延緩果實(shí)內(nèi)還原糖、可溶性固形物、蛋白和維生素C含量的降低,保持了辣椒較穩(wěn)定的色澤和質(zhì)地。目前,乳酸菌對(duì)辣椒軟腐病控制還鮮有報(bào)道。實(shí)驗(yàn)室前期從辣椒果實(shí)上分離得到了一株胡蘿卜軟腐病果膠桿菌胡蘿卜亞種(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum,Pcc)CBJ3菌株,本文旨在探究該軟腐病病原菌在不同貯藏溫度下對(duì)辣椒的致病性,進(jìn)一步利用拮抗菌L.plantarumLAB2控制辣椒軟腐病,并探究其對(duì)辣椒貯藏品質(zhì)的影響,本研究可為減少辣椒軟腐病害以延長貯藏期提供新的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

辣椒采自重慶市北碚區(qū)(本文辣椒均指辣椒果實(shí));果膠桿菌PccCBJ3、L.plantarumLAB2保藏于西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院食品貯藏與物流實(shí)驗(yàn)室。

胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉,北京奧博星生物技術(shù)有限公司;(NH4)2SO4、NaClO,成都科隆化學(xué)品有限公司;丙酮、三氯乙酸、甲醇、NaCl,重慶躍翔化工有限公司;MRS培養(yǎng)基,金克隆生物試劑有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒,上海生工生物工程有限公司。

1.2 主要儀器

滅菌鍋,廈門致微儀器有限公司;生化培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;搖床,上海旻泉儀器有限公司;Avanti J-30I高速冷凍離心機(jī),美國Beckman公司;SIGMA 1-15PK小型臺(tái)式離心機(jī),德國SIGMA公司;超凈臺(tái),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;PCR儀、電轉(zhuǎn)儀,上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司;掃描電鏡,上海復(fù)納科學(xué)儀器有限公司;硬度計(jì)GS-15,北京陽光億事達(dá)科技有限公司;UV 1000紫外可見分光光度計(jì),上海天美公司;WYT0-80%數(shù)顯手持式折光儀,成都興晨光光學(xué)儀器有限公司。

1.3 不同貯藏溫度下果膠桿菌對(duì)辣椒的致病性

1.3.1 25 ℃貯藏下的致病性

用2%(體積分?jǐn)?shù))NaClO對(duì)新鮮完好的辣椒進(jìn)行浸泡2 min消毒,清水洗凈,自然晾干,無菌打孔器打2個(gè)孔,待用。果膠桿菌PccCBJ3在LB肉湯中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,離心收集菌體,并重新懸浮于無菌生理鹽水至OD600nm=0.5(1×108CFU/mL),隨后將其10倍逐級(jí)稀釋至濃度為10 CFU/mL。取30 μL各稀釋度菌懸液分別接種于辣椒孔中,晾干后放置于25 ℃貯藏,每天記錄發(fā)病率和病斑直徑[13]。以無菌水代替菌懸液作為對(duì)照。每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10個(gè)辣椒。

1.3.2 4 ℃貯藏下的致病性

消費(fèi)者在購買辣椒后,通常貯存在常溫或家用冷藏冰箱中,因此本文還探究了在4 ℃下貯藏時(shí),不同濃度果膠桿菌PccCBJ3對(duì)辣椒的致病力。處理過程同1.3.1節(jié),除了辣椒貯藏在4 ℃冷庫中。每天記錄發(fā)病率和病斑直徑。

1.4 拮抗菌對(duì)軟腐病菌的體外控病活性

1.4.1 拮抗菌的篩選

將實(shí)驗(yàn)室從辣椒上分離得到的108株細(xì)菌作為篩選對(duì)象,以果膠桿菌PccCBJ3為指示菌,采用雙層劃線法[14]篩選具有抑菌活性的拮抗菌。

1.4.2 拮抗菌不同組分的控病活性

將篩選得到的拮抗菌在MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃搖瓶培養(yǎng)24 h,離心獲得的菌體沉淀用無菌生理鹽水重懸至OD600nm=0.1。拮抗菌搖瓶培養(yǎng)48 h,離心,上清液用0.22 μm濾膜過濾,得到無細(xì)胞發(fā)酵液(cell-free supernatant,CFS)。采用(NH4)2SO4沉淀法[15],在100 mL CFS中加入80%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))飽和(NH4)2SO4溶液,4 ℃放置24 h,離心,沉淀溶解于1 mL磷酸緩沖液(pH 6.0)即得細(xì)菌素粗樣。參考XU等[16]的方法,以果膠桿菌PccCBJ3為指示菌,利用瓊脂孔擴(kuò)散法進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn),并記錄抑菌圈直徑。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.5 拮抗菌基因組草圖測序

將拮抗菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,基因組DNA提取、DNA文庫構(gòu)建及Illumina HiSeq 4000平臺(tái)測序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。將拮抗菌草基因組序列應(yīng)用到細(xì)菌素?cái)?shù)據(jù)庫BAGEL4(http://bagel4.molgenrug.nl/index.php)進(jìn)行細(xì)菌素的鑒定。

1.6 拮抗菌對(duì)辣椒軟腐病的體內(nèi)控病活性

拮抗菌不同組分的制備過程同1.4.2節(jié)。果膠桿菌PccCBJ3重懸于無菌生理鹽水至濃度約為103CFU/mL,隨后按照1.3.1節(jié)處理辣椒。辣椒每孔中分別加入30 μL拮抗菌菌懸液、CFS、粗細(xì)菌素,并以無菌生理鹽水作為對(duì)照。晾干后貯藏于25 ℃,每天記錄發(fā)病率和病斑直徑。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10個(gè)辣椒。

1.7 掃描電鏡觀察

按照1.6節(jié)步驟在辣椒孔中接種病原菌PccCBJ3和進(jìn)行CFS處理。取辣椒傷口附近的植物組織,取樣面積約為5 mm×5 mm。隨后,將樣品在4 ℃下2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛溶液中進(jìn)行過夜浸泡固定,次日分別用20%、30%、40%、50%、70%、90%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇進(jìn)行脫水,再用100%的乙醇脫水2遍,每次脫水時(shí)間為30 min。樣品干燥后,用掃描電鏡以5 000×的放大倍數(shù)進(jìn)行觀察。

1.8 CFS對(duì)辣椒中綠色熒光標(biāo)記Pcc CBJ3生長的影響

為了追蹤病原菌在辣椒上的生長情況,果膠桿菌PccCBJ3使用綠色熒光蛋白進(jìn)行標(biāo)記。PccCBJ3于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至OD600 nm=0.3～0.5。隨后,利用預(yù)冷的CaCl2溶液制備PccCBJ3感受態(tài)細(xì)胞。接著,參考董愛菊等[17]的方法,將實(shí)驗(yàn)室前期研究已構(gòu)建的綠色熒光蛋白重組質(zhì)粒pCR2.1-TOPO- GFP電轉(zhuǎn)化至PccCBJ3感受態(tài)細(xì)胞。在含有卡那霉素的LB平板培養(yǎng)后,挑取帶有綠色熒光的菌落并進(jìn)行甘油保藏。

按照1.6節(jié)步驟在辣椒孔中接種綠色熒光標(biāo)記PccCBJ3和進(jìn)行CFS處理。每天取果實(shí)傷口處植物組織樣品進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。無菌生理鹽水代替CFS作為對(duì)照。每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

1.9 CFS對(duì)辣椒貯藏品質(zhì)的影響

按照1.6節(jié)步驟在辣椒孔中接種病原菌PccCBJ3和進(jìn)行CFS處理。無菌生理鹽水代替CFS作為對(duì)照。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)30個(gè)辣椒。傷口附近1 cm內(nèi)進(jìn)行辣椒組織取樣,用液氮迅速冷凍后,樣品存于-80 ℃冰箱,待用。

1.9.1 硬度

使用硬度計(jì)測定辣椒傷口附近組織的硬度。

1.9.2 可溶性固形物(soluble solids content,SSC)

不同處理取等質(zhì)量的樣品,研磨后過濾,用手持式糖度計(jì)測定濾液中的SSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.9.3 失重率

每天對(duì)辣椒稱重。失重率=(起始辣椒重量-當(dāng)天辣椒重量)/起始辣椒重量。

1.9.4 丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量

參考SHU等[18]的方法測定MDA含量并進(jìn)行一定的修改。取0.5 g辣椒樣品,加入5 mL 5%(體積分?jǐn)?shù))三氯乙酸,研磨后所得勻漿轉(zhuǎn)移至離心管中,接著用5 mL三氯乙酸洗研缽,并將洗液收集于同一離心管中。離心,取上清液2 mL,加硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)2 mL,混合后在100 ℃水浴中煮沸30 min,分別測450、532、600 nm吸光度值,并按以下公式計(jì)算MDA濃度。MDA的含量以每克果蔬組織鮮重中所含MDA的物質(zhì)的量(μmol/g FW)表示。

c/(μmol/L)=6.45×(A532-A600)-0.56×A450

(1)

式中:A532、A600、A450,分別為上述反應(yīng)液在532、600、450 nm處的吸光值;c,MDA的濃度,μmol/L。

1.10 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù),數(shù)據(jù)結(jié)果的表示均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用GraphPad Prism 8.3.0制圖,采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用單因素AVOVA檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏溫度下果膠桿菌對(duì)辣椒的致病性

2.1.1 25 ℃貯藏下的致病性

如圖1-a所示,在25 ℃下,接種不同濃度病原菌后的辣椒隨貯藏時(shí)間延長,腐爛程度加重,且不同濃度下腐爛率有明顯差異。如圖1-b所示,接種濃度≥3 lg CFU/mL果膠桿菌PccCBJ3時(shí),貯藏至第3天,辣椒軟腐病發(fā)病率均達(dá)到100%。此時(shí)辣椒完全腐爛,呈水滯狀,散發(fā)出惡臭(圖1-a,第3天)。當(dāng)病原菌接種濃度為2 lg CFU/mL時(shí),貯藏第3天,辣椒腐爛率仍達(dá)到(85±13.22)%。當(dāng)病原菌接種濃度為1 lg CFU/mL時(shí),在第3天保持較低的發(fā)病率(8.3%)。AKBAR等[19]將濃度為8 lg CFU/mL軟腐病菌Pcc接種至不同的植物宿主中,在室溫下放置1～2 d,Pcc對(duì)辣椒的致病力最強(qiáng),其次是番茄,馬鈴薯;它們的軟腐病病斑直徑分別為22.3、7.9、7.8 mm。在本研究中,果膠桿菌PccCBJ3濃度低至3 lg CFU/mL時(shí)仍能夠?qū)е吕苯犯癄€率達(dá)到100%,這也證明了Pcc對(duì)辣椒具有較強(qiáng)的致病力。

2.1.2 4 ℃貯藏下的致病性

如圖2-a所示,不同濃度果膠桿菌PccCBJ3對(duì)辣椒的致病力有顯著差異。當(dāng)病原菌接種濃度為8 lg CFU/mL時(shí),辣椒在貯藏第21天時(shí)腐爛率達(dá)到100%(圖2-b)。由圖2-b和圖2-c可知,當(dāng)病原菌接種量為7 lg CFU/mL時(shí),辣椒在貯藏第23天時(shí)的發(fā)病率為(58.33±17.56)%,病斑直徑為(44.17±3.82) mm;當(dāng)病原菌接種量為6 lg CFU/mL時(shí),辣椒在貯藏第23天時(shí)的發(fā)病率僅為(8.33±16.63)%,病斑直徑為(12.67±2.26) mm。這說明在4 ℃貯藏時(shí),高濃度的PccCBJ3對(duì)辣椒的致病力較強(qiáng)。與常溫相比,在低溫下PccCBJ3的致病能力受到顯著抑制。

2.2 拮抗菌對(duì)辣椒軟腐病病原菌的體外抑菌活性

從108株細(xì)菌中篩選得到了1株細(xì)菌LAB2對(duì)果膠桿菌PccCBJ3有抑菌效果(圖3-a),其抑菌圈直徑為(45.7±0.58) mm。菌株LAB2經(jīng)16S rDNA測序鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。為了進(jìn)一步探究該乳酸菌發(fā)揮抑菌效果的有效成分,進(jìn)行了發(fā)酵液不同組分的體外活性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示CFS(圖3-c)和粗細(xì)菌素(圖3-d)均對(duì)果膠桿菌PccCBJ3具有抑菌活性,而菌體(圖3-b)無抑菌活性。和粗細(xì)菌素相比,CFS顯示出更好的抑菌效果,我們推測在CFS中還含有細(xì)菌素以外的其他抑菌物質(zhì)在起作用。L.plantarum被報(bào)道可產(chǎn)生多種具有抑菌活性的代謝產(chǎn)物,如有機(jī)酸、H2O2、CO2、雙乙酰、細(xì)菌素等[20]。

a-雙層劃線法篩選拮抗菌;b-菌體;c-CFS;d-細(xì)菌素圖3 L.plantarum LAB2及發(fā)酵液不同組分對(duì)Pcc CBJ3的抑菌活性Fig.3 Antibacterial activity of L.plantarum LAB2 and different components of its fermentation against Pcc CBJ3

2.3 L.plantarum LAB2所產(chǎn)細(xì)菌素的鑒定

圖3表明,L.plantarumLAB2所產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)果膠桿菌PccCBJ3具有抑菌活性。細(xì)菌素被分泌到細(xì)胞外,因此也是L.plantarumLAB2 CFS發(fā)揮控病活性的重要成分之一。細(xì)菌素為核糖體編碼抗菌肽,其編碼基因存在于基因組中,故本研究通過基因組測序?qū)ζ溥M(jìn)行鑒定。通過BAGEL4細(xì)菌素?cái)?shù)據(jù)庫搜索,鑒定到了1個(gè)細(xì)菌素基因簇,由32個(gè)閱讀框組成(圖4)。該基因簇中包含4個(gè)細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因(orf10、orf11、orf18、orf20)。該4個(gè)細(xì)菌素基因所編碼的氨基酸序列與已知細(xì)菌素plantaricin_E、plantaricin_F、plantaricin_N和plantaricin_J的相似度分別為100%、100%、100%和94.23%(表1)。其中plantaricin_E和plantaricin_F是一對(duì)class Ⅱb類2個(gè)多肽細(xì)菌素[21]。由此可見,L.plantarumLAB2編碼的細(xì)菌素中含有一對(duì)class Ⅱb細(xì)菌素。

表1 L.plantarum LAB2所產(chǎn)細(xì)菌素的氨基酸序列Table 1 Amino acid sequences of bacteriocins from L.plantarum LAB2

圖4 L.plantarum LAB2細(xì)菌素基因簇Fig.4 Bacteriocin gene cluster of L.plantarum LAB2

2.4 L.plantarum LAB2不同組分對(duì)辣椒軟腐病的體內(nèi)控制效果

由2.2節(jié)結(jié)果可知,L.plantarumLAB2不同組分對(duì)辣椒軟腐病病原菌的體外控制能力不同。同時(shí)分析了L.plantarumLAB2不同組分對(duì)辣椒軟腐病的體內(nèi)控制效果,結(jié)果如圖5-a所示。在貯藏第3天,對(duì)照組幾乎完全腐爛,呈水滯狀,并且散發(fā)出臭味。和對(duì)照組相比,菌體、CFS和粗細(xì)菌素處理組的病害腐爛情況均得到了一定程度的減輕,其中CFS對(duì)辣椒軟腐病的控制效果最明顯。如圖5-b和圖5-c所示,在貯藏第1天,對(duì)照組的發(fā)病率和病斑直徑分別為(75±5)%和(4.53±0.50) mm,而CFS處理組未出現(xiàn)腐爛。在貯藏第2天,對(duì)照組的發(fā)病率和病斑直徑分別為(95±5)%和(19.20±0.46) mm,而CFS處理組的發(fā)病率和病斑直徑分別為(1.67±2.89)%和(0.27±0.46) mm。在貯藏第3天,對(duì)照組的發(fā)病率已達(dá)到100%,而CFS處理組的發(fā)病率只有(8.3±5.8)%。由此可見,CFS處理能夠顯著降低辣椒軟腐病的發(fā)生。

a-控病效果;b-發(fā)病率;c-病斑直徑圖5 L.plantarum LAB2發(fā)酵液不同組分對(duì)辣椒軟腐病的體內(nèi)控制效果Fig.5 In vivo control effect of different components of L.plantarum LAB2 fermentation on pepper soft rot注:*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001表示對(duì)照組與CFS處理組相比,存在顯著差異,下同;不同小寫字母表示組間存在顯著差異,P<0.05。

2.5 微觀結(jié)構(gòu)觀察

上述體內(nèi)體外控病實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明CFS控制辣椒軟腐病的能力最強(qiáng),因此使用掃描電鏡進(jìn)一步觀察了CFS處理后的辣椒表皮結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖6所示,接種果膠桿菌PccCBJ3后的對(duì)照2因軟腐病害的發(fā)生,辣椒表皮呈現(xiàn)明顯褶皺,且表面附著大量清晰可見的果膠桿菌PccCBJ3菌體。然而,CFS處理組辣椒表皮平整無皺褶,與未感染病原菌的對(duì)照1的辣椒表皮結(jié)構(gòu)類似。由此可見,CFS處理可以明顯保持辣椒表皮結(jié)構(gòu)的完好性。

2.6 CFS對(duì)辣椒果膠桿菌生長的影響

從含有卡那霉素的LB平板上挑選到構(gòu)建成功的綠色熒光蛋白標(biāo)記的PccCBJ3菌株(PccCBJ3-GFP)。使用該熒光標(biāo)記菌株進(jìn)行辣椒上病原菌數(shù)量分析時(shí),可有效排除辣椒中其他微生物的干擾。如圖7所示,對(duì)照組辣椒上PccCBJ3-GFP的數(shù)量在第1天顯著上升,隨后逐漸平穩(wěn)上升,這表明當(dāng)辣椒受到病原菌侵染后,病原菌可以在果實(shí)傷口快速定植生長。然而,用CFS處理后,辣椒上的病原菌數(shù)量始終顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。在第0天(處理后2 h),PccCBJ3-GFP的數(shù)量由4.58 lg CFU/mL降低至3.11 lg CFU/mL,這表明CFS處理能夠立即降低辣椒上的病原菌。在貯藏第4天,對(duì)照組PccCBJ3-GFP的數(shù)量為9.02 lg CFU/mL,而CFS處理組僅有4.30 lg CFU/mL,即病原菌數(shù)量減少了99.99%。以上結(jié)果表明CFS處理可顯著抑制辣椒中果膠桿菌的生長,從而減緩由軟腐病引起的辣椒腐爛損失。

圖7 CFS處理對(duì)辣椒中Pcc CBJ3 - GFP數(shù)量的影響Fig.7 The effect of CFS treatment on the number of Pcc CBJ3 - GFP in pepper

2.7 CFS處理對(duì)辣椒貯藏品質(zhì)的影響

2.7.1 硬度

如圖8-a所示,隨著貯藏時(shí)間的延長,對(duì)照組辣椒的硬度逐漸降低,即果實(shí)逐漸軟化。CFS處理組辣椒的硬度隨貯藏時(shí)間延長也在降低,但是和對(duì)照組相比,硬度下降的速度受到抑制。其中,在貯藏第2～4天,CFS處理組辣椒的硬度顯著大于對(duì)照組辣椒的硬度(P<0.05)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CFS處理能夠延緩辣椒的軟化。

a-硬度;b-可溶性固形物含量;c-失重率;d-MDA含量圖8 CFS處理對(duì)辣椒貯藏品質(zhì)的影響Fig.8 Effect of CFS treatment on storage quality of pepper

2.7.2 可溶性固形物

如圖8-b所示,對(duì)照組辣椒在貯藏期的可溶性固形物含量先上升,到第2天以后逐漸下降。由圖1可知,在貯藏第2天,辣椒的腐爛率約為95%,腐爛面積約占整果面積的50%。推測可溶性固形物含量前2 d升高的原因是辣椒從完好到50%面積腐爛過程中,在病原菌產(chǎn)生的多種細(xì)胞壁降解酶的作用下,辣椒細(xì)胞內(nèi)的可溶性固形物流出,可溶性固形物含量升高;而在貯藏2 d以后,辣椒逐漸完全腐爛,細(xì)胞內(nèi)流出的營養(yǎng)物質(zhì)被大量繁殖的病原菌吸收利用,可溶性固形物的含量出現(xiàn)下降。CFS處理組辣椒可溶性固形物變化趨勢與對(duì)照組相似,但是可溶性固形物含量出現(xiàn)降低所需的時(shí)間比對(duì)照組更長。在貯藏第4天,CFS處理組辣椒的可溶性固形物含量高于對(duì)照組。由此可見,在貯藏后期,CFS處理能夠抑制辣椒可溶性固形物的減少。

2.7.3 失重率

如圖8-c所示,隨著貯藏時(shí)間的延長,對(duì)照組和CFS處理組的辣椒重量均減輕,但是CFS處理組辣椒的失重率始終低于對(duì)照組。從貯藏第3天開始,CFS處理組辣椒的失重率顯著低于對(duì)照組。在貯藏第4天,對(duì)照組辣椒的失重率為(45.13±6.26)%,而CFS處理組辣椒的失重率為(13.10±1.25)%。該結(jié)果表明CFS處理可以延緩辣椒的失水。

2.7.4 MDA含量

MDA含量是植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度的體現(xiàn),可以反應(yīng)出辣椒在逆境環(huán)境下的衰老情況。由圖8-d可知,隨著貯藏時(shí)間的延長,對(duì)照組和CFS處理組辣椒的MDA含量均呈上升的趨勢。在貯藏第3天和第4天,CFS處理組辣椒的MDA含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05),這表明用CFS處理可以減緩辣椒細(xì)胞膜質(zhì)過氧化的程度,維持辣椒的品質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究探究了辣椒在不同貯藏溫度(25 ℃和4 ℃)下,軟腐病病原菌對(duì)辣椒的致病力。結(jié)果表明,在25 ℃下貯藏時(shí),PccCBJ3對(duì)辣椒的致腐能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于4 ℃下貯藏時(shí)。L.plantarumLAB2不同組分的體內(nèi)體外控病活性結(jié)果均表明CFS具有最強(qiáng)的控病能力,其次是細(xì)菌素,而菌體本身并無控病活性。細(xì)菌素是CFS有效成分之一,從L.plantarumLAB2基因組序列中鑒定到了4個(gè)細(xì)菌素。其中,plantaricin _E和plantaricin_F是一對(duì)class Ⅱb類2個(gè)多肽細(xì)菌素,且含有1個(gè)與plantaricin_J相似度為94.23%的較新細(xì)菌素。掃描電子顯微鏡和熒光標(biāo)記PccCBJ3計(jì)數(shù)結(jié)果也證明了CFS處理能夠降低辣椒病原菌的數(shù)量,維持辣椒表皮結(jié)構(gòu)的完好性。辣椒貯藏品質(zhì)結(jié)果表明用CFS處理可以顯著延緩辣椒軟化、失水,減少可溶性固形物的流失,并降低辣椒MDA的積累,從而延長其貯藏期。綜上,L.plantarumLAB2可用作生物防治拮抗菌,能夠有效控制辣椒軟腐病,維持果實(shí)品質(zhì),在辣椒貯藏及病害防控中具有較大的應(yīng)用潛力。