濃香型白酒窖池中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性研究

劉瑞娜,奚文韜,趙東,張?zhí)靾A,鄭佳,張京濤,姚粟*,翟磊*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,北京,100015)2(宜賓五糧液股份有限公司,四川 宜賓,644000)

白酒在中國有著悠久的釀造和飲用歷史,是中國各種傳統(tǒng)酒類(除果酒、米酒外)的統(tǒng)稱。1979年全國第三屆評酒大會根據(jù)不同釀造工藝、制曲方式和風(fēng)味特征等首次正式提出并確立了濃香型、清香型、醬香型、米香型和其他香型5種白酒香型[1-2]。目前市場上的白酒香型主要是以4種基礎(chǔ)香型為主的12種香型,其中作為行業(yè)占比第一大香型的濃香型白酒因其“窖香濃郁、綿柔甘冽、香味協(xié)調(diào)、尾凈余長”的風(fēng)味特點被譽(yù)為“中國白酒典范”[2-4]。2021年濃香型白酒最新標(biāo)準(zhǔn)GB/T 10781.1—2021《白酒質(zhì)量要求 第1部分:濃香型白酒》正式發(fā)布,對濃香型白酒給出明確定義:以糧谷為原料,采用濃香大曲為糖化發(fā)酵劑,經(jīng)泥窖固態(tài)發(fā)酵,固態(tài)蒸餾、陳釀、勾調(diào)而成的,不直接或間接添加食用酒精及非自身發(fā)酵產(chǎn)生的呈色呈香呈味物質(zhì)的白酒。濃香型白酒采用泥窖作為發(fā)酵載體,已有研究表明在“泥窖生香”的微生態(tài)機(jī)制中主要包含2個發(fā)酵體系:酒醅發(fā)酵體系和窖泥發(fā)酵體系。2個優(yōu)勢菌群全然不同的體系中,微生物在發(fā)酵過程中發(fā)生了菌群的遷移富集和代謝產(chǎn)物的傳遞交換,共同影響著濃香型白酒典型“窖香”的形成。老窖出好酒,在連續(xù)不斷的生產(chǎn)過程中,窖泥中的營養(yǎng)成分和特征特性不斷發(fā)生變化,微生物的群落結(jié)構(gòu)不斷的進(jìn)行演替,形成了適合于白酒釀造的特有的微生物群落,并最終決定了濃香型白酒的品質(zhì)[5-8]。目前對濃香型白酒釀造過程中窖池微生物體系與其酒體品質(zhì)及風(fēng)味特征相關(guān)機(jī)理的研究有了一定的進(jìn)展,但三者之間的互作機(jī)制和內(nèi)在關(guān)聯(lián)仍未完全解析。

濃香型白酒窖池中微生物群落結(jié)構(gòu)的解析以及特征微生物資源的發(fā)掘?qū)沂景拙漆勗祜L(fēng)味機(jī)理、提升白酒品質(zhì)、加強(qiáng)質(zhì)量管理具有重要意義。目前白酒窖池中微生物群落結(jié)構(gòu)研究主要采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)變性梯度凝膠電泳(PCR-denatured gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)[9]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)[10]、實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)[11]、宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)[12-14]及高通量測序[5,15]等非培養(yǎng)技術(shù),該類技術(shù)可以獲得窖泥微生物菌群的定性及相對定量信息[16],但對其中功能微生物的篩選與作用機(jī)制解析仍需獲得微生物純培養(yǎng)物?？膳囵B(yǎng)組學(xué)(culturomics)是綜合利用多種培養(yǎng)條件進(jìn)行微生物菌種的分離培養(yǎng),并通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)和16S rDNA基因測序技術(shù)對分離菌種進(jìn)行大規(guī)模鑒定,盡可能多地獲得在常規(guī)培養(yǎng)條件下不可培養(yǎng)微生物的一種技術(shù)[17-18]。本研究依據(jù)濃香型白酒窖池中微生物群落結(jié)構(gòu)特征,設(shè)計和優(yōu)化了7種篩選培養(yǎng)基,開展了窖池中功能微生物,尤其是難培養(yǎng)厭氧微生物資源的發(fā)掘。根據(jù)不同分離篩選條件和分離生境的可培養(yǎng)細(xì)菌種類和豐度,確定了濃香型白酒窖池特征菌,并解析特征菌的生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 儀器與試劑

HG-50高壓滅菌鍋,日本平山制作所株式會社;移液器(100 μL、1 mL、5 mL),德國Eppendorf公司;AC2-4S1生物安全柜,新加坡藝思高科技有限公司;DG-250厭氧工作站,英國Don Whitley Scientific公司;DLQ120-B智能厭氧制備儀,北京愛思普科技有限公司;BHG-8082型恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;LX-165T2R醫(yī)用離心機(jī),青島海特生物醫(yī)療有限公司;MALDI-TOF MS基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀,德國Bruker Daltonik GmbH公司;全自動革蘭氏染色儀,青島瀾澈生物科技有限公司;厭氧盒,日本三菱化學(xué)公司;ECLIPSE 80i光學(xué)顯微鏡,尼康儀器(上海)有限公司。

0.85%生理鹽水,北京君立康科技發(fā)展有限責(zé)任公司;厭氧產(chǎn)氣袋,日本三菱化學(xué)公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、dNTPs、TaqDNA聚合酶、DNA Marker,天根生化科技(北京)有限公司;溶菌酶、瓊脂糖,北京全式金生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基的選擇和制備

通過對濃香型白酒窖池中微生物群落結(jié)構(gòu)和窖池中特征菌種生理代謝特征研究相關(guān)文獻(xiàn)的調(diào)研[5,19-20],參考KOMODO(Known Media Database)網(wǎng)站(http://komodo.modelseed.org/)中對不同種屬厭氧微生物培養(yǎng)基配制的建議要求[21],最終選擇了7種培養(yǎng)基進(jìn)行濃香型白酒窖池中可培養(yǎng)細(xì)菌的分離培養(yǎng)研究。TSA培養(yǎng)基和R2A瓊脂培養(yǎng)基作為好氧微生物分離培養(yǎng)基,其中TSA培養(yǎng)基主要用于分離常見好氧菌和不動桿菌屬;R2A瓊脂培養(yǎng)基則用于分離苛養(yǎng)好氧菌。改良MRS瓊脂培養(yǎng)基、強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基、苛養(yǎng)厭氧菌瓊脂培養(yǎng)基、改良PYG培養(yǎng)基和蛋白瘤胃球菌培養(yǎng)基作為厭氧微生物分離培養(yǎng)基,分別用于片球菌屬/乳桿菌屬、梭菌屬、苛養(yǎng)厭氧菌、喜熱菌屬/普雷沃氏菌屬和瘤胃球菌屬等厭氧或兼性厭氧微生物的選擇性分離。7種培養(yǎng)基的配方如下,滅菌條件均為121 ℃、15 min。

TSA培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨15.0,大豆蛋白胨5.0,NaCl 5.0,瓊脂15.0。

R2A瓊脂培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨0.5,酵母粉0.5,酪蛋白胨0.5,葡萄糖0.5,可溶性淀粉0.5,K2HPO40.3,丙酮酸鈉 0.3,MgSO40.024,瓊脂15.0加熱溶解。

改良MRS瓊脂培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.0,牛肉膏10.0,酵母粉5.0,葡萄糖20.0,檸檬酸銨2.0,吐溫80 1.0 mL,半胱氨酸鹽酸鹽0.5,CH3COONa 5.0,K2HPO42.0,MgSO47H2O 0.1,MnSO40.05,瓊脂 15.0。

強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10.0,牛肉膏10.0,酵母粉3.0,葡萄糖5.0,NaCl 5.0,可溶性淀粉1.0,CH3COONa 5.0,半胱氨酸鹽酸鹽0.5,瓊脂15.0。

苛養(yǎng)厭氧菌瓊脂培養(yǎng)基(g/L):混合蛋白胨23.0,NaCl 5.0,可溶性淀粉1.0,葡萄糖1.0,C3H3NaO31.0,L-精氨酸1.0,琥珀酸鈉0.5,半胱氨酸鹽酸鹽0.5,NaHCO30.4,可溶性焦磷酸0.25,氯化血紅素0.01,維生素K 0.001,瓊脂15.0。

改良PYG培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨 5.0,蛋白胨 5.0,酵母粉 10.0,牛肉膏 5.0,葡萄糖 5.0,K2HPO42.0,吐溫-80 1.0 mL,NaHCO30.4,NaCl 0.08,KH2PO40.04,MgSO47H2O 0.02,CaCl22H2O 0.01,刃天青 1.0 mg/L。加熱煮沸3～5 min,冷卻后添加氯化血紅素5 mg/L、維生素K11 mg/L、半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L和瓊脂15.0 g/L,pH 7.2。

蛋白瘤胃球菌培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨 5.0,酵母粉 2.0,葡萄糖 3.0,纖維二糖 2.0,(NH4)2SO40.8,NaCl 0.48,KH2PO40.24,K2HPO40.24, MgSO47H2O 0.1,CaCl27H2O 0.064,刃天青 1.0 mg/L。加熱煮沸3～5 min,冷卻后添加Na2CO34.0 g/L、脂肪酸溶液1 mL/L、半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L和瓊脂15.0 g/L,pH 7.0。

1.1.3 樣品采集

樣品采集自四川省宜賓市某濃香型白酒生產(chǎn)企業(yè)3個車間的窖池,3個窖池的窖齡分別為30年、20年和15年,樣品來源包括窖泥和酒醅。窖泥樣品分別從距地面約0.3、1、2 m的窖池四壁和底部采集,3個窖池的窖泥樣品混勻作為窖泥待檢樣品;酒醅樣品采用五點取樣法,從四周和中間采集,3個窖池的酒醅樣品混勻作為酒醅待檢樣品。窖泥和酒醅樣品均從出池當(dāng)天(2022年1月13日)的一批窖池中采樣獲得,采集后的樣品密封,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

設(shè)計7種不同篩選分離培養(yǎng)基,采用好氧和厭氧的培養(yǎng)方式,結(jié)合MALDI-TOF MS和16S rDNA基因測序技術(shù)對濃香型白酒窖泥和酒醅樣品中的細(xì)菌進(jìn)行大規(guī)模分離篩選和鑒定,本實驗建立的白酒窖池中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性研究的技術(shù)路線如圖1所示。

圖1 濃香型白酒窖池中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性研究技術(shù)路線Fig.1 Technical route of culturable bacteria diversity research in strong-flavor Baijiu cellars

1.2.1 好氧微生物的分離純化

在生物安全柜中分別稱取25 g窖泥待檢樣品和酒醅待檢樣品于225 mL無菌生理鹽水中,充分混勻制備成1∶10樣品稀釋液,吸取1 mL稀釋液加入9 mL無菌生理鹽水,充分混勻制備成1∶100樣品稀釋液,重復(fù)上述操作對樣品進(jìn)行梯度稀釋,取2～3個合適濃度的稀釋液分別涂布于TSA培養(yǎng)基和R2A瓊脂培養(yǎng)基平板上,37 ℃培養(yǎng)3 d。從2種培養(yǎng)基平板上選取菌落形態(tài)不同的單菌落,在對應(yīng)的培養(yǎng)基平板上四區(qū)劃線分純,37 ℃培養(yǎng)3 d。重復(fù)上述操作對分離菌株進(jìn)行純化,根據(jù)菌落形態(tài)和革蘭氏染色鏡檢確認(rèn),將純化后的分離菌株編號并轉(zhuǎn)移至含15%無菌甘油的甘油管中,-80 ℃冰箱保藏備用。

1.2.2 厭氧微生物的分離純化

為最大限度地分離獲得濃香型白酒窖池中不同生長特性的厭氧微生物,對厭氧菌的分離采用2種方法:平板涂布法和滾管法。

平板涂布法:試驗前一天將無菌生理鹽水、5種厭氧微生物分離培養(yǎng)基放置于厭氧工作站中過夜置換除氧,刃天青作為指示劑確認(rèn)氧氣除凈。試驗當(dāng)天,在厭氧操作臺分別稱取25 g窖泥待檢樣品和酒醅待檢樣品于225 mL無菌生理鹽水中,充分混勻制備成1∶10樣品稀釋液,吸取1 mL稀釋液加入9 mL無菌生理鹽水,充分混勻制備成1∶100樣品稀釋液,重復(fù)上述操作對樣品進(jìn)行梯度稀釋,取2～3個合適濃度的稀釋液分別涂布于5種厭氧培養(yǎng)基平板上,37 ℃厭氧培養(yǎng)3 d后參考好氧微生物純化及保藏方法在厭氧操作臺中對厭氧分離菌株四區(qū)劃線分純和-80 ℃冰箱甘油管保藏。

滾管法:5種分裝到厭氧管中的厭氧微生物分離培養(yǎng)基經(jīng)智能厭氧制備儀置換除氧后高溫滅菌,將滅菌后的液態(tài)瓊脂培養(yǎng)基厭氧管于50 ℃水浴鍋中保溫備用。用無菌注射器吸取100 μL于厭氧工作站中稀釋至適宜梯度的樣品稀釋液加入到厭氧管中,平放至盛有碎冰塊的容器中迅速滾動,使帶菌培養(yǎng)基在厭氧管內(nèi)壁形成均勻的薄膜,完全凝固的厭氧管置于厭氧袋中37 ℃厭氧培養(yǎng)3 d。在厭氧工作站中用無菌針頭挑取厭氧管內(nèi)壁上菌落形態(tài)不同的單菌落,轉(zhuǎn)接至相應(yīng)的液體培養(yǎng)基厭氧管中37 ℃厭氧培養(yǎng)2 d。將梯度稀釋后的厭氧管中的菌液用無菌注射器再次加入到液態(tài)瓊脂培養(yǎng)基厭氧管中冰浴滾管。重復(fù)上述操作對厭氧管分離菌株進(jìn)行純化,至觀察菌落和菌體形態(tài)均一后編號保藏于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3 分離菌株MALDI-TOF MS鑒定

采用MALDI-TOF MS鑒定系統(tǒng)對分離菌株進(jìn)行快速鑒定,以初步確定分離菌株的分類學(xué)地位[22]。該方法主要通過采集微生物穩(wěn)定表達(dá)的核糖體蛋白指紋圖譜,與已知微生物菌種蛋白指紋圖譜數(shù)據(jù)庫比對分析后,得到待測菌株的鑒定結(jié)果及置信水平,實現(xiàn)微生物菌種的快速鑒定[23-24]。本研究使用的MALDI-TOF MS鑒定數(shù)據(jù)庫包括10 833株菌,其中革蘭氏陰性菌4 318株,革蘭氏陽性菌5 572株,酵母菌和絲狀真菌943株。

根據(jù)GB/T 33682—2017《基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜鑒別微生物方法通則》中甲酸提取法對分離菌株進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定:分別挑取各待測菌株菌落于盛有300 μL超純水的1.5 mL離心管中,充分混勻后加入900 μL無水乙醇(色譜純),旋渦振蕩1 min離心菌體細(xì)胞(13 000 r/min,2 min),棄去上清液,重復(fù)離心操作,用移液器吸凈上清液后向沉淀中加入50 μL 70%的甲酸水溶液,旋渦振蕩重懸菌體,再加入50 μL乙腈混合均勻,13 000 r/min離心2 min,吸取1 μL上清液點樣在樣品靶板孔中,待室溫下晾干后滴加1 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid,HCCA)基質(zhì)溶液覆蓋在每個樣本上,室溫下自然晾干。將點樣完成的靶板放入儀器中,按照儀器操作規(guī)程設(shè)置參數(shù)后采集待測菌株蛋白指紋圖譜。采集到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入本地微生物指紋圖譜庫,在鑒定系統(tǒng)中得到待測菌株的鑒定結(jié)果。

1.2.4 分離菌株DNA提取和16S rDNA及功能基因測序

對于MALDI-TOF MS鑒定未得到結(jié)果的菌株,則采用16S rDNA及功能基因測序技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。按照TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書的操作步驟提取各分離菌株的基因組DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩７蛛x菌株的16S rDNA測序PCR擴(kuò)增以27F和1492R為引物,功能基因gyrB測序PCR擴(kuò)增以gyrB-F(5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′)和gyrB-R(5′-AG-CAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTC-NGTCAT-3′)為上下游引物,反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)[25]的方法。PCR完成后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,以檢測DNA提取質(zhì)量。將條帶清晰且無雜帶的擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.5 特征菌種系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)不同分離篩選條件和分離生境的可培養(yǎng)細(xì)菌種類和豐度,結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研確定6株濃香型白酒窖池潛在特征菌并對特征菌種進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。將測序得到的各菌株序列整理拼接后提交至GenBank,運(yùn)用Clusta-X軟件對序列進(jìn)行校正[26],通過NCBI進(jìn)行BLAST比對后利用MEGA軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining)開展序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,自展值(bootstrap value)設(shè)置重復(fù)取樣1 000次。

1.2.6 特征菌種形態(tài)學(xué)特征和生理生化試驗

將純化后的6株濃香型白酒窖池特征菌種代表菌株接種于相應(yīng)分離培養(yǎng)基上,觀察不同菌株菌落形態(tài)特征。同時將分離株菌落通過戊二醛固定、無菌水漂洗、乙醇梯度脫水、干燥及離子濺射儀噴金后固定于樣品臺上,利用掃描電鏡觀察菌株菌體微觀形態(tài)。結(jié)合宏觀和微觀形態(tài)特征參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[27],按照梅里埃API 50 CHB和API 20A鑒定試劑盒說明書對分離菌株進(jìn)行碳源利用等生理生化指標(biāo)檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃香型白酒窖池中可培養(yǎng)細(xì)菌分離純化結(jié)果

經(jīng)多次劃線分純及菌落菌體形態(tài)特征排重后,從濃香型白酒窖池中共分離得到來自21個屬44個種的124株細(xì)菌,包括芽胞桿菌屬(Bacillussp.)、淚珠狀產(chǎn)孢菌屬(Lacrimisporasp.)、嗜蛋白菌屬(Proteiniphilumsp.)、類芽胞桿菌屬(Paenibacillussp.)和互營球菌屬(Syntrophococcussp.)在內(nèi)的9株潛在細(xì)菌新種。厭氧條件分離得到100株分離株,其中PYG培養(yǎng)基35株,蛋白瘤胃球菌培養(yǎng)基18株,苛養(yǎng)厭氧菌培養(yǎng)基18株,強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基13株,MRS培養(yǎng)基16株。在好氧條件下2種好氧培養(yǎng)基分離出24株可培養(yǎng)菌株:富集培養(yǎng)基TSA分離出14株,寡營養(yǎng)的R2A培養(yǎng)基分離出10株。厭氧條件下分離得到的微生物數(shù)量顯著高于有氧環(huán)境,表現(xiàn)出更高的豐度。在窖泥和酒醅2種不同的分離生境中,獲得的可培養(yǎng)微生物在數(shù)量方面相差不大,分別分離到60株和64株。

2.2 分離菌株MALDI-TOF MS及16S rDNA鑒定結(jié)果

采用甲酸提取法通過MALDI-TOF MS快速鑒定系統(tǒng)對濃香型白酒窖池中分離到的124株可培養(yǎng)微生物進(jìn)行分類學(xué)地位確認(rèn)。結(jié)果顯示81株分離株得到種水平的鑒定結(jié)果,占待檢菌株的65.3%。采用16S rDNA測序技術(shù)對經(jīng)MALDI-TOF MS鑒定未得到結(jié)果的43株細(xì)菌進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。鑒定分析結(jié)果表明,124株分離菌株均得到種屬水平的鑒定結(jié)果(表1),所有分離株分屬于21個屬的44種,包括Bacillussp.,Lacrimisporasp.,Proteiniphilumsp.,Paenibacillussp.和Syntrophococcussp.在內(nèi)的9株潛在細(xì)菌新種。

表1 濃香型白酒窖池分離菌株鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of strains isolated from the cellars of strong-flavor baijiu

2.3 濃香型白酒窖池中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性分析

2.3.1 不同分離條件可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性分析

從濃香型白酒窖池中分離得到的124株分離株中,厭氧環(huán)境分離到的100株包含16個屬的34種。其中PYG培養(yǎng)基分離效果最好,共獲到8個屬17個種的共35株細(xì)菌,包括梭菌屬(Clostridiumsp.)、芽胞桿菌屬(Bacillussp.)、淚珠狀產(chǎn)孢菌屬(Lacrimisporasp.)、鼠伴菌屬(Muricomessp.)、嗜熱芽胞桿菌屬(Caldibacillussp.)、嗜蛋白菌屬(Proteiniphilumsp.)、氨基酸桿狀菌屬(Aminobacteriumsp.)、互營球菌屬(Syntrophococcussp.)和3株潛在細(xì)菌新種,梭菌屬和芽胞桿菌屬為該培養(yǎng)基中的優(yōu)勢分離菌種,分別占該培養(yǎng)基總分離株的22.9%和34.3%;蛋白瘤胃球菌培養(yǎng)基分離到6個屬10個種的共18株分離株,包括芽胞桿菌屬、淚珠狀產(chǎn)孢菌屬、互營球菌屬、腸球菌屬(Enterococcussp.)、類芽胞桿菌屬(Paenibacillussp.)、魏茨曼氏菌屬(Weizmanniasp.)和3株潛在新種微生物,芽胞桿菌屬為該培養(yǎng)基中的優(yōu)勢分離菌種,占該培養(yǎng)基總分離株的44.4%;苛養(yǎng)厭氧菌培養(yǎng)基分離到7個屬的11種共18株分離株,包括芽胞桿菌屬、淚珠狀產(chǎn)孢菌屬、梭菌屬、嗜熱芽胞桿菌屬、鼠伴菌屬、嗜蛋白菌屬、魏茨曼氏菌屬和1株潛在細(xì)菌新種,芽胞桿菌屬和淚珠狀產(chǎn)孢菌屬為該培養(yǎng)基中的優(yōu)勢分離菌種,均占該培養(yǎng)基總分離株的22.2%;強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基分離到7個屬的9種共13株可培養(yǎng)細(xì)菌,包括梭菌屬、芽胞桿菌屬、淚珠狀產(chǎn)孢菌屬、嗜熱芽胞桿菌屬、鼠伴菌屬、魏茨曼氏菌屬、沉積物桿菌屬(Sedimentibactersp.)和1株潛在新種,梭菌屬和鼠伴菌屬為該培養(yǎng)基中的優(yōu)勢分離菌種,均占該培養(yǎng)基總分離株的23.1%;MRS培養(yǎng)基分離到7個屬的11種共16株分離株,包括梭菌屬、芽胞桿菌屬、魏茨曼氏菌屬、醋乳桿菌屬(Acetilactobacillussp.)、乳桿菌屬(Lactobacillussp.)、鏈球菌屬(Streptococcussp.)和魏斯氏菌屬(Weissellasp.),乳桿菌屬和鏈球菌屬為該培養(yǎng)基中的優(yōu)勢分離菌種,分別占該培養(yǎng)基總分離株的37.5%和18.8%。厭氧條件下獲得的分離株中窖池優(yōu)勢微生物種屬芽胞桿菌屬、梭菌屬及同屬于梭菌目(Clostridiales)的淚珠狀產(chǎn)孢菌屬分離株數(shù)量均占比較大:芽胞桿菌屬分離到4個種共27株,占厭氧分離株總數(shù)的27%;梭菌屬分離到8個種共16株,占厭氧分離總數(shù)的16%;淚珠狀產(chǎn)孢菌屬得到4種共12株,占總數(shù)的12%。其他如嗜熱芽胞桿菌屬[28]、乳桿菌屬[29]、鏈球菌屬[30]和嗜蛋白菌屬[31]等濃香型白酒窖池中已報道的常見微生物菌屬也均獲得了不同數(shù)量的分離株。

好氧條件下的2種培養(yǎng)基分離到9個屬14個種的24株可培養(yǎng)菌株。其中TSA培養(yǎng)基分離到9個屬的11種共14株可培養(yǎng)細(xì)菌,包括梭菌屬、芽胞桿菌屬、鼠伴菌屬、氨基酸桿狀菌屬、棒桿菌屬(Corynebacteriumsp.)、土壤芽胞桿菌屬(Solibacillussp.)、不動桿菌屬(Acinetobactersp.)、丙酸桿菌屬(Propionibacteriumsp.)和埃希氏菌屬(Escherichiasp.),梭菌屬和芽胞桿菌屬為該培養(yǎng)基中的優(yōu)勢分離菌種,均占該培養(yǎng)基總分離株的21.4%;寡營養(yǎng)的R2A培養(yǎng)基分離到芽胞桿菌屬的4種共10株分離株,包括1株潛在芽胞桿菌屬新種。有氧條件下分離到的24株可培養(yǎng)細(xì)菌優(yōu)勢菌屬與厭氧條件分離株相似,數(shù)量較多的也為芽胞桿菌屬和梭菌屬,前者得到5個種的13株,后者包含2個種共3株。此外丙酸桿菌屬、土壤芽胞桿菌屬、棒桿菌屬等可培養(yǎng)微生物菌屬在有氧分離培養(yǎng)條件下也均得到了一定數(shù)量的分離菌株。

比較不同分離篩選條件下獲得的可培養(yǎng)細(xì)菌種類和豐度,可以發(fā)現(xiàn)在厭氧條件下分離到的細(xì)菌種屬類型及數(shù)量均高于有氧環(huán)境,表現(xiàn)出更高的豐度和多樣性。值得注意的是,在有氧和厭氧2種分離培養(yǎng)環(huán)境下獲得的窖池分離菌株數(shù)量最多的均為芽胞桿菌屬和梭菌屬。表明可以通過優(yōu)化和改良培養(yǎng)基等方式獲得在有氧條件下較難培養(yǎng)的梭菌屬微生物,也可以在厭氧環(huán)境中分離得到部分需氧或兼性厭氧的芽胞桿菌屬微生物。但不同種類培養(yǎng)基對微生物分離篩選能力仍存在一定差異:淚珠狀產(chǎn)孢菌屬在除MRS培養(yǎng)基外的4種厭氧培養(yǎng)基中均獲得一定數(shù)量的分離株;魏茨曼氏菌屬則在除PYG培養(yǎng)基外的4種厭氧培養(yǎng)基中均有分離株出現(xiàn);嗜熱芽胞桿菌屬和鼠伴菌屬在蛋白瘤胃球菌培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基中未有分離株獲得,但在其余3種培養(yǎng)基中均得到了可培養(yǎng)菌株。而部分種屬的微生物只在特定培養(yǎng)基中有所分離:類芽胞桿菌屬和腸球菌屬只在蛋白瘤胃球菌培養(yǎng)基中分離出,分別為1株和2株;氨基酸桿狀菌屬僅在PYG培養(yǎng)基中分離到1株;沉積物桿菌屬只在強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基中分離到2株;醋乳桿菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬和魏斯氏菌屬則僅在MRS培養(yǎng)基中得到一定數(shù)量的分離株。與R2A相比,TSA培養(yǎng)基由于營養(yǎng)成分更豐富,體現(xiàn)出了更優(yōu)良的細(xì)菌分離效果:棒桿菌屬、土壤芽胞桿菌屬、不動桿菌屬、丙酸桿菌屬和埃希氏菌屬均僅在該培養(yǎng)基上得到了分離株。

2.3.2 不同分離生境可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性分析

濃香型白酒窖池的窖泥和酒醅分離得到的124株可培養(yǎng)菌株中,60株來源于窖泥樣品,包括15個屬的29個種:芽胞桿菌屬、梭菌屬、淚珠狀產(chǎn)孢菌、醋乳桿菌屬、氨基酸桿狀菌屬、嗜熱芽胞桿菌屬、棒桿菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、鼠伴菌屬、嗜蛋白菌屬、沉積物桿菌屬、土壤芽胞桿菌屬、鏈球菌屬和魏茨曼氏菌屬。其中分離株數(shù)量占比較大的優(yōu)勢菌種芽胞桿菌屬有5種16株,占窖泥分離株總數(shù)的26.7%;淚珠狀產(chǎn)孢菌屬有4種11株,占窖泥分離株的18.3%;梭菌屬有6種10株,占窖泥分離株的16.7%。除腸球菌屬和乳桿菌屬有2種分離株外,其余10個屬分離的可培養(yǎng)細(xì)菌均僅有1種分離株出現(xiàn),且有4株淚珠狀產(chǎn)孢菌屬疑似新種和1株嗜蛋白菌屬疑似新種,表現(xiàn)出較高的微生物種屬多樣性。

酒醅樣品中共得到18個屬30個種的64株分離株,包括芽胞桿菌屬、梭菌屬、淚珠狀產(chǎn)孢菌、醋乳桿菌屬、氨基酸桿狀菌屬、嗜熱芽胞桿菌屬、乳桿菌屬、鼠伴菌屬、沉積物桿菌屬、土壤芽胞桿菌屬、鏈球菌屬、魏茨曼氏菌屬、不動桿菌屬、埃希氏菌屬、丙酸桿菌屬、類芽胞桿菌屬、互營球菌屬和魏斯氏菌屬。其中菌株數(shù)量較多的優(yōu)勢分離菌種芽胞桿菌屬有6種24株,占酒醅分離株總數(shù)的37.5%;梭菌屬有4種9株,占酒醅分離株的14.1%,鼠伴菌屬有1種6株,占酒醅分離株的9.4%。酒醅樣品中4株乳桿菌屬分離株分屬于4個種,在種類和數(shù)量上較其他非優(yōu)勢分離菌種微生物均呈現(xiàn)出一定的多樣性。其他14個屬的可培養(yǎng)微生物分離株在種和株的數(shù)量上相差不大,同時酒醅樣品分離得到1株芽胞桿菌屬疑似新種、1株類芽胞桿菌屬疑似新種和2株互營球菌屬疑似新種。

比較不同分離生境獲得的可培養(yǎng)細(xì)菌種類和豐度,可以發(fā)現(xiàn)在窖泥和酒醅樣品中分離到的細(xì)菌種屬類型及數(shù)量均有較高的相似性,且2種樣品獲得的分離株中芽胞桿菌屬和梭菌屬均有較高豐度,表明在2個采樣位置的微生物數(shù)量及優(yōu)勢菌種差異較小,與前人研究結(jié)果一致,即在白酒釀造過程中窖泥和酒醅2個發(fā)酵體系之間可以通過黃水實現(xiàn)微生物代謝產(chǎn)物和不同菌種的傳遞和遷移,2個發(fā)酵體系中的微生物在酒體風(fēng)味成分的形成過程中存在一定的協(xié)同效應(yīng)[6-7,20]。其中,分離得到的梭菌屬菌種種類最為豐富,主要包括酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)、科氏梭菌(Clostridiumkluyveri)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、永達(dá)爾氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、柔嫩梭菌(Clostridiumleptum)和酒梭菌(Clostridiumliquoris)等。梭菌屬菌種是窖泥中優(yōu)勢微生物,通常能夠利用底物等有機(jī)物代謝產(chǎn)生己酸、丁酸、乙酸等重要風(fēng)味香味物質(zhì)。分離得到的芽胞桿屬菌種種類也較為豐富,主要包括地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)、副地衣芽胞桿菌(Bacillusparalicheniformis)、貝萊斯芽胞桿菌(Bacillusvelezensis)、卡夫里亞萊斯氏芽胞桿菌(Bacilluscabrialesii)、暹羅芽胞桿菌(Bacillussiamensis)、白色芽胞桿菌(Bacillusalbus)和沙福芽胞桿菌(Bacillussafensis)等。芽胞桿菌具有發(fā)達(dá)的水解酶系統(tǒng),在白酒釀造過程中能夠充分利用底物,產(chǎn)生吡嗪類、丁二醇、3-羥基-2-丁酮、有機(jī)酸等白酒中重要的香味成分。此外,梭菌屬和芽胞桿菌屬菌種的代謝產(chǎn)物還能促進(jìn)窖泥中微生物的相互作用,調(diào)節(jié)窖泥中微生物群落結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響濃香型白酒的香氣成分。但窖泥和酒醅2種樣品的分離株在種屬水平上還是有一定差異:棒桿菌屬、腸球菌屬和嗜蛋白菌屬3個屬的微生物僅在窖泥樣品中分離獲得;而不動桿菌屬、埃希氏菌屬、類芽胞桿菌屬、丙酸桿菌屬、互營球菌屬和魏斯氏菌屬則僅在酒醅樣品中分離到。側(cè)面證實了窖池中2種發(fā)酵體系通過物質(zhì)交換和微生物轉(zhuǎn)移共同決定和影響著濃香型白酒典型風(fēng)味物質(zhì)的形成,以及酒體品質(zhì)的改善提升。

綜合來看,芽胞桿菌屬為濃香型白酒窖池中分離數(shù)量最多的微生物種類,包含8種40株,約占總分離菌株數(shù)的32%;梭菌屬包含9種19株,約占總分離株的15%;淚珠狀產(chǎn)孢菌屬共有4種12株,約占總數(shù)的10%。對于文獻(xiàn)報道較多的乳桿菌屬、鼠伴菌屬、魏茨曼氏菌屬、氨基酸桿狀菌屬及魏斯氏菌屬等在濃香型白酒釀造過程中對白酒中特定風(fēng)味物質(zhì)的形成、維持窖泥微生物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要作用的微生物菌屬也獲得了一定數(shù)量的分離株。如乳桿菌屬分離到4種共6株,鼠伴菌屬和魏茨曼氏菌屬分別有11株和7株。此外,在除TSA和MRS培養(yǎng)基外的其余5種培養(yǎng)基中,共有9株分離株16S rDNA測序結(jié)果顯示與已知分類學(xué)地位模式菌株的16S rDNA序列相似性均低于98.65%[32],為潛在疑似新種,后續(xù)需進(jìn)一步通過全基因組測序等分子生物學(xué)鑒定技術(shù)確定其分類學(xué)地位。

2.4 特征菌種鑒定及生物學(xué)特性分析

濃香型白酒釀造體系中微生物的種類、數(shù)量、種群間的相互作用以及代謝的多樣性對白酒質(zhì)量具有重要影響,是白酒香型和風(fēng)格呈現(xiàn)多樣化的主要原因。梭菌屬和芽胞桿菌屬作為濃香型白酒窖池中的優(yōu)勢微生物類群,在白酒釀造過程中發(fā)揮著重要作用。梭菌多為專性厭氧微生物,在厭氧發(fā)酵狀態(tài)下能合成多種短鏈脂肪酸、醇類等風(fēng)味物質(zhì)。已有大量報道證實白酒窖池中的部分梭菌代謝產(chǎn)物乙酸、己酸、丁酸、正丁醇等是濃香型白酒重要的香氣物質(zhì)前體或本體[33]。此外,在濃香型白酒釀造過程中某些梭菌屬菌株能產(chǎn)生異味物質(zhì)[11],可能會直接影響濃香型白酒的品質(zhì)。芽胞桿菌的種類和數(shù)量直接影響著窖池微生物群落結(jié)構(gòu)和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)合成及酒的風(fēng)格特征。該類菌種能水解淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì),并利用糟醅浸潤到窖泥中的營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生丁酸和己酸等有機(jī)酸,有的菌種還能形成雙乙酰等芳香類物質(zhì),因此是重要的產(chǎn)酸和產(chǎn)香菌[34]。為解析濃香型白酒窖池中功能菌的生物學(xué)特性,確定了6株潛在特征菌種開展系統(tǒng)發(fā)育和生物學(xué)特性分析。

2.4.1 特征菌種系統(tǒng)發(fā)育分析

6株(P1-3、P1-6、P2-1、K1-1、P3-5、R2-2-3)濃香型白酒窖池中可培養(yǎng)特征菌種代表菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,在1 500 bp左右處有明亮單一條帶,滿足測序要求,送擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。將得到的測序結(jié)果通過EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,尋找數(shù)據(jù)庫中與目的基因序列同源性最高的已知分類學(xué)地位的菌種,從而確定目的基因歸屬。

結(jié)果表明菌株P(guān)1-3的16S rDNA序列與1株腸鼠伴菌(Muricomesintestini)的模式菌株序列相似性最高,為99.64%。以海氏梭菌(Clostridiumhylemonae)TN-271T序列為外群構(gòu)建菌株P(guān)1-3與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2-a),結(jié)果顯示通過16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析可將菌株P(guān)1-3鑒定為腸鼠伴菌。菌株P(guān)1-6的16S rDNA序列與酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)的模式菌株序列相似性最高,為100%。以瘤胃解蛋白質(zhì)菌(Proteiniclasticumruminis)D3RC-2T序列為外群構(gòu)建菌株P(guān)1-6與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2-b),結(jié)果顯示通過16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析可將分離株P(guān)1-6鑒定為酪丁酸梭菌。菌株K1-1的16S rDNA序列與2株淚珠狀產(chǎn)孢菌屬(Lacrimisporasp.)的模式菌株序列相似性均高于99%。通過對淚珠狀產(chǎn)孢菌屬菌種功能基因相關(guān)文獻(xiàn)檢索調(diào)研,發(fā)現(xiàn)目前沒有該種屬微生物功能基因相關(guān)文獻(xiàn)報道。以EnteroclosteraldensisRMA 9741T序列為外群構(gòu)建菌株K1-1與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2-c),結(jié)果表明通過16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析可將菌株K1-1鑒定為淚珠狀產(chǎn)孢菌屬。菌株P(guān)2-1的16S rDNA序列與芽胞桿菌屬(Bacillussp.)的6株模式菌株序列相似性均高于99%(圖2-d)。對菌株P(guān)2-1的gyrB基因通過NCBI的BLAST軟件進(jìn)行比對,結(jié)果表明P2-1的gyrB基因序列與地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)的相似性最高,為99.8%。以嗜鹽喜鹽芽胞桿菌(Halobacillushalophilus)DSM 2266T序列為外群構(gòu)建菌株P(guān)2-1與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2-g),gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析表明菌株P(guān)2-1為地衣芽胞桿菌。菌株P(guān)3-5的16S rDNA序列與芽胞桿菌屬(Bacillussp.)的10株模式菌株序列相似性均高于99%(圖2-e)。對菌株P(guān)3-5的gyrB基因通過BLAST軟件進(jìn)行比對,結(jié)果表明P3-5的gyrB基因序列與枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)的相似性最高,為99.3%。以嗜鹽喜鹽芽胞桿菌(Halobacillushalophilus)DSM 2266T序列為外群構(gòu)建菌株P(guān)3-5與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2-h),gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析表明菌株P(guān)3-5為枯草芽胞桿菌。菌株R2-2-3的16S rDNA序列與芽胞桿菌屬(Bacillussp.)的10株模式菌株序列相似性均高于99%(圖2-f)。對菌株R2-2-3的gyrB基因通過BLAST軟件進(jìn)行比對,結(jié)果表明R2-2-3的gyrB基因序列與貝萊斯芽胞桿菌(Bacillusvelezensis)的相似性最高,為98.6%。以嗜鹽喜鹽芽胞桿菌(Halobacillushalophilus)DSM 2266T序列為外群構(gòu)建菌株R2-2-3與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2-i),gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析表明菌株R2-2-3為貝萊斯芽胞桿菌。

圖2 特征菌種系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of the characteristic strains

2.4.2 特征菌種生物學(xué)特征分析

將6株濃香型白酒窖池特征菌種代表菌株接種于相應(yīng)分離培養(yǎng)基上,觀察不同菌株菌落形態(tài)特征(表2)。

表2 特征菌種菌落形態(tài)特征Table 2 Colony morphological characteristics of the characteristic strains

同時對各分離菌株進(jìn)行掃描電鏡觀察,菌體微觀形態(tài)特征如圖3所示。芽胞桿菌屬分離株P(guān)2-1、P3-5和R2-2-3菌體形態(tài)特征為短桿狀,單個或成對排列,部分菌體表面被覆代謝產(chǎn)生的膜,符合芽胞桿菌屬菌株菌體形態(tài)特點;梭菌目菌株P(guān)1-3、P1-6和K1-1菌體形態(tài)特征為桿狀,部分菌體呈梭狀,單個或成對排列。

a-菌株P(guān)1-3;b-菌株P(guān)1-6;c-菌株K1-1;d-菌株P(guān)2-1;e-菌株P(guān)3-5;f-菌株R2-2-3圖3 特征菌種掃描電鏡菌體形態(tài)Fig.3 The scanning electron microscope of the characteristic strains

芽胞桿菌屬分離株P(guān)2-1、P3-5和R2-2-3選用API 50 CHB試劑條進(jìn)行生理生化特性測試,結(jié)果見表3。株菌在對L-山梨糖、L-鼠李糖、D-乳糖、菊糖、D-土倫糖、D-塔格糖和葡萄糖酸鉀利用方面存在一定差異,其他生理生化項結(jié)果則均相同,在營養(yǎng)物質(zhì)利用方面表現(xiàn)出了種屬相似性和一定的菌株差異性。梭菌目厭氧菌株P(guān)1-3、P1-6和K1-1采用API 20A試劑條開展生理生化特性試驗,結(jié)果見表4。3株試驗菌都能水解明膠,菌株K1-1除對色氨酸和脲素為陰性,其他檢測項均呈陽性或弱陽性;菌株P(guān)1-3和P1-6則相反,對試劑條大部分生理生化項都為陰性,推測3株分離菌雖然同屬于厚壁菌門的梭菌目(Clostridiales),但在分類學(xué)水平上是完全不同的菌種,由此導(dǎo)致菌株生理生化特性的差異。

表4 特征菌種生理生化特性(API 20A)Table 4 Physiological and biochemical characteristics of the characteristic strains(API 20A)

3 結(jié)論

本研究利用可培養(yǎng)組學(xué)技術(shù),通過增加培養(yǎng)基種類和采用不同樣品分離條件,對濃香型白酒窖泥和酒醅樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了大量的分離培養(yǎng)及鑒定,同時開展了濃香型白酒釀造過程中特征菌種代表菌種的系統(tǒng)發(fā)育分析及菌株特性研究。通過5種特定的厭氧培養(yǎng)基和2種好氧培養(yǎng)基,從濃香型白酒窖池中共分離得到了來自21個屬44個種的124株細(xì)菌,包括9株潛在細(xì)菌新種。其中,厭氧條件分離得到100株,好氧條件分離得到24株;窖泥樣品分離得到60株,酒醅樣品分離得到64株。芽胞桿菌屬(Bacillussp.)和梭菌屬(Clostridiumsp.)是窖池樣品中分離的優(yōu)勢菌種。比較了不同分離篩選條件和分離生境的可培養(yǎng)細(xì)菌種類和豐度,并解析了6株濃香型白酒窖池潛在功能菌的生物學(xué)特性。本研究為濃香型白酒窖池中潛在新種的挖掘、特征性菌種資源的定向篩選、互作機(jī)制解析、功能性研究開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。