畢赤酵母發(fā)酵耦合多糖酶解一步法制備結(jié)冷膠寡糖

李宏雨,施旭,詹曉北,朱莉,蔣蕓,高敏杰

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

結(jié)冷膠是鞘氨單胞菌產(chǎn)生的一種胞外多糖,它是由→3)-β-D-葡萄糖-(1→4)-β-D-葡萄糖醛酸-(1→4)-β-D-葡萄糖-(1→4)-α-L-鼠李糖-(1→為重復(fù)結(jié)構(gòu)組成的線性陰離子雜多糖[1]。結(jié)冷膠具有良好的安全性、凝膠性、互溶性、穩(wěn)定性等優(yōu)越的性能,不僅在食品領(lǐng)域,還在生物醫(yī)藥、化工、環(huán)境等行業(yè)得到廣泛的應(yīng)用[2-4]。

目前,低聚糖的功能活性已引起廣泛關(guān)注。例如,已有研究報(bào)道了α-1,3-葡寡糖和卡拉膠低聚糖具有抗腫瘤活性[5-6],殼寡糖表現(xiàn)出了植物的抗病性[7]。具有不同結(jié)構(gòu)性質(zhì)的寡糖可能具有不同的生物活性,其中聚合度被認(rèn)為是對(duì)分子功能特性影響最大的參數(shù)之一。特定聚合度寡糖可能具有特定的功能活性,如麥芽七糖可以作為蛋白質(zhì)和細(xì)胞的特異性識(shí)別標(biāo)記[8]。此外,一些寡糖的功能活性與聚合度大小呈現(xiàn)了相關(guān)性,如殼寡糖對(duì)超氧自由基的清除能力也與聚合度大小成正相關(guān)[9]。近年研究者發(fā)現(xiàn)利用酸水解結(jié)冷膠得到的低聚結(jié)冷膠具有植物的抗菌活性[10],并且能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)和改善植物葉片品質(zhì)[11],結(jié)冷膠寡糖也被發(fā)現(xiàn)是一種潛在的益生元[12]。大多數(shù)關(guān)于結(jié)冷膠寡糖的應(yīng)用和生物活性的研究主要是基于混合形式的,因此降解結(jié)冷膠制備特定聚合度結(jié)冷膠寡糖具有重要意義。傳統(tǒng)的低聚糖生產(chǎn)方法多是對(duì)多糖進(jìn)行化學(xué)降解和酶法降解?；瘜W(xué)降解被認(rèn)為是多糖降解的經(jīng)典方法,化學(xué)降解具有操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)[13],但化學(xué)降解對(duì)環(huán)境污染大且得到的產(chǎn)物組分往往比較復(fù)雜,阻礙了后續(xù)的分離純化。酶法降解因?yàn)槠涮禺愋愿叨艿玫骄坏哪繕?biāo)產(chǎn)物,且反應(yīng)溫和得到了越來(lái)越多的關(guān)注。酶法降解可以有效克服化學(xué)降解產(chǎn)物成分復(fù)雜的缺點(diǎn),簡(jiǎn)化特定聚合度結(jié)冷膠寡糖生產(chǎn)的過(guò)程,提高結(jié)冷膠寡糖定向生產(chǎn)的實(shí)用性。

本研究利用前期實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含有結(jié)冷膠裂解酶基因的重組畢赤酵母進(jìn)行外源表達(dá),得到結(jié)冷膠裂解酶,并開(kāi)發(fā)了畢赤酵母發(fā)酵耦合多糖酶解一步法制備單一聚合度結(jié)冷膠寡糖的方法——在結(jié)冷膠裂解酶發(fā)酵初始添加結(jié)冷膠,以達(dá)到生產(chǎn)結(jié)冷膠裂解酶并實(shí)時(shí)降解多糖,實(shí)現(xiàn)一步制備結(jié)冷膠寡糖的目的,并將酶解制備的結(jié)冷膠寡糖與酸解結(jié)冷膠寡糖加以對(duì)比,分別利用傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer, FTIR)與基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)來(lái)解析2種產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)與分子質(zhì)量方面的差異。以期為制備單一聚合度寡糖,進(jìn)一步研究特定聚合度結(jié)冷膠寡糖功能活性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

低?；Y(jié)冷膠(食品級(jí))購(gòu)自江蘇仟泊生物工程有限公司;蛋白胨、酵母粉、甘油和無(wú)水甲醇等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠;3K15型高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Sigma公司; ultrafleXtreme型質(zhì)譜儀,美國(guó)Bruker Daltonics公司;MULTISKAN FC型酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;NEXUS型傅里葉變換紅外光譜儀,美國(guó)Nicolet公司。

1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium, YPD)(g/L):酵母粉 10,蛋白胨 20,葡萄糖 20(固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20)。

甘油緩沖復(fù)合培養(yǎng)基(buffered glycerol-complex medium, BMGY)(g/L):酵母粉 10,蛋白胨 20, YNB 13.4,生物素 4×10-5,甘油 10,K3PO4緩沖液濃度100 mmol/L,pH 6.0。

誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基(buffered methanol-complex medium, BMMY)(g/L):酵母粉 10,蛋白胨 20,YNB 13.4,生物素 4×10-5,甲醇 10 mL/L,K3PO4緩沖液濃度100 mmol/L,pH 6.0。

1.3 搖瓶發(fā)酵方法

將前期實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含有結(jié)冷膠裂解酶基因的重組畢赤酵母劃線接種于YPD平板培養(yǎng)基上,在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置活化60～72 h?；罨Y(jié)束后,挑取單菌落接種至BMGY液體培養(yǎng)基中(裝液量10%,體積分?jǐn)?shù)),30 ℃、200 r/min培養(yǎng)16～18 h至OD600值達(dá)到4～6,得到種子液。4 ℃下無(wú)菌收集種子液菌體接種至BMMY液體培養(yǎng)基(裝液量20%,體積分?jǐn)?shù))中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)3～4 d發(fā)酵結(jié)束,每24 h補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)1.0%的甲醇。

1.4 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

按1.3節(jié)中所述方法獲得種子液。設(shè)置初始發(fā)酵條件:酵母粉添加量20 g/L,甲醇添加量1%,pH 6.0。保持其他條件不變,調(diào)整發(fā)酵初始酵母粉添加量為0、5、10、15、20、25、30、35、40 g/L研究發(fā)酵初始酵母粉添加量對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)、結(jié)冷膠裂解酶酶活力的影響。以同樣的方法研究不同pH(3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5)、不同甲醇添加量(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%,體積分?jǐn)?shù))對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)、結(jié)冷膠裂解酶酶活力的影響,以尋求重組畢赤酵母的最佳發(fā)酵條件。

1.5 畢赤酵母發(fā)酵耦合多糖酶解一步法制備結(jié)冷膠寡糖及條件優(yōu)化

稱取適量結(jié)冷膠添加至BMMY液體培養(yǎng)基中,收集按1.3節(jié)中所述方法獲得的種子液中的菌體接種至添加了結(jié)冷膠的BMMY培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。保持其他條件不變,調(diào)整發(fā)酵初始結(jié)冷膠添加量為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L,研究發(fā)酵初始結(jié)冷膠添加量對(duì)結(jié)冷膠寡糖產(chǎn)量的影響。以初始結(jié)冷膠添加量2%,其他條件不變,研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)結(jié)冷膠寡糖產(chǎn)量的影響。

1.6 酸水解結(jié)冷膠條件優(yōu)化

1.6.1 底物濃度優(yōu)化

分別稱取1、3、5、7 g/L的食品級(jí)低酰基結(jié)冷膠溶于適量蒸餾水中,90 ℃水浴加熱至結(jié)冷膠完全溶解,補(bǔ)加蒸餾水與濃鹽酸至終溶液中HCl濃度為0.5 mol/L。將配制好的水解液置于70 ℃水浴鍋中加熱水解3 h。水解結(jié)束后分別取樣待后續(xù)薄層色譜分析。

1.6.2 HCl濃度優(yōu)化

稱取4份5 g/L的食品級(jí)低?；Y(jié)冷膠溶于適量蒸餾水中,90 ℃水浴加熱至結(jié)冷膠完全溶解,補(bǔ)加蒸餾水與濃鹽酸至終溶液中的HCl濃度分別為0.25、0.5、0.75、1 mol/L。將配制好的水解液置于70 ℃水浴鍋中加熱水解3 h。水解結(jié)束后分別取樣待后續(xù)薄層色譜分析。

1.6.3 水解時(shí)間優(yōu)化

稱取5 g/L的食品級(jí)低?；Y(jié)冷膠溶于適量蒸餾水中,90 ℃水浴加熱至結(jié)冷膠完全溶解,補(bǔ)加蒸餾水與濃鹽酸至終溶液中的HCl濃度為0.5 mol/L。將配制好的水解液置于70 ℃水浴鍋加熱水解6 h,每小時(shí)取樣1次待后續(xù)薄層色譜分析。

1.7 結(jié)冷膠寡糖純化方法

1.7.1 酸解結(jié)冷膠寡糖純化方法

酸水解結(jié)束后加入NaOH將水解液pH調(diào)至7,然后離心除去未水解的懸浮物,上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至水解液體積的1/10,得到濃縮液。在濃縮液中添加6倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉,4 ℃冰箱過(guò)夜后收集上清液繼續(xù)添加4倍濃縮液體積的無(wú)水乙醇,4 ℃冰箱過(guò)夜后收集沉淀。用去離子水復(fù)溶沉淀,將復(fù)溶液體加入100～500 Da的透析袋進(jìn)行透析除鹽。

1.7.2 酶解結(jié)冷膠寡糖純化方法

發(fā)酵降解結(jié)束后的發(fā)酵液離心除去菌體,上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至發(fā)酵液體積的1/10,得到濃縮液后添加7倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉,4 ℃冰箱過(guò)夜后收集上清液繼續(xù)添加3倍濃縮液體積的無(wú)水乙醇,4 ℃冰箱過(guò)夜后收集沉淀。去離子水復(fù)溶沉淀后,通過(guò)Sevage[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1]法除蛋白[V(發(fā)酵液)∶V(Sevage試劑)=4∶1]。除蛋白后通過(guò)C18固相萃取小柱進(jìn)一步除蛋白及色素等其他雜質(zhì)。最后,將除雜后的糖液加入100～500 Da的透析袋進(jìn)行透析除鹽。

C18固相萃取小柱純化方法[14]:用1～2倍柱體積的乙腈對(duì)小柱進(jìn)行活化;用1～2倍體積的去離子水淋洗小柱;上樣,并收集流出液體;用1～2倍體積去離子水淋洗小柱,并收集水洗液。

1.8 分析檢測(cè)方法

1.8.1 還原糖含量測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)比色法。取1 mL稀釋到適當(dāng)濃度的發(fā)酵液,加入1.5 mL DNS試劑,沸水浴加熱5 min,冷卻至室溫加蒸餾水至10 mL,550 nm下測(cè)定吸光度。用蒸餾水代替發(fā)酵液做空白對(duì)照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出吸光度。

1.8.2 酶活力測(cè)定方法

取250 μL酶液與250 μL磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L,pH 6.0)混合,加入500 μL結(jié)冷膠水溶液(0.5 g/L)45 ℃水浴20 min,煮沸10 min終止反應(yīng)。用DNS比色法測(cè)定反應(yīng)體系中的還原糖含量,方法如1.8.1節(jié)所述。酶活力定義:1 min轉(zhuǎn)化底物生成1 μmol還原糖所需的結(jié)冷膠裂解酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.8.3 薄層色譜分析

將制備好的樣品點(diǎn)于薄層板上,點(diǎn)樣量2 μL,晾干后放入裝有展開(kāi)劑的層析缸中將產(chǎn)物進(jìn)行分離。層析完晾干薄層板,均勻噴上顯色劑于105 ℃烘箱顯色5 min。

酸解產(chǎn)物展開(kāi)劑:V(乙酸乙酯)∶V(乙酸)∶V(水)=5∶5∶2;酶解產(chǎn)物展開(kāi)劑:V(正丙醇)∶V(乙酸)∶V(水)=5∶2∶3;顯色劑:900 mg地衣酚,25 mL水,375 mL乙醇,50 mL濃H2SO4。

1.8.4 FTIR分析

稱取制備好的凍干后的結(jié)冷膠寡糖5 mg,使用傅里葉變換紅外光譜儀在波數(shù)4 000～400 cm-1區(qū)間內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.8.5 MALDI-TOF-MS分析

配制1 g/L的寡糖凍干樣品溶液,取1 μL基質(zhì)點(diǎn)于質(zhì)譜預(yù)制靶上,再取1 μL樣品與基質(zhì)混合,真空泵中抽干液體水分待測(cè)量,在m/z400～2 000的質(zhì)量范圍內(nèi)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸水解制備結(jié)冷膠寡糖及其條件優(yōu)化

酸水解多糖是無(wú)規(guī)則降解,所得產(chǎn)物往往組分復(fù)雜[15]。酸濃度、水解時(shí)間、底物濃度均能影響酸水解效果,控制幾個(gè)重要的影響水解效果的因素對(duì)結(jié)冷膠進(jìn)行酸水解以提高產(chǎn)物得率,并將制得的酸解產(chǎn)物與酶解產(chǎn)物進(jìn)行對(duì)比分析。圖1-a是不同底物質(zhì)量濃度對(duì)酸水解效果影響的薄層色譜分析,根據(jù)斑點(diǎn)顏色深淺可大致判斷樣品濃度。各聚合度的寡糖含量隨底物濃度增加而增加,但當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度超過(guò)5 g/L時(shí)變化不再明顯,因此5 g/L是一個(gè)較為合適的底物質(zhì)量濃度。圖1-b是不同HCl濃度對(duì)酸水解效果影響的薄層色譜分析,當(dāng)HCl濃度為0.25 mol/L時(shí),主要產(chǎn)物為聚合度為5和8的寡糖。隨HCl濃度增加,聚合度<5的寡糖逐漸增多,但聚合度>5的寡糖逐漸減少;當(dāng)HCl濃度為0.75 mol/L時(shí),聚合度為8的寡糖在薄層色譜板上幾乎消失。盡管聚合度<5的寡糖隨HCl濃度增加而逐漸增加,但當(dāng)HCl濃度超過(guò)0.5 mol/L時(shí),寡糖聚合度范圍卻在變小,逐漸出現(xiàn)一些單糖和二糖,這與得到更多低聚糖的目標(biāo)不符?？紤]目標(biāo)產(chǎn)物特性,最終選取0.5 mol/L HCl進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 底物質(zhì)量濃度(a)、HCl濃度(b)、水解時(shí)間(c)對(duì)酸的水解效果Fig.1 The effects of substrate concentrations (a), HCl concentrations (b), and hydrolysis time (c) on acid hydrolysis

圖1-c是不同水解時(shí)間對(duì)酸水解效果影響的薄層色譜分析,隨水解時(shí)間的增加,聚合度<5的寡糖逐漸增加,聚合度>5的寡糖逐漸減少;但從4 h開(kāi)始,聚合度>5的寡糖逐漸消失。并且水解時(shí)間越長(zhǎng)產(chǎn)生的單糖和二糖越多,因此選擇水解3 h進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。最終酸水解選擇底物質(zhì)量濃度5 g/L,HCl濃度0.5 mol/L,水解3 h作為適宜水解條件制備結(jié)冷膠寡糖。

2.2 結(jié)冷膠裂解酶發(fā)酵條件優(yōu)化

酶解多糖制備寡糖具有產(chǎn)物專一且溫和的特點(diǎn),本研究是利用前期實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含有結(jié)冷膠裂解酶基因(來(lái)源于Bacillussp.GL1)的重組畢赤酵母進(jìn)行外源表達(dá)得到結(jié)冷膠裂解酶[16]。酶活力對(duì)于寡糖產(chǎn)量至關(guān)重要,酶活力越高則產(chǎn)物產(chǎn)量越高,因此有必要對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。重組結(jié)冷膠裂解酶是在畢赤酵母中以AOX1為啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá),因此在發(fā)酵過(guò)程中是以甲醇為唯一碳源誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。發(fā)酵過(guò)程中氮源、碳源與pH都是微生物生長(zhǎng)過(guò)程中的重要因素[17],因此分別研究了發(fā)酵初始酵母粉添加量、甲醇添加量與發(fā)酵初始pH對(duì)酶活力的影響。由圖2-a可知,在酵母粉添加量為20 g/L時(shí),重組結(jié)冷膠裂解酶酶活力最大;如圖2-b所示,甲醇添加量為1%時(shí),重組結(jié)冷膠裂解酶酶活力最大;從圖2-c可知,pH為6.0時(shí),重組結(jié)冷膠裂解酶酶活力最大。綜上,選擇發(fā)酵初始酵母粉添加量20 g/L,甲醇添加量1%,pH 6.0是重組結(jié)冷膠裂解酶的適宜發(fā)酵條件。

a-酵母粉添加量;b-甲醇添加量;c-pH圖2 結(jié)冷膠裂解酶發(fā)酵條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of fermentation conditions for gellan lyase

2.3 酶解制備結(jié)冷膠寡糖及條件優(yōu)化

傳統(tǒng)的酶降解法是先通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)目標(biāo)酶,然后直接用粗酶液或是將酶分離純化后對(duì)多糖進(jìn)行降解。用粗酶液直接進(jìn)行降解需要先將酶生產(chǎn)出來(lái)再降解多糖,而酶的分離純化因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、易失活等原因往往需要幾種純化技術(shù)聯(lián)用才能夠得到目標(biāo)蛋白[18],降解結(jié)束后還需要一系列的寡糖純化步驟,這樣極大地降低了酶法降解結(jié)冷膠生產(chǎn)結(jié)冷膠寡糖的效率。為了縮短酶法降解的時(shí)間,提高酶法降解效率,提出了畢赤酵母發(fā)酵耦合多糖水解一步法制備結(jié)冷膠寡糖的策略——在結(jié)冷膠裂解酶發(fā)酵初始添加結(jié)冷膠,以達(dá)到生產(chǎn)結(jié)冷膠裂解酶并實(shí)時(shí)降解多糖,實(shí)現(xiàn)一步制備結(jié)冷膠寡糖的目的。為此分別對(duì)發(fā)酵初始結(jié)冷膠添加量與發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,以確定結(jié)冷膠寡糖產(chǎn)量更高的降解條件。圖3-a顯示結(jié)冷膠寡糖隨結(jié)冷膠添加量增加而逐漸增加,當(dāng)結(jié)冷膠添加量>2.0 g/L時(shí),結(jié)冷膠寡糖幾乎不再增加。圖3-b顯示結(jié)果與薄層色譜分析結(jié)果大致相同,隨結(jié)冷膠添加量的增加還原糖產(chǎn)量逐漸增加,但當(dāng)結(jié)冷膠添加量>2.5 g/L時(shí),還原糖產(chǎn)量增加量變少。在優(yōu)化過(guò)程中,觀察到由于結(jié)冷膠在常溫下溶解度不高的原因,當(dāng)結(jié)冷膠添加量>2 g/L時(shí),會(huì)造成發(fā)酵培養(yǎng)基凝結(jié)的問(wèn)題,為了既能夠生成較多的結(jié)冷膠寡糖又不影響結(jié)冷膠裂解酶的生產(chǎn),綜合考慮最終確定發(fā)酵初始添加2.0 g/L的結(jié)冷膠較為合適。

a-薄層色譜分析;b-還原糖產(chǎn)量圖3 不同結(jié)冷膠添加量對(duì)酶降解效果的影響Fig.3 The effect of different gellan gum addition on enzymatic degradation

為進(jìn)一步提高酶法降解的效率,對(duì)發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,圖4-a顯示,結(jié)冷膠寡糖隨時(shí)間增加而逐漸增多。圖4-b可知,還原糖產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間增加而增多,但當(dāng)發(fā)酵96 h后、還原糖產(chǎn)量增速變慢,可能是發(fā)酵后期一些細(xì)胞產(chǎn)生自噬現(xiàn)象[19],限制了甲醇利用效率,導(dǎo)致發(fā)酵后期還原糖產(chǎn)量基本不再增加,最終確定發(fā)酵96 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

a-薄層色譜分析;b-還原糖產(chǎn)量圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶降解效果的影響Fig.4 The effect of fermentation time on enzymatic degradation

2.4 產(chǎn)物分析

a-商品結(jié)冷膠;b-酸水解結(jié)冷膠寡糖;c-酶水解結(jié)冷膠寡糖圖5 降解產(chǎn)物的FTIR譜Fig.5 FTIR spectra of the degradation products

進(jìn)一步通過(guò)MALDI-TOF-MS來(lái)確定2種水解方式得到的寡糖的分子質(zhì)量。如圖6-a所示,在[M-H]-m/z845.12、1 309.45、1 955.67處檢測(cè)到3個(gè)結(jié)冷膠寡糖成分,表明酸水解后得到了聚合度為5、8、12的結(jié)冷膠寡糖。圖6-b是酶解結(jié)冷膠寡糖的質(zhì)譜分析圖,在[M+Na]+m/z669.34處檢測(cè)到一個(gè)結(jié)冷膠寡糖成分,表明酶解后得到了聚合度為4的結(jié)冷膠寡糖,這一結(jié)果正是酶解產(chǎn)物的專一性導(dǎo)致的。因此,酶解法能夠克服酸解法產(chǎn)物組分復(fù)雜的特點(diǎn),成功制備出單一聚合度的結(jié)冷膠寡糖。

a-酸解產(chǎn)物MALDI-TOF-MS分析;b-酶解產(chǎn)物MALDI-TOF-MS分析圖6 降解產(chǎn)物的MALDI-TOF-MS譜圖Fig.6 MALDI-TOF-MS spectrum of the degradation products

3 結(jié)論