基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)探討丹紅注射液治療急性腦梗死的作用機制Δ

毛柳英,李佳怡,馬麗娜,郭媛媛,顧媛媛,何 婷,曹俊嶺(.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院藥學部,北京 00078; .北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院藥學部,北京 00700; 3.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院洛陽醫(yī)院,河南 洛陽 4700)

急性腦梗死(acute cerebral infarction, ACI)在中醫(yī)學中被歸于“中風”范疇,中醫(yī)學認為其是由痰、火(熱)、風、虛和瘀在一定條件下相互影響,相互轉(zhuǎn)化,從而導(dǎo)致內(nèi)風旋動,氣血逆亂,橫竄經(jīng)脈,腦脈閉阻或腦出血則發(fā)中風[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學認為,腦梗死是由腦部動脈血管發(fā)生狹窄或是血栓堵塞引起腦部供血減少或中斷,從而導(dǎo)致腦部組織缺血、缺氧,發(fā)生壞死[2]。ACI發(fā)病速度較快,并且梗死面積不同,是一種致殘率極高的疾病,嚴重威脅患者生命[3]。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示,我國每年有200多萬人突發(fā)ACI,社會經(jīng)濟負擔加重,同時患者個人經(jīng)濟負擔也加重許多[4]。近年來,中醫(yī)藥在治療ACI方面具有較好的療效。丹紅注射液由丹參、紅花2味中藥組成,其功效為活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò),在臨床可被用于治療血小板凝集、血管收縮和腦血液循環(huán)不良等癥[5]。臨床研究結(jié)果表明,丹紅注射液可有效改善患者的臨床癥狀及神經(jīng)功能[6]。雖然丹紅注射液治療ACI具有較好的臨床療效,但其作用機制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學可用于研究藥物、成分、靶點和疾病之間的相互作用,分子對接可用于計算藥物有效成分與疾病靶點之間的結(jié)合能。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法及分子對接技術(shù),研究丹紅注射液治療ACI的可能作用機制,以期為進一步的實驗研究和臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 篩選丹紅注射液潛在有效成分

以丹紅注射液的“丹參”“紅花”2味藥為關(guān)鍵詞,在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)[7](https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索中藥潛在活性化合物與潛在靶點,根據(jù)口服生物利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18為標準[8],篩選出丹參、紅花的潛在活性成分。

1.2 活性成分靶點基因的預(yù)測

通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得丹紅注射液活性成分的SMILES式,輸入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫[9](http://www.swisstargetprediction.ch/)檢索潛在靶點,選擇物種為“Homo sapiens”,條件設(shè)為Probability>0.1,進行丹紅注射液候選活性成分靶點預(yù)測,刪除重復(fù)靶點后,得到丹紅注射液中潛在活性成分的作用靶點。

1.3 獲取疾病相關(guān)靶點

在美國國家生物技術(shù)信息中心官網(wǎng)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的GEO DataSets輸入“Acute cerebral infarction”,“Study type”選擇“Expression profiling by array”,“Top Organisms”選擇“Homo sapiens” ,檢索ACI的表達芯片。在GeneCards數(shù)據(jù)庫[10](https://www.genecards.org/)、人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(OMIM)(https://omim.org/)、DisGeNET疾病數(shù)據(jù)庫[11](https://www.disgenet.org/home/)中以“Acute cerebral infarction”為關(guān)鍵詞篩選與其相關(guān)的疾病靶點,刪除重復(fù)和無效基因名稱后,獲得疾病靶點。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖

將丹紅注射液中的潛在靶點和ACI的相關(guān)疾病靶點一一映射,采用TBtools軟件(版本:1.098 52)繪制韋恩圖,獲得丹紅注射液作用于ACI的潛在作用靶點。將交集基因靶點輸入STRING平臺[12](版本:11.5,https://string-db.org)獲取PPI關(guān)系,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖,以置信度為0.4(medium confidence)為篩選標準,并通過Cytoscape軟件[13](版本:3.7.1,https://cytoscape.org)進行可視化。通過Cytoscape軟件的CytoNCA插件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲計算,并以“Degree”為篩選標準獲得丹紅注射液干預(yù)ACI的排序居前10位的關(guān)鍵靶點。

1.5 富集分析及中藥-活性成分-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

采用R軟件(版本:4.2)對丹紅注射液作用于ACI的核心靶點進行基因本體(GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析,從分子功能(MF)、細胞組分(CC)和生物過程(BP)3個角度得出有關(guān)信號通路及生物進程并進行可視化分析。同時,將獲得的關(guān)鍵通路和核心靶點進行聯(lián)合分析,構(gòu)建中藥-活性成分-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對接

分子對接技術(shù)是基于模擬配體與受體作用(包括靜電作用、氫鍵作用、疏水作用和范德華作用等),預(yù)測蛋白-蛋白或小分子-蛋白間的結(jié)合模式及親和力,從而虛擬篩選藥物靶點及預(yù)測藥效成分。上述獲得的重要信號通路中的關(guān)鍵靶標與丹紅注射液的主要活性成分通過分子對接聯(lián)系。使用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫[14](https://www.rcsb.org/)檢索和下載關(guān)鍵靶蛋白的3 D結(jié)構(gòu)文件,利用PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載活性化合物的3 D結(jié)構(gòu)文件。在對接前,配體和受體需要使能量最小化,刪除受體的水分子(PDB文件),添加極性氫原子,賦予電荷并添加磁場。通過將活性化合物與受體蛋白分子對接,使用AutoDock Vinahe和AutoDock分子對接軟件分別評價與驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學篩選結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 丹紅注射液有效成分篩選和靶點預(yù)測結(jié)果

TCMSP數(shù)據(jù)庫收集丹參、紅花的潛在活性化合物共391種,以藥動學參數(shù)OB≥30%且DL≥0.18為標準篩選出有效成分77種。通過PubChem和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測丹紅注射液潛在活性化合物靶點,Probability>0.1的潛在靶點共3 298個,去重后共篩選得到709個。

2.2 丹紅注射液治療ACI的疾病靶點

通過GEO數(shù)據(jù)庫檢索ACI患者基因芯片數(shù)據(jù)集,獲得腦組織來源基因芯片GSE102541的基因數(shù)為125 670個。采用GEO2R分析差異基因,創(chuàng)建ACI組與NORMAL組,通過logFC>1或logFC<-1,P<0.05的標準篩選,分別獲得下調(diào)基因4 034個,上調(diào)基因403個,去重后共獲得差異基因3 466個。

在GeneCards、OMIM和DisGeNET疾病數(shù)據(jù)庫檢索“Acute cerebral infarction”,分別獲得疾病靶點3 619、239和687個,在GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選“Relevance score>5”的靶點1 748個,在DisGeNET數(shù)據(jù)庫篩選“Score≥0.1”的靶點687個。將上述3個數(shù)據(jù)庫篩選的靶點去重后獲得ACI靶點2 102個。

將丹紅注射液活性成分靶點和ACI疾病相關(guān)靶點取交集后,得到丹紅注射液作用于ACI的潛在靶基因34個。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵靶點的篩選

將共同靶點輸入STRING數(shù)據(jù)平臺,構(gòu)建丹紅注射液治療ACI的關(guān)鍵蛋白靶點PPI網(wǎng)絡(luò),見圖1。該網(wǎng)絡(luò)含有共有作用靶點34個節(jié)點,平均節(jié)點度3.06,共有靶點彼此之間的關(guān)聯(lián)有20條邊,平均局部聚類系數(shù)為0.424,PPI富集P值<9.92×10-10。

圖1 丹紅注射液治療ACI的關(guān)鍵蛋白靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 PPI network of key protein target of Danhong injection in the treatment of ACI

Cytoscape軟件網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)計算結(jié)果顯示,連接度排序居前10位的基因包括下調(diào)基因CXCL8、ITGB1、KDR、ACE、CYP3A4和PDGFRB與上調(diào)基因KCNH2、FLT1、TBXA2R和HPGDS,可能是丹紅注射液治療ACI的重要潛在靶點,見圖2。

圓圈越大,連接度越大;紫色為上調(diào)基因,綠色為下調(diào)基因。The larger the circle, the greater the connection; purple is up-regulated gene, green is down-regulated gene.圖2 丹紅注射液治療ACI的關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 PPI network of key target of Danhong injection in the treatment of ACI

2.4 GO及KEGG富集分析

圖3為GO富集分析顯著性排序為前30的結(jié)果,BP顯著富集于管徑調(diào)節(jié)、血管直徑維持、血管張弛、血管直徑收縮、調(diào)節(jié)血液循環(huán)、離子傳輸?shù)恼蛘{(diào)節(jié)、平滑肌收縮、血管收縮的調(diào)節(jié)、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)的積極調(diào)節(jié)及肌肉收縮等;CC顯著富集于膜筏、膜微域、小凹、突觸膜、質(zhì)膜筏、突觸后膜、整合素α7-β1復(fù)合物、整合素α1-β1復(fù)合物、整合素α3-β1復(fù)合物及整合素α5-β1復(fù)合物等;MF顯著富集于跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、血管內(nèi)皮生長因子結(jié)合、氧結(jié)合、血管內(nèi)皮生長因子受體活性、生長因子結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、血紅素結(jié)合及絲氨酸型外切肽酶活性等。

圖3 GO富集分析Fig 3 GO enrichment analysis

KEGG富集分析顯著性排序為前15位的主要通路包括血管平滑肌收縮信號通路、腎素分泌信號通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)信號通路、肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)信號通路、拉斯信號通路、Ras相關(guān)蛋白1(Ras1)信號通路、血小板活化信號通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路、百日咳信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路、黏著信號通路、血紅素結(jié)合信號通路、環(huán)鳥苷單磷酸蛋白激酶G信號通路、鈣通道信號通路和花生四烯酸代謝信號通路等,見圖4。

圖4 KEGG富集分析Fig 4 KEGG enrichment analysis

2.5 構(gòu)建中藥-活性成分-疾病-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

將丹紅注射液治療ACI的藥物活性成分、關(guān)鍵靶點及關(guān)鍵通路進行聯(lián)合分析,采用Cytoscape軟件構(gòu)建丹紅注射液治療ACI的中藥-活性成分-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)圖,見圖5。可見,丹紅注射液的23種藥物活性成分通過4個關(guān)鍵靶點(CXCL8、ITGB1、ACE和KDR)及10個關(guān)鍵信號通路(腎素分泌信號通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)信號通路、拉斯信號通路、Rap1信號通路、PI3K-Akt信號通路、黏著信號通路、鈣通道信號通路、肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)信號通路、血小板活化信號通路和百日咳信號通路)治療ACI。

橙色為中藥,紅色為中藥活性成分,藍色為關(guān)鍵靶點,綠色為 ACI 的關(guān)鍵信號通路,紫色為疾病。Orange indicates traditional Chinese medicine, red indicates the active components of traditional Chinese medicine, blue indicates the key target, green indicates the key signal pathway of ACI, purple indicates disease.圖5 丹紅注射液治療ACI的中藥-活性成分-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig 5 Network of traditional Chinese medicine-active component-target-pathway-disease of Danhong injection in the treatment of ACI

2.6 分子對接

將ITGB1、KDR與丹紅注射液的藥物活性成分進行分子對接,以篩選丹紅注射液與ITGB1、KDR結(jié)合能力最強的化合物。結(jié)果顯示,丹紅注射液中與ITGB1、KDR具有一定的結(jié)合活性的有效成分分別有1種、18種,見表1。其中,ITGB1與丹參新酮的結(jié)合能最小,結(jié)合能力最強;KDR與去氫丹參酮ⅡA的結(jié)合能最小,結(jié)合能力最強,見圖6—7。因此,丹參新酮、去氫丹參酮ⅡA可能是丹紅注射液治療ACI的潛在活性化合物。

表1 丹紅注射液有效成分與靶點的分子對接結(jié)合能Tab 1 Binding energy of mlecular docking between active components of Danhong injection and target

圖6 ITGB1與丹參新酮分子對接示意圖Fig 6 Schematic diagram of molecular docking between ITGB1 and miltirone Ⅱ

圖7 KDR與去氫丹參酮ⅡA分子對接示意圖Fig 7 Schematic diagram of molecular docking between KDR and dehydrotanshinone ⅡA

3 討論

丹紅注射液是常見的中藥注射劑,是經(jīng)典的活血化瘀方[15]。該藥主要是由中藥丹參和紅花加工提取而成的復(fù)方注射劑,其中,丹參為君藥,主沉降;紅花為臣藥,主升浮;兩藥相須使用,具有活血化瘀、溫經(jīng)舒脈的功效[16]。藥理學研究結(jié)果表明,丹紅注射液具有抗炎、抗氧化、抗凝、促血管新生和改善微循環(huán)等作用。雖然丹紅注射液治療ACI的臨床療效顯著,但目前對該藥藥效機制的認識尚存在諸多空白,制約其科學應(yīng)用于臨床及現(xiàn)代化發(fā)展。本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學為基礎(chǔ),系統(tǒng)闡釋丹紅注射液調(diào)控的關(guān)鍵靶點和特征通路,構(gòu)建活性成分-關(guān)鍵靶點-特征通路的整體網(wǎng)絡(luò),同時采用分子對接技術(shù)綜合分析丹紅注射液作用于ACI的有效成分、作用靶點和分子機制,有利于闡明復(fù)方整體配伍的科學內(nèi)涵及指導(dǎo)該藥臨床合理應(yīng)用。

本研究篩選出丹紅注射液的有效成分共77種,治療ACI的潛在靶點共34個。其中CXCL8、ITGB1、ACE和KDR為關(guān)鍵靶點,其多數(shù)與免疫反應(yīng)有關(guān),可能是治療ACI的潛在生物標志物和藥物作用靶點。CXCL8可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),免疫系統(tǒng)在腦梗死過程中起著非常重要的作用,針對免疫系統(tǒng)的治療能有助于減少腦神經(jīng)損傷量[17]。CXCL8作為趨化因子也可參與到炎癥反應(yīng)調(diào)控中,腦缺血發(fā)生后會出現(xiàn)急性和長期的炎癥反應(yīng),丹紅注射液可通過調(diào)控CXCL8等趨化因子和促炎細胞因子的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),以減輕神經(jīng)損傷、保護神經(jīng)修復(fù)[18]。ITGB1受體是Treg細胞和小膠質(zhì)細胞之間相互作用的媒介,且是ACI發(fā)生后少突膠質(zhì)細胞再生的一個關(guān)鍵促進劑[19]。有研究結(jié)果顯示,ACE I/D位點顯著增加出血型和梗死型腦卒中的發(fā)病風險,ACE A-240T位點顯著增加梗死型腦卒中發(fā)病風險[20]。KDR是內(nèi)皮祖細胞(EPCs)的表面標志物,EPCs的數(shù)量和功能是反映血管內(nèi)皮功能的一項新的標志物,在ACI發(fā)病期注射EPCs能明顯改善腦組織缺血,減輕不良臨床結(jié)局[21]。

KEGG富集分析結(jié)果顯示,丹紅注射液治療ACI的重要通路包括腎素分泌信號通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)信號通道、PI3K-Akt信號通路、黏著信號通道、鈣通道信號通路、肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)信號通路、血小板活化信號通道等,與跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、血管內(nèi)皮生長因子結(jié)合、氧結(jié)合、血管內(nèi)皮生長因子受體活性、血紅素結(jié)合和絲氨酸型外切肽酶活性等生物功能及分子功能相關(guān)。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)是人體內(nèi)重要的內(nèi)分泌系統(tǒng),包含腎素、血管緊張素Ⅱ和醛固酮等多種生物活性成分,ACI患者體內(nèi)的相關(guān)成分明顯升高,腎素-血管緊張素系統(tǒng)的過度激活可刺激腦血管收縮、增加血管阻力,減少腦組織灌注,同時能夠破壞血腦屏障,誘發(fā)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,進一步加重腦組織的缺血性損害[22]。丹紅注射液可能是通過抑制腎素、血管緊張素Ⅱ和醛固酮等多種生物活性成分的分泌,進而減少對腦血管的刺激,降低血管阻力,增加腦組織灌注,保護血腦屏障,避免誘發(fā)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng),從而達到治療腦梗死的作用。

綜上所述,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學與分子對接技術(shù)分析丹紅注射液治療ACI的潛在靶點及作用機制,發(fā)現(xiàn)丹紅注射液治療ACI可能的核心活性化合物為丹參新酮和去氫丹參酮ⅡA,潛在關(guān)鍵靶點為CXCL8、ITGB1、ACE和KDR,關(guān)鍵信號通路包括腎素-血管緊張素系統(tǒng)、Rap1和PI3K-Akt等信號通路。丹紅注射液通過多組分、多靶點、多通路協(xié)同機制干預(yù)疾病分子機制復(fù)雜的ACI,是臨床上治療ACI的重要藥物。值得注意的是,本研究存在一定的局限性:(1)通過在線數(shù)據(jù)庫檢索化合物和靶點,難免存在不足,如果數(shù)據(jù)庫更新,將可能對現(xiàn)有分析結(jié)果產(chǎn)生影響;(2)網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測的結(jié)果缺乏實驗研究驗證,難以為丹紅注射液的應(yīng)用提供更準確的數(shù)據(jù)支持。后續(xù)需在網(wǎng)絡(luò)藥理學研究的基礎(chǔ)上,開展動物和細胞實驗驗證結(jié)果,并根據(jù)上市后的反饋對丹紅注射液進行再評價。