基于生物信息學(xué)聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討四神丸治療糖尿病腎病的作用機(jī)制Δ

鄧媛媛,馬 鈺,張 賽,李 娜,,董 奧,,李紅典,,陳 澍,張勉之,3#(.北京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,北京 0009; .北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院腎病科,北京 00078; 3.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院腎病科,天津 3000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一[1-2]。在我國(guó),DN是慢性腎臟病住院治療的首要病因[3]。此外,針對(duì)DN的標(biāo)準(zhǔn)化治療如嚴(yán)格控制血糖和血壓等已被證明并不能有效阻止DN的進(jìn)展[4]。因此,臨床上迫切需要探索新的安全、有效的治療方案。四神丸由補(bǔ)骨脂、肉豆蔻、吳茱萸、五味子、大棗和生姜組成,為中醫(yī)經(jīng)典方劑,具有補(bǔ)腎滋腎、健脾安中的功效,在臨床上被用于治療腸道疾病、慢性腎臟病等。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與生物信息學(xué)能夠從整體角度系統(tǒng)把握“藥物-疾病”之間多元性、多向性的作用關(guān)系[5-6]。基于此,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合生物信息學(xué)交互構(gòu)建“四神丸-靶點(diǎn)-DN”的多元靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),為四神丸治療DN的療效提供了新的多維視角,并為進(jìn)一步臨床精準(zhǔn)用藥提供了科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 四神丸活性成分和靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)[7](https://tcmsp-e.com/)、中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)庫(kù)(BATMAN-TCM)[8](http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)檢索關(guān)鍵詞“補(bǔ)骨脂”“肉豆蔻”“吳茱萸”“五味子”“大棗”和“生姜”。其中TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選標(biāo)準(zhǔn)定義為:口服生物利用度(OB)>30%,類藥性(DL)>0.18;BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)篩選設(shè)置“藥物-基因”間相似性得分Score cutoff≥20,AdjustedP-value<0.05。采用Swiss Target Prediction[9](http://swisstargetprediction.ch/)、STITCH[10](http://stitch.embl.de)和ChEMBL[11]數(shù)據(jù)庫(kù)檢索四神丸成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息,通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)[12](https://www.uniprot.org/)將對(duì)應(yīng)的蛋白名稱轉(zhuǎn)換成人類基因名,獲取四神丸最終的作用靶點(diǎn)基因。

1.2 DN疾病靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

在基因疾病關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)(DisGeNET,https://www.disgenet.org)、人類孟德?tīng)栠z傳綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM,http://www.omim.org)、人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards)[13](https://www.genecards.org)和比較毒物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(CTD)[14](http://ctd.mdibl.org/)中檢索關(guān)鍵詞“Diabetic nephropathy”,篩選疾病的靶基因。

在基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)[15](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO/)下載編號(hào)GSE30528(GPL571)、GSE1009(GPL570)、GSE96804(GPL17586)、GSE47183(GPL11680)和GSE47183(GPL14663)(OrganiSSWs: Homosapiens)的基因芯片數(shù)據(jù)原始文件?；赗語(yǔ)言編程“l(fā)imma”軟件包[16]對(duì)基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,以|log2(foldchange)|>1 andP-value < 0.05∣作為篩選條件,默認(rèn)參數(shù)設(shè)置以識(shí)別顯著差異表達(dá)基因(DEGs)。對(duì)4組基因文件進(jìn)行集成,并保存上調(diào)和下調(diào)的DEGs。然后,用R軟件包Robust Rank Aggreg[17](https://cran.rstudio.com/bin/windows/contrib//3.5/Robur Rank Aggreg1.1.zip)對(duì)所有的DEGs進(jìn)行整合和排名以進(jìn)一步確定穩(wěn)健DEGs。利用pheatmap包分別根據(jù)P值排序居前20位的上調(diào)和下調(diào)的DEGs進(jìn)行可視化獲得差異基因熱圖。將DEGs與DN已知的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行整合,得到DN的完整靶點(diǎn)。

1.3 四神丸治療DN潛在靶點(diǎn)的獲取

將篩選的成分靶點(diǎn)和DN疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Draw Venny Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制韋恩圖,獲得兩者的交集基因,該交集靶點(diǎn)為四神丸治療DN的復(fù)合靶點(diǎn)。用Cytoscape 3.7.2軟件繪制成分-靶點(diǎn)關(guān)系圖。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)

將復(fù)合靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)[18],Cytoscape構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖并刪除孤立節(jié)點(diǎn)。度值(Degree)參數(shù)表示與節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)的邊數(shù)。繼續(xù)利用MCODE插件對(duì)復(fù)合靶點(diǎn)進(jìn)行密度聚類分析,篩選網(wǎng)絡(luò)中核心節(jié)點(diǎn)和簇(cluster)。cluster的篩選標(biāo)準(zhǔn)如下:Degree Cutoff≥2;Node Score Cutoff=0.2;K-core≥2;Max Depth=100。將PPI得到的核心基因與MCODE得到的得分最高的功能模塊取交集,得到PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因。

1.5 富集分析

使用R軟件,同時(shí)在Bioconductor在線網(wǎng)站(https://www.bioconductor.org/)下載org.Hs.eg.db、colorspace、stringi、DOSE、clusterProfile、pathview、ggplot2和limma等程序包,對(duì)復(fù)合靶點(diǎn)進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換及基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析(校正P<0.05)。GO和KEGG分別選擇校正P值(P<0.05)同時(shí)將結(jié)果升序排列,挑選前20個(gè)條目進(jìn)行可視化。

1.6 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

采用Cytoscape構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.7 分子對(duì)接

分子對(duì)接被用來(lái)驗(yàn)證生物活性成分干擾DN疾病潛在靶點(diǎn)發(fā)生相互作用的可能性[19]。在RCSB(https://www1.rcsb.org/)下載核心基因(成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)中度值排序居前5位的核心靶標(biāo))的結(jié)構(gòu),如胰島素基因(JUN,PDB ID:4IZY)、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶(PTGS2PDB ID:1PXX)、腫瘤壞死因子(TNF,PDB ID:7JRA)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β,PDB ID:5R8Q)和蛋白激酶B(Akt,PDB ID:3O96)。通過(guò)Chemicalbook(https://www. chemicalbook.com)和 Pubchem(https://pubchem. ncbi.nlm.nih.gov/)下載主要活性成分,包括油酸(OLEIC ACID,Pubchem ID:445639)、亞油酸(LINOLEIC ACID,Pubchem ID:5280450)、二氫依沃卡平1-甲基-2-十五烷基-4(1 h)-喹啉酮和依沃二酰胺[DIHYDROEVOCARPINE1-METHYL-2-PENTADECYL-4(1 H)-QUINOLONE和EVODI-AMIDE,Pubchem ID:5319753]、二氫吳茱萸卡品堿(DIHYDROEVOCARPINE,Pubchem ID: 5322031)、吳茱萸酰胺(EVODIAMIDE,Pubchem ID:189454)的結(jié)構(gòu)(成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)中度值排序居前5位的生物活性成分)。利用Syby-X軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行去水分子、去金屬離子等操作,利用AutoDock軟件將化合物及核心蛋白基因pdb格式轉(zhuǎn)為pdbqt格式并尋找活性口袋,運(yùn)行Vina進(jìn)行對(duì)接。以結(jié)合能的具體數(shù)值來(lái)評(píng)估目標(biāo)蛋白和活性成分的親和力。

2 結(jié)果

2.1 四神丸中活性成分與靶點(diǎn)的篩選

從TCMSP、BATMAN-TCM平臺(tái),去除重復(fù)值后,得到121個(gè)符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的四神丸的生物活性化合物。接著獲取成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn),保留唯一值后獲得四神丸全部的成分靶點(diǎn)542個(gè)。

2.2 DN疾病靶點(diǎn)

通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的GSE30528(GPL571)、GSE1009(GPL570)、GSE96804(GPL17586)、GSE47183(GPL11680)和GSE47183(GPL14663),用RRA包對(duì)5個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行整合分析,共確定了82個(gè)穩(wěn)健的DEGs,其中上調(diào)的46個(gè),下調(diào)的36個(gè)。圖1為P值排序居前20位上調(diào)和下調(diào)穩(wěn)健DEGs的熱圖。結(jié)合GeneCards(3 236)、OMIM(67)、DisGenet(206)和CTD(241)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得DN的完整的作用靶點(diǎn),去除重復(fù)值后,收集到3 832個(gè)DN主要作用靶點(diǎn)。

綠色表示下調(diào)的穩(wěn)健DEG,紅色表示上調(diào)的穩(wěn)健DEG;框中的值是根據(jù)DEG的log2FC值。Green indicates a downward-adjusted robust DEG, red indicates an upward-adjusted robust DEG; the value in the box is the log2FC value based on DEG.圖1 前20個(gè)上調(diào)和下調(diào)穩(wěn)健 DEGs的熱圖Fig 1 Heat maps of the first 20 robust DEGs upward and downward

2.3 復(fù)合靶點(diǎn)

四神丸和DN的交集靶點(diǎn)/復(fù)合靶點(diǎn)共195個(gè),見(jiàn)圖2。

圖2 四神丸與DN交集靶點(diǎn)的韋恩圖Fig 2 Venn diagram of the intersecting targets of Sishen Wan and DN

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將195個(gè)四神丸成分-DN相關(guān)靶點(diǎn)的復(fù)合靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)。采用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖3),得到195個(gè)節(jié)點(diǎn),1 271條邊。PPI拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示,度值排序居前10位的靶基因:胰島素基因(INS)、蛋白激酶B1(Akt1)、腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARG)、原癌基因(JUN)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB1)、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶(PTGS2)和雌激素受體1(ESR1)。利用Cytoscape 3.7.2軟件中MCODE插件篩選出5個(gè)模塊,確定得分最高的核心模塊cluster 1,其由24個(gè)節(jié)點(diǎn)、176條邊組成(見(jiàn)圖3),四神丸有效成分作用的核心靶點(diǎn)群(包括TNF、Akt1、JUN、ESR1和PPARG等靶點(diǎn))Score為15.304,集群得分代表節(jié)點(diǎn)和拓?fù)湎噜徆?jié)點(diǎn)的核心密度;得分越高代表集群越集中,表明四神丸可能通過(guò)與DN靶點(diǎn)的多靶點(diǎn)協(xié)同機(jī)制發(fā)揮作用。將度值排序居前10位的基因與cluster 1的基因取交集,得到最終的核心靶基因:PTGS2、CREB1、ESR1、TNF、IL-1β、INS、Akt1、PPARG和JUN。

A.靶蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖;B—F.PPI的聚類分析。A. PPI network map of target protein; B-F. cluster analysis of PPI.圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network diagram

2.5 富集分析

將復(fù)合靶點(diǎn)上傳至DAVID平臺(tái),根據(jù)調(diào)整P<0.05篩選顯著性條目,共得到1 578個(gè)GO條目,其中獲得的生物學(xué)過(guò)程(BP)、細(xì)胞組成(CC)和分子功能(MF)條目分別為1 476、16和86條。根據(jù)調(diào)整P值將前10條GO條目進(jìn)行可視化展示,見(jiàn)圖4。由圖4可知,復(fù)合靶點(diǎn)主要富集在積極調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝過(guò)程、積極調(diào)節(jié)氧化還原酶活性、調(diào)節(jié)氧化還原酶活性等過(guò)程;MF主要涉及核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、轉(zhuǎn)錄輔激活因子結(jié)合、類固醇結(jié)合和轉(zhuǎn)錄輔因子結(jié)合;CC表明,大多數(shù)靶點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、RNA 聚合酶 II 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、PlaSSWa 膜外側(cè)、核超染色質(zhì)和超染色質(zhì)有關(guān)。已篩選出前10條常見(jiàn)的KEGG途徑(見(jiàn)圖5),四神丸-DN潛在靶點(diǎn)涉及的信號(hào)通路包括晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-AGE受體(RAGE)信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路和破骨細(xì)胞分化流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化等。

圖4 四神丸治療DN的GO分析Fig 4 GO analysis of Sishen Wan in the treatment of DN

圖5 KEGG富集分析的雙軸圖Fig 5 Biaxial plot of KEGG enrichment analysis

2.6 成分-靶點(diǎn)-通路

在成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)中,JUN、PTGS2、TNF、IL-1β和Akt1為度值排序居前5位的核心節(jié)點(diǎn),度值排序居前5位的化合物為油酸(OLEIC ACID)、亞油酸(LINOLEIC ACID)、二氫依沃卡平1-甲基-2-十五烷基-4(1 h)-喹啉酮和依沃二酰胺[DIHYDROEVOCARPINE1-METHYL-2-PENTADECYL-4(1 H)-QUINOLONE和EVODIAMIDE]、二氫吳茱萸卡品堿(DIHYDROEVOCARPINE)和吳茱萸酰胺(EVODIAMIDE),與多個(gè)節(jié)點(diǎn)產(chǎn)生聯(lián)系。此外,TNF信號(hào)通路是網(wǎng)絡(luò)中度值最高的通路,表明四神丸可能通過(guò)TNF信號(hào)通路發(fā)揮治療作用。同時(shí),結(jié)合圖6可知,四神丸治療DN是基于“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的交互方式實(shí)現(xiàn)的,而不是僅依靠單一組分或單一靶點(diǎn)或單一通路發(fā)揮作用。TNF通路展示見(jiàn)圖7。

圖6 成分-靶點(diǎn)-通路圖Fig 6 Component-target-pathway diagram

紅色是DN的潛在靶蛋白,綠色是TNF通路的相關(guān)靶點(diǎn)。Red is the potential target protein for DN, green is the relevant target of TNF pathway.圖7 DN的潛在靶蛋白在TNF預(yù)測(cè)通路上調(diào)節(jié)DNFig 7 Potential target proteins for DN regulate DN in the TNF prediction pathway

2.7 分子對(duì)接

主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)合能見(jiàn)表1。結(jié)合能<0 kJ/mol表示配體分子可以自發(fā)結(jié)合受體蛋白,而結(jié)合能≤-20 kJ/mol表明配體分子具有理想的結(jié)合力,說(shuō)明結(jié)合緊密,證實(shí)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。JUN、PTGS2、TNF、IL-1β和Akt1被普遍認(rèn)為是DN的經(jīng)典治療靶點(diǎn)。由表1可見(jiàn),結(jié)合對(duì)的結(jié)合能均<-20 kJ/mol,表明活性化合物對(duì)前5個(gè)靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合親和力。

表1 主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)合能(kJ/mol)Tab 1 Binding energy of main active component and key target molecule(kJ/mol)

3 討論

糖尿病腎病以微量白蛋白的產(chǎn)生和腎功能進(jìn)行性下降為特點(diǎn),且損傷不可逆。四神丸始于宋代陳文中所著《陳氏小兒痘疹方論》。國(guó)醫(yī)大師張大寧教授認(rèn)為,腎陽(yáng)虧虛,脾陽(yáng)失溫,先后天俱虧是DN病機(jī)變化的基本特點(diǎn)之一[19]。因此,四神丸治療DN取其“補(bǔ)益脾腎、溫陽(yáng)固腎”的功效,契合DN的核心病機(jī)。此外,四神丸具有“多靶點(diǎn)、多功能、多靶點(diǎn)和多通路”的作用特點(diǎn),與DN“多誘因、多病位、多路徑和多機(jī)制”的致病特點(diǎn)相契合?；诖?本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與生物信息學(xué)深入探索了中藥復(fù)方四神丸對(duì)DN的潛在分子機(jī)制。

在PPI網(wǎng)絡(luò)中,INS、Akt1、TNF、IL-1β、PPARG、JUN、CREB1、PTGS2和ESR1被確認(rèn)為四神丸治療DN的核心靶標(biāo)。Akt1隸屬Akt家族,主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、生存和代謝。Akt1通過(guò)參與葡萄糖儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程來(lái)促進(jìn)血清葡萄糖的穩(wěn)態(tài),介導(dǎo)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),阻止胰島素受體去磷酸化[20]。其在糖尿病中的代謝過(guò)程中占據(jù)重要地位。此外,Akt1可激活PI3K-Akt信號(hào)通路并控制基本的細(xì)胞代謝過(guò)程,破壞足細(xì)胞,對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥具有重大影響[21]。研究結(jié)果指出,靶向治療PI3K-Akt信號(hào)可能是未來(lái)DN治療的重要策略[22]。TNF能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。在血糖高負(fù)荷狀態(tài)下,TNF過(guò)度活躍,其可以介導(dǎo)其他炎癥因子的釋放,加重腎功能損傷[23-24]。上述結(jié)論進(jìn)一步證實(shí)了四神丸治療DN核心靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性。

本研究采用GO富集分析法探索整體蛋白質(zhì)的分布,把握整體蛋白質(zhì)與生物學(xué)功能的相關(guān)性。結(jié)果表明,常見(jiàn)的蛋白質(zhì)靶標(biāo)具有多種生物學(xué)功能,包括核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性的分子功能。KEGG途徑富集分析晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-AGE受體(RAGE)信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等能夠確定關(guān)鍵蛋白質(zhì)參與的重要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。AGE-RAGE信號(hào)通路為四神丸調(diào)控DN治療效果的主要途徑。在病理學(xué)層面,先天免疫、慢性炎癥和氧化應(yīng)激是DN發(fā)生、發(fā)展的主要機(jī)制[25]。AGE-RAGE信號(hào)通路的激活可能加重DN中的氧化應(yīng)激和慢性炎癥[26]。此外,RAG過(guò)度活躍,可導(dǎo)致多條信號(hào)通路的激活,如PI3K-Akt、MAPK-ERK和NF-κB[27]。靶向治療AGE-RAGE通路已被證明可以明顯改善DN的進(jìn)展[28]。這些關(guān)鍵蛋白、生物學(xué)功能和信號(hào)通路共同揭示了四神丸對(duì)DN的治療機(jī)制。

在成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)中,油酸、亞油酸、二氫依沃卡平1-甲基-2-十五烷基-4(1 h)-喹啉酮和依沃二酰胺、二氫吳茱萸卡品堿、吳茱萸酰胺被確定為與大多數(shù)潛在靶點(diǎn)相關(guān)的主要的生物活性成分。分子對(duì)接結(jié)果也驗(yàn)證了上述成分與大多數(shù)靶基因具有穩(wěn)定的結(jié)合特性,它們被認(rèn)為是四神丸治療DN的關(guān)鍵成分。且臨床研究結(jié)果顯示,四神丸治療慢性腎臟病的臨床療效顯著,能夠明顯改善患者腎性血尿癥狀[28]。油酸來(lái)源于自然界,以甘油酯的形式存在于動(dòng)植物油脂中。據(jù)報(bào)道,油酸對(duì)軟化血管有一定效用。有研究指出,硝基油酸和氯沙坦通過(guò)抑制db/db小鼠腎臟NADPH氧化酶系統(tǒng),抑制氧化應(yīng)激,從而發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用[29]。文獻(xiàn)報(bào)道,亞油酸能夠降低血液膽固醇水平,預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化。有研究結(jié)果表明,高亞油酸飲食被認(rèn)為是減輕糖尿病并發(fā)癥的重要飲食結(jié)構(gòu)[30];研究結(jié)果顯示,亞油酸飲食可降低DN模型的血漿脂質(zhì),并通過(guò)血小板和腎皮層抑制類二十烷酸的合成,改善DN模型[31]?？傊?四神丸是一種具有多靶點(diǎn)治療作用的中藥復(fù)方。應(yīng)對(duì)上述活性化合物與DN之間的聯(lián)系進(jìn)行更深入的研究。

本研究中,油酸、亞油酸、二氫吳茱萸卡品堿、吳茱萸酰胺等被確定為四神丸的主要活性成分,JUN、PTGS2、TNF、IL-1β和Akt1為核心靶標(biāo);分子對(duì)接結(jié)果表明,四神丸的主要活性成分與核心靶標(biāo)表現(xiàn)出良好的結(jié)合作用;AGE-RAGE信號(hào)通路是治療DN的關(guān)鍵通路。本研究揭示了四神丸對(duì)DN的潛在藥理作用機(jī)制,可為臨床應(yīng)用提供參考。