基于大麻素2型受體和雌激素受體α研究升麻和黑升麻含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響

趙子慧，胡思婧，陳高策，葉欣園，劉 燕，張泉龍，徐金龍，秦路平，韓 婷，張巧艷,

? 藥理與臨床 ?

基于大麻素2型受體和雌激素受體α研究升麻和黑升麻含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響

趙子慧1，胡思婧1，陳高策1，葉欣園1，劉 燕1，張泉龍1，徐金龍2，秦路平1，韓 婷3*，張巧艷1, 3*

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053 2. 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六九醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051 3. 中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433

研究升麻和黑升麻含藥血清基于大麻素2型受體（cannabinoid receptor type 2，CB2R）與雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）對(duì)成骨細(xì)胞骨形成的調(diào)控作用。采用高分辨質(zhì)譜法鑒定升麻和黑升麻中的化學(xué)成分；升麻與黑升麻含藥血清或與CB2R反向激動(dòng)劑AM630或ERα抑制劑ICI聯(lián)合處理MC3T3-E1成骨細(xì)胞，CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖活性；試劑盒測(cè)定堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性；茜素紅染色觀察成骨細(xì)胞骨礦化結(jié)節(jié)的形成；Western blotting檢測(cè)骨形成相關(guān)蛋白及CB2R與ERα的表達(dá)。升麻和黑升麻中分別鑒定了12、14個(gè)化學(xué)成分，其中有3個(gè)共有成分。升麻和黑升麻含藥血清可顯著增加成骨細(xì)胞的增殖、ALP活性和骨礦化結(jié)節(jié)形成，增加CB2R和ERα及骨形成相關(guān)蛋白的表達(dá)。15%升麻含藥血清對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖、ALP活性、骨礦化結(jié)節(jié)形成及骨形成相關(guān)蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用可被AM630和ICI所逆轉(zhuǎn)，15%黑升麻含藥血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞骨形成的促進(jìn)作用僅可被ICI所逆轉(zhuǎn)。升麻含藥血清可通過(guò)CB2R與ERα雙靶點(diǎn)促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成，黑升麻含藥血清僅通過(guò)激活ERα增加成骨細(xì)胞的骨形成。

升麻；黑升麻；成骨細(xì)胞；大麻素2型受體；雌激素受體α；升麻消旋體A；7,8-二羥基升麻醇；2′--acetyl cimicifugoside H-1

骨質(zhì)疏松癥是危害老年人健康的重大疾病，其發(fā)生與骨形成的成骨細(xì)胞功能減退和骨吸收的破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)有關(guān)[1-2]。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的形成分化和功能受多個(gè)靶點(diǎn)和信號(hào)通路的調(diào)控。大麻素2型受體（cannabinoid receptor type 2，CB2R）和雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）為調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能的關(guān)鍵靶點(diǎn)。CB2R主要存在于骨骼及外周免疫系統(tǒng)，其激動(dòng)劑HU308可激活成骨細(xì)胞的CB2R，緩解雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥[3]。CB2R激動(dòng)劑因其無(wú)精神成癮樣的不良反應(yīng)[4]，已成為調(diào)控骨代謝藥物研究的新熱點(diǎn)。ERα在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中高度表達(dá)，ERα激動(dòng)劑對(duì)骨骼具有保護(hù)作用，如抗骨質(zhì)疏松藥物雷諾昔芬、他莫昔芬等。研究證明，以ERα為靶點(diǎn)的雷諾昔芬、他莫昔芬對(duì)CB2R也有一定的激動(dòng)作用[5]。成骨細(xì)胞中CB2R和ERα的激活均可以調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路，并增強(qiáng)成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）的表達(dá)，促進(jìn)骨形成[6-7]。因此，同時(shí)激活CB2R和ERα靶點(diǎn)的藥物，可顯著增強(qiáng)成骨細(xì)胞的骨形成，有效防治骨質(zhì)疏松癥。

升麻為毛茛科植物大三葉升麻Kom.、興安升麻(Turcz.) Maxim.或升麻L(zhǎng).的干燥根莖，具有抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松癥、神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性[8-9]。在歐洲和北美，來(lái)源于同屬植物黑升麻L(zhǎng).的制劑常用于緩解更年期綜合征及骨質(zhì)疏松癥的治療[10-11]。研究表明升麻與黑升麻的抗骨質(zhì)疏松癥及緩解更年期癥狀的作用效果相似[12]，表明升麻也可作為替代和補(bǔ)充治療劑，用于骨質(zhì)疏松癥、更年期綜合征等疾病的防治。然而，升麻和黑升麻在細(xì)胞水平上對(duì)骨代謝的調(diào)控作用及機(jī)制尚不清楚。因此，本研究基于CB2R和ERα雙靶點(diǎn)，比較升麻與黑升麻含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞功能的調(diào)控作用，為將升麻開(kāi)發(fā)為抗骨質(zhì)疏松癥的臨床補(bǔ)充藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（浙）2021-0361，動(dòng)物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，室溫（25±2）℃，相對(duì)濕度45%～50%，自由進(jìn)食飲水。本研究中所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用嚴(yán)格遵守浙江中醫(yī)藥大學(xué)倫理規(guī)定（批準(zhǔn)號(hào)20221207Aazz0619080878）。

1.2 細(xì)胞

小鼠成骨前體細(xì)胞系MC3T3-E1（目錄號(hào)GNM15）來(lái)自中國(guó)科學(xué)院（上海）細(xì)胞庫(kù)。

1.3 藥材

升麻（批號(hào)210901）購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院秦路平教授鑒定為毛茛科植物升麻L(zhǎng).的干燥根莖。

1.4 藥品與試劑

黑升麻制劑膠囊（批號(hào)LG15353.A01）購(gòu)自澳洲Nature’s Way公司；甲酸（批號(hào)A800013）、甲醇（批號(hào)M921074）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；乙腈（批號(hào)45983，色譜純）購(gòu)自默克有限公司；α-MEM培養(yǎng)基（批號(hào)TBD41061）購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰荆?%多聚甲醛（批號(hào)R20497）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；磷酸酶蛋白酶抑制劑（批號(hào)P1045）、Western及IP裂解液（批號(hào)P0013J）、上樣緩沖液（批號(hào)P0015）、脫脂奶粉（批號(hào)P0216）、Western一抗稀釋液（批號(hào)P0023A）、牛血清白蛋白（批號(hào)ST023）、BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)P0010）、30%丙烯酰胺溶液（批號(hào)ST003）、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8，批號(hào)ST788）、1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8，批號(hào)ST768）、過(guò)硫酸銨（批號(hào)ST005）、TEMED（批號(hào)ST728）、DAPI染色液（批號(hào)061819191015）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（批號(hào)121820210416）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Tris（批號(hào)A501492-0500）、甘氨酸（批號(hào)A502065-0500）購(gòu)自上海生工生物科技有限公司；胎牛血清（批號(hào)10091-148）、CB2R反向激動(dòng)劑AM630（批號(hào)GC10147）、ERα抑制劑ICI（批號(hào)A1428）購(gòu)自APExBIO公司；青霉素-鏈霉素（批號(hào)15140-122）購(gòu)自美國(guó)GLPBIO公司；ECL顯色液（批號(hào)1925901）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；CCK-8增殖檢測(cè)試劑盒（批號(hào)ab228554）、成骨細(xì)胞特異基因Osterix兔多克隆抗體（批號(hào)ab22552）、I型膠原蛋白（type I collagen，COL-1）兔單克隆抗體（批號(hào)ab138492）、兔抗單克隆CB2抗體（批號(hào)ab259323）、兔抗單克隆BMP2抗體（批號(hào)ab14933）、兔抗單克隆ER抗體（批號(hào)ab32063）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Runx2兔多克隆抗體（批號(hào)12556S）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔多克隆抗體（批號(hào)AF7021）購(gòu)自美國(guó)Affinity公司。

1.5 儀器

Vanquish超高液相色譜儀、Q Exactive PLUS Mass Spectrometer質(zhì)譜儀、ST16R型低溫高速離心機(jī)、371型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；LC-10N-50A型冷凍干燥機(jī)（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；XP105型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器公司）；PowerPac Basic雙垂直電泳儀、Synergy H1型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰公司）；Eclipse Ti-s型熒光相差倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

2 方法

2.1 樣品制備

升麻飲片100 g，用60%乙醇以1∶10的固液比回流提取2次，每次2 h，濾過(guò)濃縮后凍干，最終產(chǎn)率為19.8%。依據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版一部中升麻成人最高劑量為10 g，按照體表面積換算得大鼠ig劑量為180 mg/kg；黑升麻膠囊推薦用量為每日0.667 g，換算得大鼠ig劑量為60 mg/kg。

2.2 升麻和黑升麻化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MS分析

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取升麻提取物和黑升麻膠囊內(nèi)容物各40 mg，加入80%甲醇溶液500 μL，45 Hz、240 s加鋼珠勻漿，冰水浴超聲處理1 h，?20 ℃靜置1 h。4 ℃、12 000 r/min離心15 min后，取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜于進(jìn)樣瓶中備用。

2.2.2 高效液相色譜條件 Waters XSelect?HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～15 min，5%～95% B；15.0～15.1 min，95%～5% B；15.1～20.0 min，5% B。體積流量為0.4 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

2.2.3 質(zhì)譜條件 鞘氣體積流量30 L/h；輔助氣體積流量10 L/h；離子透鏡電壓55.0 V；噴霧電壓3.8、?3.2 kV；毛細(xì)管溫度320 ℃；輔助氣加熱器溫度300 ℃；ESI離子源；霧化氣壓379.22 kPa；輔助氣壓379.22 kPa；氣簾氣壓241.32 kPa；溫度550 ℃；噴霧電壓5500 V（正離子模式）；轟擊能量40 eV；碰撞能差20 eV。利用控制軟件（Analyst TF 1.7，AB Sciex）基于信息依賴(lài)型掃描功能（information dependent acquisition，IDA）在每個(gè)數(shù)據(jù)采集循環(huán)中，篩選出強(qiáng)度最強(qiáng)且大于100的分子離子采集二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。使用Progenesis QI軟件導(dǎo)入原始數(shù)據(jù)，進(jìn)行保留時(shí)間矯正、峰識(shí)別、峰提取、峰積分和峰對(duì)齊等，利用自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)及相應(yīng)裂解規(guī)律匹配法進(jìn)行鑒定。

2.3 升麻及黑升麻含藥血清的制備

60只大鼠稱(chēng)定體質(zhì)量（）后分為3個(gè)區(qū)組，第1區(qū)組18只（200 g≤＜210 g），第2區(qū)組18只（210 g≤＜230 g），第3區(qū)組24只（230 g≤≤250 g），依次對(duì)大鼠進(jìn)行編號(hào)，按照完全隨機(jī)法分為3個(gè)給藥組，每組20只，分別ig生理鹽水、180 mg/kg升麻提取物、60 mg/kg黑升麻膠囊內(nèi)容物，1次/d；各組連續(xù)給藥7 d后，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃靜置2 h，3000 r/min離心15 min，分離上清液，為消除個(gè)體化差異將3個(gè)給藥組血清分別合并后，56 ℃滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)除菌后分裝，凍存于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將狀態(tài)良好的MC3T3-E1細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)傳代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。）

2.5 成骨細(xì)胞的處理及指標(biāo)測(cè)定

2.5.1 藥物處理 MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)24 h，用5%、10%、15%的升麻或黑升麻含藥血清處理后，進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。為了觀察CB2R和ERα抑制劑對(duì)升麻含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞作用的逆轉(zhuǎn)作用，在細(xì)胞給藥前30 min，加入1 μmol/L CB2R反向激動(dòng)劑AM630，或者1 μmol/L ERα抑制劑ICI，培養(yǎng)，進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

2.5.2 成骨細(xì)胞增殖和ALP活性檢測(cè) 將MC3T3-E1細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，分別加入升麻或黑升麻含藥血清，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，加入10 μL CCK-8溶液培養(yǎng)30 min后，測(cè)定450 nm處的吸光度（）值。

MC3T3-E1細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板中，按“2.5.1”項(xiàng)下方法處理，加入成骨誘導(dǎo)液（5×10?3mol/Lβ-甘油磷酸、100 mg/L抗壞血酸和1×10?8mol/L地塞米松）誘導(dǎo)成骨分化。給藥7 d，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定ALP活性。將培養(yǎng)的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS沖洗2次，加入ALP染色液，37 ℃染色30 min后，PBS洗滌細(xì)胞3次，顯微鏡下觀察拍照。

2.5.3 骨礦化結(jié)節(jié)誘導(dǎo)及茜素紅ARS染色 將MC3T3-E1細(xì)胞以1×104/孔接種96孔板中，按“2.5.1”項(xiàng)下方法處理，成骨誘導(dǎo)14 d后，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2次，每孔加入50 μL 4%多聚甲醛中固定30 min，用含40 mmol/L茜素紅的ARS（pH 4.2）染色30 min，光學(xué)顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞骨礦化結(jié)節(jié)的形態(tài)和數(shù)目。用10%氯化十六烷吡啶磷酸鈉溶解骨結(jié)節(jié)，并在570 nm處測(cè)定值。

2.5.4 Western blotting分析 將MC3T3-E1細(xì)胞以2×105/孔接種于6孔板中，按“2.5.1”項(xiàng)下方法處理，成骨誘導(dǎo)7 d后，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞3次，每孔加入200 μL RIPA裂解液，冰上裂解30 min，離心，取上清，采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度后變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%胎牛血清蛋白封閉后，分別加入成骨相關(guān)蛋白抗體（1∶1000）、GAPDH抗體（1∶1000）、CB2R抗體（1∶500）、ERα抗體（1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗（1∶3000），37 ℃孵育1 h，用MONAD QuickChemi 5100化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影并定量分析條帶。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 基于UPLC/Q-TOF/MS的升麻和黑升麻化學(xué)成分的比較

收集整理國(guó)內(nèi)外升麻屬植物化學(xué)成分研究的相關(guān)文獻(xiàn)，建立包括化合物英文名稱(chēng)、分子式、結(jié)構(gòu)式、精確相對(duì)分子質(zhì)量及特征碎片的化學(xué)成分文獻(xiàn)信息數(shù)據(jù)庫(kù)，比較化學(xué)成分的質(zhì)譜信息，對(duì)檢測(cè)到的化合物進(jìn)行鑒定。如圖1所示，在正離子模式下采集數(shù)據(jù)，通過(guò)對(duì)保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量及二級(jí)質(zhì)譜碎片等的對(duì)比分析，從升麻提取物中共鑒定12個(gè)化學(xué)成分，包括升麻酸C、norkhelloside、升麻消旋體A、cimiheracleins A、cimigenol-3--β--galactopyranoside、7,8-二羥基升麻醇、25-methoxy-24--acetylisohurinol、2′--acetyl cimicifugoside H-1、25--methylcimigenol-3--α--ara、cimiracemoside C、金龜草二醇和升麻醇-3-酮；從黑升麻膠囊內(nèi)容物中共鑒定14個(gè)化學(xué)成分，包括去甲豬毛菜堿、cimicifugolide C、升麻酸A、15,16--14-carboxyl-16-oxo-hydro-shengmanol-3--β--xyl、3--α--ara-24--acetylhydroshengmanol-15--β--glucose、3,4-二甲氧基肉桂酸、升麻消旋體A、阿克特素、15,16--升麻新醇C、7,8-二羥基升麻醇、cimiracemoside J、2′--acetyl cimicifugoside H-1、cimicinol和24--acetylhydroshengmanol，其中升麻和黑升麻提取物中均檢測(cè)到的成分為升麻消旋體A、7,8-二羥基升麻醇及2′--acetyl cimicifugoside H-1。

1-升麻酸C 2-norkhelloside 3-升麻消旋體A 4-cimiheracleins A 5-cimigenol-3-O-β-D-galactopyranoside 6-7,8-二羥基升麻醇 7-25-methoxy-24-O-acetylisohurinol 8-2′-O-acetyl cimicifugoside H-1 9-25-O-methylcimigenol-3-O-α-L-ara 10-cimiracemoside C 11-金龜草二醇 12-升麻醇-3-酮 13-去甲豬毛菜堿 14-cimicifugolide C 15-升麻酸A 16-15,16-seco-14-carboxyl-16-oxo-hydro-shengmanol-3-O-β-D-xyl 17-3-O-α-L-ara-24-O-acetylhydroshengmanol-15-O-β-D-glucose 18-3,4-二甲氧基肉桂酸 19-阿克特素 20-15,16-seco-升麻新醇C 21-cimiracemoside J 22-cimicinol 23-24-O-acetylhydroshengmanol

3.2 升麻與黑升麻含藥血清基于CB2R及ERα對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

如表1所示，5%、10%和15%的升麻和黑升麻含藥血清作用24 h，對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖均無(wú)顯著影響。5%和10%的升麻和黑升麻含藥血清作用24 h，對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖均無(wú)顯著影響。升麻和黑升麻含藥血清分別作用48 h均可劑量相關(guān)性地顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖（＜0.05、0.01、0.001）。CB2R反向激動(dòng)劑AM630或ERα抑制劑ICI預(yù)處理后能逆轉(zhuǎn)15%升麻或黑升麻含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用（＜0.01、0.001）；AM630和ICI共同處理后更加有效逆轉(zhuǎn)升麻或黑升麻含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用（＜0.001），表明升麻或黑升麻含藥血清可能通過(guò)激活CB2R和ERα增加成骨細(xì)胞的增殖。

3.3 升麻與黑升麻含藥血清基于CB2R及ERα對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性的影響

成骨細(xì)胞表達(dá)ALP，參與其分化和骨基質(zhì)的礦化。ALP活性常用于表征成骨細(xì)胞的分化和骨基質(zhì)礦化功能。如圖2所示，5%、10%和15%的升麻與黑升麻含藥血清均可顯著增加成骨細(xì)胞ALP活性，且呈劑量相關(guān)性（＜0.01、0.001）。AM630、ICI及二者共同預(yù)處理均可逆轉(zhuǎn)15%升麻含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞ALP活性的促進(jìn)作用（＜0.001），且AM630和ICI共同處理的逆轉(zhuǎn)作用更為顯著（＜0.01、0.001），表明升麻通過(guò)激活CB2R及ERα增加成骨細(xì)胞ALP的活性。AM630預(yù)處理不能逆轉(zhuǎn)15%黑升麻含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞ALP的促進(jìn)作用，而ICI預(yù)處理能夠逆轉(zhuǎn)15%黑升麻含藥血清對(duì)ALP活性的促進(jìn)作用，表明黑升麻可能僅通過(guò)激活ERα增加成骨細(xì)胞ALP的活性。

表1 升麻與黑升麻含藥血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響及AM630和ICI的逆轉(zhuǎn)作用(, n = 3)

與含相同濃度血清的對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001；與無(wú)AM630或ICI的15%藥物處理組比較：◆＜0.05◆◆＜0.01◆◆◆＜0.001

*< 0.05**< 0.01***< 0.001control group containing the same concentration of serum;◆< 0.05◆◆< 0.01◆◆◆< 0.00115% drug treatment group without AM630 or ICI

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001；與無(wú)AM630或ICI的15%藥物處理組比較：◆＜0.05◆◆＜0.01◆◆◆＜0.001；與AM630及ICI聯(lián)合給藥組比較：#＜0.05##＜0.01###＜0.001，圖3、5、6同

*< 0.05**< 0.01***< 0.001control group;◆< 0.05◆◆< 0.01◆◆◆< 0.00115% corresponding drug treatment group without AM630 or ICI;#< 0.05##< 0.01###< 0.001AM630 and ICI combined administration group, same as figs. 3, 5 ,6

3.4 升麻與黑升麻含藥血清基于CB2R及ERα對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞骨礦化結(jié)節(jié)形成的影響

成骨細(xì)胞通過(guò)礦化產(chǎn)生骨基質(zhì)，增加骨量。如圖3所示，5%、10%和15%的升麻與黑升麻含藥血清均可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成（＜0.01、0.001）。AM630和ICI預(yù)處理均可逆轉(zhuǎn)15%升麻含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成的促進(jìn)作用（＜0.001），且AM630和ICI共同處理后，逆轉(zhuǎn)作用更加顯著（＜0.01、0.001），表明升麻含藥血清通過(guò)激活CB2R及ERα增加成骨細(xì)胞的礦化。ICI預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)15%黑升麻含藥血清對(duì)骨礦化結(jié)節(jié)的促進(jìn)作用（＜0.05），但AM630預(yù)處理對(duì)不能逆轉(zhuǎn)15%黑升麻含藥血清對(duì)骨礦化結(jié)節(jié)的促進(jìn)作用，表明黑升麻僅通過(guò)激活ERα增加成骨細(xì)胞的礦化。

圖3 升麻與黑升麻含藥血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞骨礦化結(jié)節(jié)形成的影響及AM630和ICI的逆轉(zhuǎn)作用(, n = 3)

3.5 升麻與黑升麻含藥血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞CB2R與ER-α及骨形成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

BMP2、Runx2和Osterix是參與成骨細(xì)胞功能調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，COL-1是成骨細(xì)胞分泌的基質(zhì)蛋白，這些蛋白表達(dá)水平的高低，反映了成骨細(xì)胞的骨形成能力。如圖4所示，5%、10%和15%的升麻與黑升麻含藥血清均可顯著上調(diào)成骨細(xì)胞BMP2、Runx2、Osterix及COL-1的表達(dá)（＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性，表明升麻和黑升麻含藥血清可促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成和分化。

如圖5所示，15%的升麻含藥血清可顯著上調(diào)成骨細(xì)胞CB2R與ERα，及骨形成相關(guān)蛋白BMP2、Runx2、Osterix及COL-1的表達(dá)（＜0.001），AM630、ICI或兩者共同預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)15%升麻含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞CB2R、ERα及骨形成蛋白BMP2、Runx2、Osterix及COL-1表達(dá)的促進(jìn)作用（＜0.05、0.01、0.001），進(jìn)一步表明升麻含藥血清通過(guò)激活CB2R與ERα促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成、分化和骨礦化作用。

如圖6所示，15%的黑升麻含藥血清可顯著上調(diào)成骨細(xì)胞CB2R與ERα，及骨形成相關(guān)蛋白BMP2、Runx2、Osterix及COL-1的表達(dá)，其對(duì)成骨細(xì)胞關(guān)鍵蛋白表達(dá)的增強(qiáng)作用可被ICI逆轉(zhuǎn)，而不能被AM630逆轉(zhuǎn)。

與對(duì)照5%組比較：◆P＜0.05 ◆◆◆P＜0.001；與對(duì)照10%組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與對(duì)照15%組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001

圖5 升麻含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞CB2R與ERα及骨形成相關(guān)蛋白表達(dá)影響及AM630和ICI的逆轉(zhuǎn)作用(, n = 3)

圖6 黑升麻含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞CB2R與ERα及骨形成相關(guān)蛋白表達(dá)影響及AM630和ICI的逆轉(zhuǎn)作用(, n = 3)

4 討論

目前，骨質(zhì)疏松癥的治療藥物如雌激素、雙磷酸鹽、甲狀旁腺素等均存在一定程度的不良反應(yīng)。中藥和天然藥物均有不良反應(yīng)小、可長(zhǎng)期服用等特點(diǎn)，在骨質(zhì)疏松癥的防治上具有明顯的優(yōu)勢(shì)[13-14]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明升麻和黑升麻提取物可顯著減少去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨丟失[15-16]。黑升麻在歐美長(zhǎng)期用于防治更年期綜合征和骨質(zhì)疏松癥。本研究發(fā)現(xiàn)升麻與黑升麻含藥血清可顯著增加成骨細(xì)胞的增殖活性、ALP活性、骨礦化結(jié)節(jié)形成及成骨細(xì)胞BMP2和Runx2等關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，顯示出確切的促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成的作用。升麻含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞功能的促進(jìn)作用可被CB2R反向激動(dòng)劑AM630或ERα抑制劑ICI所逆轉(zhuǎn)，表明升麻含藥血清可能通過(guò)激活CB2R與ERα雙靶點(diǎn)發(fā)揮調(diào)控骨代謝的作用。黑升麻含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞功能的促進(jìn)作用僅可被ERα抑制劑ICI逆轉(zhuǎn)，CB2R反向激動(dòng)劑AM630對(duì)黑升麻含藥血清促進(jìn)成骨細(xì)胞功能的作用沒(méi)有顯著影響，表明黑升麻僅通過(guò)激活ERα促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成。這些結(jié)果可為升麻和黑升麻臨床用于防治骨質(zhì)疏松癥提供科學(xué)的依據(jù)。

成骨細(xì)胞的分化和骨形成在維持骨重塑平衡和骨量方面起著關(guān)鍵作用。成骨細(xì)胞是參與骨形成的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化，并完成骨重建。BMP在未分化間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化中起關(guān)鍵作用，Runx2和Osterix是成骨細(xì)胞分化和骨形成所需的轉(zhuǎn)錄因子[17]。MC3T3-E1細(xì)胞系是小鼠成骨前體細(xì)胞系，該細(xì)胞系在體外經(jīng)誘導(dǎo)可分化為成骨模型，常用于研究藥物對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化影響的研究。本實(shí)驗(yàn)觀察升麻和黑升麻含藥血清對(duì)MC3T3-E1的增殖、分化、礦化及關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)升麻和黑升麻含藥血清能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、ALP的活性、骨礦化結(jié)節(jié)的形成及骨形成關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，具有抗骨質(zhì)疏松癥的作用。在成骨細(xì)胞增殖研究中，發(fā)現(xiàn)含藥血清干預(yù)成骨細(xì)胞24、48、72 h中，僅在48 h有顯著的增殖作用，在24、72 h增殖效果不顯著，可能是因?yàn)樗幬锔深A(yù)24 h后，藥效作用于成骨細(xì)胞時(shí)間較短，未有顯著增殖；藥物干預(yù)72 h后增殖效果不顯著，可能是因?yàn)槌晒羌?xì)胞在給藥48 h后達(dá)到一定程度增殖，所以對(duì)照組與給藥處理未顯示出差別。

CB2R可在成骨細(xì)胞上表達(dá)，激活成骨細(xì)胞CB2R的表達(dá)，可增加成骨細(xì)胞的骨形成作用[18]。成骨細(xì)胞CB2R的表達(dá)增加，可激活BMP/Wnt/β-catenin通路，增加Runx2和BMP2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、ALP活性和骨基質(zhì)礦化。本研究發(fā)現(xiàn)升麻與黑升麻含藥血清作用于成骨細(xì)胞后，可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、ALP活性和骨礦化結(jié)節(jié)形成及Osterix、BMP2、Runx2及COL-1的表達(dá)，CB2R反向激動(dòng)劑AM630可以逆轉(zhuǎn)升麻含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞的作用，而不能逆轉(zhuǎn)黑升麻含藥血清的作用，表明升麻含藥血清通過(guò)激活CB2R促進(jìn)骨形成相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)控成骨細(xì)胞功能，而黑升麻則可能不是通過(guò)直接激活CB2R發(fā)揮促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成作用的。

ERα為成骨細(xì)胞上調(diào)控骨代謝的關(guān)鍵靶點(diǎn)，雌激素通過(guò)ERα在維持骨骼穩(wěn)態(tài)和防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮著重要作用。臨床上治療骨質(zhì)疏松癥的藥物如戊酸雌二醇、他莫昔芬和雷諾昔芬等選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑均以ERα為靶點(diǎn)發(fā)揮調(diào)控骨代謝作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)升麻與黑升麻含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞功能的促進(jìn)作用可被雌激素受體拮抗劑ICI所逆轉(zhuǎn)，顯示升麻和黑升麻可通過(guò)ERα調(diào)控成骨細(xì)胞的功能。然而，對(duì)ERα具有激動(dòng)活性的藥物?？梢鹑橄侔?、子宮內(nèi)膜癌及心血管疾病等不良反應(yīng)[20-22]，因此，后期需要進(jìn)一步評(píng)價(jià)升麻和黑升麻用于骨質(zhì)疏松癥防治可能產(chǎn)生的相關(guān)不良反應(yīng)。

升麻和歐美常用的天然藥物黑升麻均來(lái)源于毛茛科升麻屬植物，均具有三萜及苷類(lèi)、酚酸類(lèi)、色酮類(lèi)、生物堿、含氮類(lèi)等化合物[23]。本研究鑒定了升麻提取物中三萜及苷類(lèi)8個(gè)、酚酸類(lèi)1個(gè)、色酮類(lèi)2個(gè)；天然藥物黑升麻中三萜及苷類(lèi)8個(gè)、酚酸類(lèi)3個(gè)、生物堿類(lèi)1個(gè)。其中共有成分3種，分別為酚酸類(lèi)成分升麻消旋體A、三萜及苷類(lèi)成分7,8-二羥基升麻醇和2′--acetyl cimicifugoside H-1。升麻中三萜及其苷類(lèi)主要為升麻苷H-1，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.53%～1.09%[24]；酚酸類(lèi)以咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸為主，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.57%～1.75%、0.22%～1.79%、12.18%[25]；色酮類(lèi)以升麻素為主，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.73%～5.81%[24]。天然藥物黑升麻膠囊內(nèi)容物的主要成分為三萜及其苷類(lèi)成分，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%。本研究發(fā)現(xiàn)升麻可能通過(guò)激活CB2R與ERα發(fā)揮促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和骨基質(zhì)礦化的作用，表明升麻含有CB2R和ERα激動(dòng)劑類(lèi)化學(xué)成分；但黑升麻可能僅通過(guò)激活ERα發(fā)揮促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和骨基質(zhì)礦化的作用。因此，后續(xù)有必要深入挖掘升麻和黑升麻對(duì)CB2R和ERα有激動(dòng)作用的化學(xué)成分，明確其結(jié)構(gòu)特征，為進(jìn)一步的升麻和黑升麻調(diào)控骨代謝的機(jī)制闡明及新型抗骨質(zhì)疏松癥先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effects ofand black cohosh medicated serum on osteoblasts functions based on CB2R and ERα

ZHAO Zi-hui1, HU Si-jing1, CHEN Gao-ce1, YE Xin-yuan1, LIU Yan1, ZHANG Quan-long1, XU Jin-long2, QIN Lu-ping1, HAN Ting3, ZHANG Qiao-yan1, 3

1. School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China 2. 969 Hospital of PLA Joint Logistics Support Forces, Hohhot 010051, China 3. School of Pharmacy, Naval Medical University, Shanghai 200433, China

To study the regulatory effects ofand black cohosh medicated serum on osteoblastic bone formation based on cannabinoid receptor type 2 (CB2R) and estrogen receptor α (ERα).High-resolution mass spectrum was used to identify the chemical constituents inand black cohosh. The osteoblastic MC3T3-E1 cells were treated with various concentrationsand black cohosh medicated serum or the combination with CB2R inverse agonist AM630 or ERα antagonist ICI. CCK-8 method was used to determine the proliferation of MC3T3-E1 cells. The assay kit was used to measure the alkaline phosphatase (ALP) activity. The alizarin red staining was used to detect the formation of bone mineralized nodules in MC3T3-E1 cells. Western blotting was applied to analyze the expressions of CB2R, ERα and related proteins with osteoblastic bone formation.A total of 12 chemical constituents were identified in, and 14 constituents in black cohosh, with three common constituents. Bothand black cohosh medicated serum significantly increased the proliferation, ALP activity and the formation of bone mineralized nodules, and also enhanced the expression of CB2R, ERα and related proteins associated with osteoblastic bone formation. Moreover, the promoting effects 15%medicated serum on osteoblastic MC3T3-E1 cells could be reversed by AM630 and ICI, while the improvement effects of 15% black cohosh medicated serum on osteoblast only could be reversed by ICI.medicated serum increased the osteoblastic bone formation via activation of CB2R and ERα and black cohosh medicated serum enhanced the osteoblastic bone formation only via activiation of ERα.

L.; black cohosh; osteoblast; cannabinoid receptor type 2; estrogen receptor α; cimicifugate racemimer A; 7,8-dihydroxy cohoshol; 2′--acetyl cimicifugoside H-1

R285.5

A

0253 - 2670(2023)18 - 5941 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.012

2023-05-05

上海市科委科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（22S21901600）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81973534）

趙子慧，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幓钚猿煞旨捌渥饔谩-mail: zzh18684297873@163.com

韓 婷，教授，主要從事中藥活性成分及資源開(kāi)發(fā)利用研究。E-mail: hanting@smmu.edu.cn

張巧艷，教授，主要從事中藥活性成分及其作用機(jī)制研究。E-mail: zqy1965@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]