乙醛脫氫酶2 改善急性肺損傷小鼠的肺內(nèi)皮屏障及維持線粒體動(dòng)力學(xué)平衡

王麗婭，田美惠，李蓉，吳越，王莎莎，呂恒，劉忠義，于影

蚌埠醫(yī)學(xué)院1生理學(xué)教研室，2心腦血管疾病基礎(chǔ)與臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，安徽 蚌埠233000

急性肺損傷（ALI）具有高發(fā)病率、高死亡率的特點(diǎn)，是重癥監(jiān)護(hù)室中常見(jiàn)的一種危及生命的疾病，目前仍未見(jiàn)針對(duì)ALI的有效治療藥物［1］。內(nèi)皮屏障功能障礙在ALI的發(fā)展中起重要作用［2］，線粒體功能異常與內(nèi)皮屏障功能障礙密切相關(guān)［3］。生理狀態(tài)下，線粒體處于分裂與融合的動(dòng)態(tài)平衡中，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)［4］。ALI時(shí)由于線粒體動(dòng)力學(xué)失衡，線粒體過(guò)度分裂，活性氧（ROS）過(guò)量產(chǎn)生，從而導(dǎo)致內(nèi)皮屏障通透性增加，加重肺組織損傷［5］。抑制氧化應(yīng)激可以增加緊密連接蛋白如閉鎖小帶蛋白1（ZO-1）和閉合蛋白Occludin的表達(dá)，維持內(nèi)皮屏障的穩(wěn)定性，減輕脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的肺損傷［6］。

核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）是氧化應(yīng)激重要的轉(zhuǎn)錄因子，生理?xiàng)l件下Nrf2與細(xì)胞核中的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，誘導(dǎo)抗氧化防御基因血紅素加氧酶1（HO-1）的表達(dá)，維持氧化還原平衡［7］。激活Nrf2/HO-1途徑，可以抑制Drp1介導(dǎo)的線粒體分裂，發(fā)揮肺組織保護(hù)作用［5］。線粒體乙醛脫氫酶2（ALDH2）是位于線粒體基質(zhì)內(nèi)重要的醛類(lèi)氧化酶，催化乙醛氧化為乙酸［8］，被證實(shí)在多種器官中具有保護(hù)效應(yīng)［9-12］。已有研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2可以通過(guò)激活Nrf2/HO-1抗氧化途徑，抑制ROS過(guò)度生成，從而緩解肝臟損傷［13］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，LPS引起的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障損傷，與線粒體融合減少和分裂增多以及氧化應(yīng)激水平增加有關(guān)，激動(dòng)ALDH2可以有效改善上述病理變化［14］。但ALDH2是否能夠通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，維持線粒體動(dòng)力學(xué)平衡，抑制氧化應(yīng)激，減輕ALI小鼠肺內(nèi)皮屏障的破壞？目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠模型，觀察ALDH2對(duì)小鼠肺內(nèi)皮屏障的作用，并進(jìn)一步探究Nrf2/HO-1信號(hào)通路以及線粒體動(dòng)力學(xué)在其中的調(diào)控機(jī)制，以期為臨床診治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性C57BL/6J小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自河南斯克貝斯生物公司（許可證號(hào)：SCXK2020-0005）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理要求進(jìn)行（動(dòng)物倫理審批號(hào)：[2020]第099號(hào)）。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；4-羥基壬烯醛（4-HNE）Elisa試劑盒（卡爾文公司）；伊文思藍(lán)（EB）、核蛋白提取試劑盒（索萊寶科技公司）；電鏡固定液（賽維爾生物科技有限公司）；4%多聚甲醛、RIPA強(qiáng)效裂解液（Biosharp）；PMSF、BCA蛋白試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液（碧云天）；PAGE凝膠試劑盒（雅酶生物公司）；PVDF膜、Immobilon Western（Millipore）；脫脂奶粉（Biofroxx）；ALDH2、ZO-1、Occludin、OPA1、Drp1一抗（Abcam）；Mfn2、Fis1、Nrf2、HO-1、β-actin一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（Biosharp）；LPS（Sigma）；ALDH2激動(dòng)劑Alda-1、ALDH2抑制劑Daidzin（MCE）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立和分組 雄性C57BL/6J小鼠在25～27 ℃、相對(duì)濕度60%～70%的條件下飼養(yǎng)，待小鼠適應(yīng)1周后。將小鼠隨機(jī)分為Sham組、LPS組、LPS+Alda-1組、LPS+Daidzin組。Sham組小鼠腹腔內(nèi)注射等量的生理鹽水；LPS組小鼠腹腔注射10 mg/kg 的LPS建立小鼠ALI模型［15］；LPS+Alda-1組小鼠提前1 h腹腔注射20 mg/kg的Alda-1，然后注射10 mg/kg的LPS［16］；LPS+Daidzin組小鼠提前1 h腹腔注射10 mg/kg的Daidzin，然后注射10 mg/kg的LPS［17］。注射12 h后，采用1%的戊巴比妥鈉麻醉處理小鼠。

1.2.2 HE染色觀察肺組織結(jié)構(gòu) 按前述方法分組和處理，小鼠深度麻醉后迅速取出肺組織，用4%的多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色觀察肺組織的形態(tài)。在顯微鏡下觀察各組肺組織病理學(xué)改變，并統(tǒng)一條件下拍照記錄。對(duì)以下4項(xiàng)內(nèi)容進(jìn)行評(píng)分:（1）肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔大小不等（融合或塌陷）；（2）肺泡和肺間質(zhì)炎性細(xì)胞（中性粒細(xì)胞)聚集或浸潤(rùn)；（3）肺泡及肺間質(zhì)出血；（4）肺水腫程度（肺泡間隔增厚）。肺損傷評(píng)分累積為0～4分。0分：沒(méi)有損傷；1分：輕度損傷；2分：中度損傷；3分：重度損傷；4分：極重度損傷［18］。

1.2.3 透射電鏡檢查肺組織超微結(jié)構(gòu)改變 分組和處理同上，切取一小塊肺臟組織，2.5%的戊二醛固定過(guò)夜。次日PBS洗凈肺組織，依次經(jīng)過(guò)后固定（1%四氧化鋨室溫2 h）、清洗、脫水、環(huán)氧樹(shù)脂包埋、超薄切片機(jī)切片。檸檬酸鉛及醋酸雙氧鈾雙染，透射電鏡下觀察拍片。

1.2.4 計(jì)算肺組織濕干質(zhì)量比（W/D）造模12 h后，取肺部組織并精確測(cè)定質(zhì)量，記為濕質(zhì)量（W），再將肺組織置于95 ℃的烘箱中烘干72 h后測(cè)定質(zhì)量，為干質(zhì)量（D），計(jì)算肺組織的W/D以確定水腫程度。

1.2.5 肺微血管通透性檢測(cè) 造模12 h后腹腔注射2%的EB 染液（4 mL/kg），觀察眼球結(jié)膜、耳朵及四肢變藍(lán)。2 h后麻醉小鼠，用生理鹽水從小鼠心臟處灌注，取肺、吸干多余水分、稱(chēng)重。每100 mg肺組織加入1 mL甲酰胺進(jìn)行勻漿，45 ℃避光孵育48 h，置于離心機(jī)內(nèi)（8000 r/min）離心7 min收集上清液，于620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算EB滲漏量。

1.2.6 ELISA檢測(cè)小鼠血清4-HNE的水平 造模12 h

后麻醉小鼠，取小鼠外周血，置于離心機(jī)內(nèi)（3000 r/min）離心15 min收集上清液，然后參照4-HNE檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)4-HNE的表達(dá)水平。酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組4-HNE的含量。

1.2.7 試劑盒檢測(cè)小鼠血清MDA含量和SOD、CAT活性 取小鼠外周血上清液，按照各試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度值，計(jì)算各組血清MDA含量及SOD、CAT活性。

1.2.8 Western blot法檢測(cè)各蛋白表達(dá) 依據(jù)100 mg肺組織加入1 mL裂解液（配置比例RIPA∶PMSF=100∶1），勻漿后放于冰上裂解1 h，期間不停震蕩，設(shè)置離心機(jī)參數(shù)12 000 r/min，4 ℃離心15 min，留取上清即總蛋白；核蛋白按照核蛋白提取說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取。BCA法測(cè)定蛋白濃度。配置SDS-PAGE凝膠，并按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行電泳分離組織中的蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉進(jìn)行抗體封閉，隨后將PVDF膜分別與ALDH2（1∶1000）、ZO-1（1∶1000）、Occludin（1∶1000）、OPA1（1∶1000）、Mfn2（1∶8000）、Drp1（1∶1000）、Fis1（1∶2000）、Nrf2（1∶3000）、HO-1（1∶3000）、β-actin（1∶1000）一抗4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后室溫孵育HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1∶10 000）2 h。洗膜后，ECL發(fā)光檢測(cè)并用ImageJ軟件對(duì)灰度值進(jìn)行分析計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALDH2減輕ALI模型小鼠肺組織損傷

Sham組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，無(wú)明顯肺水腫；LPS組可見(jiàn)肺泡腔大小不一，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)大量粉紅色滲出液，肺泡間隔明顯增厚，肺間質(zhì)有明顯的水腫、出血，其損傷評(píng)分高于Sham組（11.00±0.82vs1.75±0.50,P＜0.01)，且LPS+Daidzin 組較Sham 組損傷更為明顯（12.75±0.96vs1.75±0.50,P＜0.01）；而LPS+Alda-1組可改善LPS誘導(dǎo)的肺組織損傷，肺水腫減輕，炎癥反應(yīng)減弱，其損傷評(píng)分較LPS 組明顯降低（5.00±0.82vs11.00±0.82，P＜0.01，圖1）。

圖1 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化Fig. 1 Histopathological changes in the lungs of the mice in different groups.A:HE staining of the lung tissues(Original magnification:×200,scale bar=50 μm).B:Comparison of histopathological scores of the lungs among the 4 groups of mice(Mean±SD,n=4).**P＜0.01 vs Sham,##P＜0.01 vs LPS,&&P＜0.01 vs LPS+Alda-1.

2.2 ALDH2減輕ALI模型小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接及線粒體結(jié)構(gòu)損傷

Sham組小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞完整，細(xì)胞之間的緊密連接穩(wěn)定清晰，未見(jiàn)間隙；而LPS組和LPS+Daidzin組內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生皺縮，細(xì)胞間緊密連接密度下降，存在明顯間隙；LPS+Alda-1組細(xì)胞形態(tài)趨于正常，細(xì)胞間緊密連接較為完整（圖2A）。觀察各組線粒體超微結(jié)構(gòu)，Sham組線粒體形態(tài)正常呈長(zhǎng)梭形，基質(zhì)致密，嵴發(fā)達(dá)。而LPS組和LPS+Daidzin組線粒體表現(xiàn)為腫脹形式、嵴減少或消失，其中LPS+Daidzin組最為明顯；而給予Alda-1干預(yù)后減輕了LPS對(duì)線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷，與Sham相比沒(méi)有顯著差異（圖2B）。

圖2 透射電鏡下觀察各組小鼠超微結(jié)構(gòu)改變Fig. 2 Ultrastructural changes of the lung tissues in each group observed under transmission electron microscopy(×20 000,scale bar=500 nm).A:Alteration of tight junction structure of lung endothelial cells in each group.B:Structural changes of the mitochondria in the 4 groups.

2.3 ALDH2降低ALI模型小鼠肺組織的W/D值

與Sham 組相比，LPS 組小鼠肺組織W/D 值增加（5.55±0.09vs4.89±0.12,P＜0.01）；與LPS組相比，LPS+Alda-1組可降低ALI小鼠肺組織W/D值（4.86±0.07vs5.55±0.09,P＜0.01）；而與LPS+Alda-1 組相比，LPS+Daidzin 組小鼠肺組織W/D 比值增加（5.84±0.06vs4.86±0.07，P＜0.01，圖3）。

圖3 各組小鼠肺組織W/D比較Fig. 3 Comparison of wet/dry mass ratio of the lung tissue among the 4 groups(Mean±SD,n=4).**P＜0.01 vs Sham,##P＜0.01 vs LPS,&&P＜0.01 vs LPS+Alda-1.

2.4 ALDH2降低ALI模型小鼠肺組織EB含量

與Sham組相比，LPS組小鼠肺組織EB含量增加（12.47±0.82vs4.94±0.47,P＜0.01）；與LPS 組相比，LPS+Alda-1組可降低ALI小鼠肺組織EB含量（9.11±0.78vs12.47±0.82,P＜0.01）；與LPS+Alda-1 組相比，LPS+Daidzin組小鼠肺組織EB含量顯著增加（14.19±0.31vs9.11±0.78,P＜0.01，圖4）。

圖4 各組小鼠肺組織EB含量比較Fig. 4 Comparison of Evans Blue content in the lung tissues among the 4 groups(Mean±SD,n=4).**P＜0.01 vs Sham,##P＜0.01 vs LPS,&&P＜0.01 vs LPS+Alda-1.

2.5 ALDH2抑制ALI模型小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)

與Sham 組相比，LPS 組4-HNE（152.10±14.42vs81.90±16.09,P＜0.01）和MDA（6.34±0.30vs3.90±0.40,P＜0.01）含量升高，而SOD（49.00±3.58vs82.63±2.21,P＜0.01）和CAT（12.23±0.55vs17.06±1.34,P＜0.01）活性降低；與LPS 組相比，LPS+Alda-1 組中4-HNE（92.62±9.32vs152.10±14.42,P＜0.01）和MDA（4.08±0.28vs6.34±0.30,P＜0.01）含量降低，而SOD（73.88±3.88vs49.00±3.58,P＜0.01）和CAT（14.94±0.37vs12.23±0.55,P＜0.01）活性升高（圖5）。與LPS+Alda-1組相比，LPS+Daidzin 組4-HNE（222.40±14.87vs92.62±9.32,P＜0.01）和MDA（7.64±0.48vs4.08±0.28,P＜0.01）含量增加，而SOD（45.13±3.33vs73.88±3.88,P＜0.01）和CAT（10.52±0.68vs14.94±0.37,P＜0.01）活性降低（圖5）。

圖5 各組小鼠氧化應(yīng)激水平指標(biāo)比較Fig. 5 Comparison of oxidative stress level indicators among the 4 groups. A: Content of 4-HNE. B:Content of MDA.C:Activity of SOD.D:Activity of CAT.Data are presented as Mean±SD(n=4).**P＜0.01 vs Sham,##P＜0.01 vs LPS,&&P＜0.01 vs LPS+Alda-1.

2.6 ALDH2對(duì)ALI模型小鼠肺組織ALDH2和ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)各組小鼠肺組織ALDH2、ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與Sham組相比，LPS組小鼠肺組織中ALDH2蛋白（0.73±0.06vs1.11±0.16,P＜0.01）、ZO-1 蛋白（0.71±0.03vs1.29±0.15,P＜0.01）、Occludin蛋白（0.58±0.03vs1.15±0.09,P＜0.01）表達(dá)降低；與LPS組相比，LPS+Alda-1組上調(diào)ALI小鼠肺組織中ALDH2蛋白（1.06±0.16vs0.73±0.06,P＜0.05）、ZO-1蛋白（0.97±0.06vs0.71±0.03,P＜0.05）、Occludin蛋白（0.95±0.01vs0.58±0.03,P＜0.01）的表達(dá)；與LPS+Alda-1組相比，LPS+Daidzin組的ALDH2蛋白（0.72±0.06vs1.06±0.16,P＜0.01）、ZO-1 蛋白（0.50±0.12vs0.97±0.06,P＜0.01）、Occludin 蛋白（0.37±0.18vs0.95±0.01,P＜0.01）表達(dá)減少（圖6）。

圖6 各組小鼠肺組織ALDH2、ZO-1、Occludin蛋白水平比較Fig. 6 Comparison of ALDH2,ZO-1 and Occludin protein levels in the lung tissues among the 4 groups.A: Representative Western blots of ALDH2,ZO-1,Occludin in each group. B: Quantitative data of ALDH2.C:Quantitative data of ZO-1.D:Quantitative data of Occludin.Data are presented as Mean±SD(n=4).**P＜0.01 vs Sham,#P＜0.05,##P＜0.01 vs LPS,&&P＜0.01 vs LPS+Alda-1.

2.7 ALDH2促進(jìn)ALI模型小鼠肺組織OPA1、Mfn2蛋白表達(dá)，降低Drp1和Fis1蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與Sham組相比，LPS組小鼠肺組織中OPA1 蛋白（0.61±0.02vs0.98±0.10,P＜0.01）、Mfn2蛋白（0.40±0.01vs1.22±0.08,P＜0.01）表達(dá)降低，Drp1 蛋白（1.12±0.20vs0.47±0.19,P＜0.01）和Fis1蛋白（1.18±0.04vs0.97±0.05,P＜0.01）表達(dá)增加；與LPS組相比，LPS+Alda-1組上調(diào)ALI小鼠肺組織中OPA1蛋白（0.87±0.08vs0.61±0.02,P＜0.01）、Mfn2蛋白（0.54±0.04vs0.40±0.01,P＜0.05），下調(diào)Drp1 蛋白（0.67±0.02vs1.12±0.20,P＜0.01）和Fis1 蛋白（0.93±0.08vs1.18±0.04,P＜0.01）表達(dá)；與LPS+Alda-1 組相比，LPS+Daidzin 組OPA1 蛋白（0.58±0.11vs0.87±0.08,P＜0.01）、Mfn2蛋白（0.21±0.06vs0.54±0.04,P＜0.01）表達(dá)減少，Drp1蛋白（1.02±0.11vs0.67±0.02,P＜0.05）和Fis1蛋白（1.21±0.08vs0.93±0.08,P＜0.01）表達(dá)增加（圖7）。

圖7 各組小鼠肺組織OPA1、Mfn2、Drp1、Fis1蛋白水平比較Fig. 7 Comparison of OPA1,Mfn2,Drp1 and Fis1 protein levels in lung tissues of various groups of mice.A:Representative Western blots of OPA1,Mfn2,Drp1,and Fis1 in each group.B:Quantitative data of OPA1.C:Quantitative data of Mfn2.D:Quantitative data of Drp1.E:Quantitative data of Fis1.Data are presented as Mean±SD(n=4).**P＜0.01 vs Sham,#P＜0.05,##P＜0.01 vs LPS,&P＜0.05,&&P＜0.01 vs LPS+Alda-1.

2.8 ALDH2 上調(diào)ALI 模型小鼠肺組織Nrf2 核蛋白、HO-1蛋白表達(dá)

Western blot法檢測(cè)各組小鼠肺組織中Nrf2核蛋白和HO-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與Sham組相比，LPS組小鼠肺組織中Nrf2核蛋白（0.84±0.09vs0.58±0.14,P＜0.01）、HO-1蛋白（0.74±0.03vs0.41±0.12,P＜0.01）的表達(dá)增加；與LPS組相比，LPS+Alda-1組上調(diào)ALI 小鼠肺組織中Nrf2 核蛋白（1.04±0.04vs0.84±0.09,P＜0.05）、HO-1蛋白（1.00±0.13vs0.74±0.03,P＜0.05）的表達(dá)；與LPS+Alda-1 組相比，LPS+Daidzin組的Nrf2核蛋白（0.71±0.05vs1.04±0.04,P＜0.01）、HO-1蛋白（0.73±0.11vs1.00±0.13,P＜0.05）的表達(dá)減少（圖8）。

圖8 各組小鼠肺組織nuclear Nrf2、HO-1蛋白水平比較Fig. 8 Comparison of nuclear Nrf2 and HO-1 protein levels in the lung tissues among the 4 groups.A: Representative Western blots of nuclear Nrf2 and HO-1 in each group. B: Quantitative data of nuclear Nrf2. C: Quantitative data of HO-1.Data are presented as Mean±SD(n=4).**P＜0.01 vs Sham,#P＜0.05,##P＜0.01 vs LPS,&P＜0.05,&&P＜0.01 vs LPS+Alda-1.

3 討論

肺內(nèi)皮屏障功能障礙是導(dǎo)致ALI高死亡率的主要原因［19］，而內(nèi)皮屏障功能障礙與線粒體動(dòng)力學(xué)失衡、氧化應(yīng)激和緊密連接的破壞直接相關(guān)［20］。革蘭氏陰性菌感染是ALI最重要的病因之一，LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，已被廣泛用于誘導(dǎo)ALI［21,22］。本研究采用LPS誘導(dǎo)小鼠ALI模型，首次證實(shí)ALDH2通過(guò)維持線粒體動(dòng)力學(xué)平衡，抑制氧化應(yīng)激，減輕ALI小鼠肺內(nèi)皮屏障功能障礙，其作用機(jī)制可能與激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路有關(guān)。

線粒體是內(nèi)皮細(xì)胞中至關(guān)重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞的主要能量來(lái)源，當(dāng)細(xì)胞受到環(huán)境或代謝壓力時(shí)，線粒體將開(kāi)始進(jìn)行循環(huán)地分裂和融合，以最大程度地保持其功能并維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)［4］。線粒體的穩(wěn)態(tài)和動(dòng)態(tài)平衡是其功能完整性的先決條件，一旦動(dòng)態(tài)平衡受損，將會(huì)觸發(fā)代謝和能量紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織損傷［3］。先前的研究發(fā)現(xiàn)，LPS可以誘導(dǎo)線粒體分裂蛋白Drp1表達(dá)增加，導(dǎo)致肺內(nèi)皮屏障破壞，通透性增加，加重組織損傷［5］。若體內(nèi)缺乏線粒體融合蛋白Mfn2，會(huì)導(dǎo)致線粒體融合減少、分裂增加，從而引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，血管滲漏增加［23］。本研究電鏡結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠線粒體腫脹、嵴減少或消失，線粒體分裂增多，我們進(jìn)一步檢測(cè)了線粒體分裂與融合相關(guān)蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)線粒體分裂蛋白Drp1和Fis1表達(dá)增加，而融合蛋白Mfn2和OPA1表達(dá)減少。此外，本研究還觀察到ALI小鼠肺組織濕干重比、EB滲透均增高，肺內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)受到破壞，緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)降低。

作為一種重要的醛類(lèi)氧化酶，ALDH2的抗氧化功能引起了許多研究者的關(guān)注［9,24］。ALDH2可以通過(guò)分解4-HNE和MDA等毒性醛類(lèi)物質(zhì)，抑制ROS的生成，發(fā)揮間接抗氧化的作用［10］。ALDH2還被證明通過(guò)調(diào)控線粒體分裂和融合，抑制氧化應(yīng)激水平，從而減輕心肌缺血再灌注損傷［25］。本實(shí)驗(yàn)觀察到激活A(yù)LDH2可以提高線粒體結(jié)構(gòu)的完整性，降低氧化應(yīng)激指標(biāo)4-HNE和MDA的含量，提高SOD、CAT的活性。這說(shuō)明ALDH2可能通過(guò)減輕ALI小鼠線粒體損傷，調(diào)控氧化應(yīng)激水平。接下來(lái)本研究觀察了ALDH2對(duì)線粒體分裂與融合相關(guān)蛋白的調(diào)控及對(duì)肺內(nèi)皮屏障功能的影響，結(jié)果顯示：激活A(yù)LDH2不僅抑制線粒體分裂蛋白Drp1和Fis1的表達(dá)、促進(jìn)線粒體融合蛋白Mfn2和OPA1的表達(dá)，還可以降低LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠的肺組織水腫和內(nèi)皮屏障的通透性，促進(jìn)緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)，維持緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性。這些結(jié)果表明，激活A(yù)LDH2可以通過(guò)維持線粒體的動(dòng)力學(xué)平衡，抑制氧化應(yīng)激，在ALI時(shí)發(fā)揮肺內(nèi)皮屏障的保護(hù)作用。

為進(jìn)一步分析ALDH2改善ALI小鼠的肺內(nèi)皮屏障功能與調(diào)控線粒體動(dòng)力學(xué)平衡之間的關(guān)系，本研究還觀察了抗氧化通路Nrf2/HO-1的表達(dá)。既往研究顯示，Nrf2相關(guān)信號(hào)通路在抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的組織損傷中發(fā)揮著不可替代的作用，被證明可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷［26］。同時(shí)，Nrf2也是線粒體動(dòng)力學(xué)平衡的重要調(diào)節(jié)因子，一旦Nrf2被激活，它可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，并轉(zhuǎn)錄激活大量負(fù)責(zé)線粒體融合和分裂的抗氧化基因如HO-1，以維持線粒體功能［27］。而ALDH2作為Nrf2通路的激活劑，在各種疾病的細(xì)胞保護(hù)和抗凋亡作用中起著關(guān)鍵作用，這些保護(hù)作用與減輕炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激有關(guān)［9,28］。ALDH2還通過(guò)激活Nrf2/HO-1抗氧化途徑，抑制了ROS的過(guò)度生成和線粒體損傷，對(duì)肝臟起到保護(hù)作用［13］。因此，我們研究了ALDH2是否通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路來(lái)減輕LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠的損傷。結(jié)果表明，激活A(yù)LDH2后，小鼠肺組織中Nrf2核蛋白和HO-1 蛋白表達(dá)明顯增加。而使用ALDH2 抑制劑Daidzin干預(yù)后，Nrf2核蛋白和HO-1蛋白的表達(dá)降低，線粒體分裂增多，融合減少，氧化應(yīng)激水平增加，加劇了肺內(nèi)皮屏障的損傷。我們推測(cè)ALDH2 可能以Nrf2/HO-1途徑依賴(lài)的方式發(fā)揮作用，但其確切機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。

綜上所述，本研究揭示了ALDH2通過(guò)Nrf2/HO-1途徑維持線粒體動(dòng)力學(xué)平衡，抑制氧化應(yīng)激損傷，從而減輕LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠的內(nèi)皮屏障功能障礙。