TMEM64在肝癌組織中高表達(dá)并促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲

曹丹萍，蔡娟，李艷娜，董潤雨，王智雄，左學(xué)良

皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院//弋磯山醫(yī)院1胃腸外科，2腫瘤內(nèi)科，安徽 蕪湖241001

肝癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率第6和死亡率第3的惡性腫瘤，我國更是肝癌的高發(fā)地區(qū)［1,2］。根據(jù)2022年我國癌癥中心的最新數(shù)據(jù)，肝癌在惡性腫瘤中的發(fā)病率位于第5，死亡率位于第2，5年生存率僅為14.1%［3］。大多數(shù)肝癌患者早期無癥狀，確診時已處于中晚期，失去最佳手術(shù)機(jī)會［4,5］。肝癌患者手術(shù)后復(fù)發(fā)率仍然較高，預(yù)后極差［6］。挖掘新的診斷標(biāo)志物和預(yù)后預(yù)測指標(biāo)對肝癌患者早期發(fā)現(xiàn)，制定個體化治療方案具有重要臨床研究價值。

跨膜蛋白（TMEMs）是一類能夠多次跨越細(xì)胞膜并參與調(diào)控細(xì)胞間信號交流和傳遞的蛋白家族，人類的許多疾病的發(fā)生和進(jìn)展都與跨膜蛋白的功能異常有關(guān)［7］。目前，已發(fā)現(xiàn)較多的TMEMs在惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)［8-10］，參與調(diào)控腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)通路［11-13］。TMEM64是一個位于8號染色體上的編碼基因，屬于跨膜蛋白家族的成員。目前對于TMEM64的研究較少，TMEM64在肝癌中的功能未見報(bào)道，有待進(jìn)一步探索。

本研究通過分析癌癥基因組圖譜（TCGA）和基因型組織表達(dá)項(xiàng)目（GTEx）數(shù)據(jù)庫中TMEM64在肝癌中的表達(dá)情況和預(yù)后預(yù)測價值，探究TMEM64對肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響，為肝癌治療提供新的分子靶標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫（n=377）和GTEx數(shù)據(jù)庫中收集了肝癌患者的mRNA 表達(dá)譜和臨床數(shù)據(jù)。3 級HTSeq FPKM 格式數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為每百萬次讀取的轉(zhuǎn)錄本（TPM）。使用UCSC Xena3數(shù)據(jù)庫和GTEx數(shù)據(jù)庫中獲得TPM格式的RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

使用Kaplan-Meier曲線和log-rank檢驗(yàn)來比較患者生存差異，并將截止值設(shè)置為TMEM64的中位表達(dá)水平。單變量和多變量Cox回歸分析用于評估臨床變量對患者結(jié)局的影響。單變量Cox回歸分析中的預(yù)后變量P＜0.05被納入多變量Cox分析。

R軟件包DESeq2用于分析和計(jì)算差異表達(dá)基因（DEGs），并將調(diào)整后的P值設(shè)置為＜0.05，|log2倍變化（FC）|＞1作為DEG的閾值。使用Spearman相關(guān)分析評估前10位DEGs表達(dá)與TMEM64之間的相關(guān)性。

使用R包GOplot和R包c(diǎn)lusterProfiler 對DEGs進(jìn)行了功能富集分析，包括GO、KEGG通路富集分析和GSEA基因集富集分析，調(diào)整后的P＜0.05和錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.25被視為統(tǒng)計(jì)上顯著富集的功能或通路。

R軟件包rms用于構(gòu)建nomogram和calibration曲線。通過Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型評估肝癌患者總生存時間（OS）的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)合TMEM64 的表達(dá)水平與多因素Cox 回歸模型中的臨床變量，構(gòu)建nomogram來預(yù)測1年、3年和5年的肝癌患者總生存率，使用calibration曲線評估列線圖的效能。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 組織樣本 組織標(biāo)本來自2021年3月～2022年3月在我院行肝癌切除術(shù)的患者的腫瘤組織及鄰近正常組織共20例。本研究患者納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后病理確診為肝細(xì)胞癌；術(shù)前均未接受放療、化療、靶向或免疫治療，所有患者均已簽署知情同意書。本研究經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（弋磯山醫(yī)院）倫理委員會批準(zhǔn)（2021倫審研12號）。

1.2.2 細(xì)胞和試劑 正常肝細(xì)胞QSG-7701和肝癌細(xì)胞株Hep3B、SMMC-7721、HCCLM3、Huh7 來自中國科學(xué)院細(xì)胞資源中心?？俁NA提取試劑TRIzol和轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000（Invitrogen），RT-qPCR試劑盒來（北京天根生化科技有限公司）。Transwell小室和實(shí)驗(yàn)中使用的6 孔板、96 孔板均（Corning），基質(zhì)膠（BD）。Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒（上海貝博生物有限公司），5-Ethynyl-2'-deoxyuridine（EdU）試劑盒則（廣州銳博生物科技有限公司）。TMEM64 的siRNA和過表達(dá)TMEM64 的質(zhì)粒委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)構(gòu)建，其中敲低TMEM64的siRNA序列為：si-TMEM64#1：5'-GCUAUUGUAGCUUGU GAAATT-3'，si-TMEM64#2：5'-CCUACCCAGCUUC UGAAUUTT-3'。Western blot實(shí)驗(yàn)中主要的試劑如下：BCA 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、TMEM64 抗 體（Abcam）、β-tubulin（Cell Signaling Technology）以及超敏ECL發(fā)光液（Abbkine）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 細(xì)胞使用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基（含100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素），置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）中培育。待細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%，按照LipofectamineTM3000說明書步驟，將siRNAs 分別轉(zhuǎn)染至HCCLM3中，并分組為si-NC（對照組）、si-TMEM64#1（敲低組1）和si-TMEM64#2（敲低組2）；將空質(zhì)粒載體和過表達(dá)TMEM64質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)染至Huh7細(xì)胞中，并分組為vector（對照組）和TMEM64（過表達(dá)組）。轉(zhuǎn)染48 h后，分別使用RT-qPCR和Western blot 驗(yàn)證TMEM64敲低和過表達(dá)的效率，以及進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 RT-qPCR 采用TRIzol試劑從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA，接著使用FastKing一步法除基因組cDNA 第一鏈合成預(yù)混試劑合成cDNA，采用SuperReal熒光定量預(yù)混試劑將合成的cDNA在ABI QuantStudio3系統(tǒng)（Applied Biosystems）上進(jìn)行實(shí)時PCR擴(kuò)增，使用2-ΔΔct定量方法計(jì)算TMEM64與內(nèi)參GAPDH的相對表達(dá)量。其中TMEM64 的引物序列如下：Forward primer：5'-GGCGTGGCTGAGGTGAGAAA-3'；Reverse primer：5'-ATGAAGCCCACGACGAAGAG-3'。GAPDH的引物序列為：Forward primer：5'-AATCCCATCACCATC TTCC-3'；Reverse primer：5'-CATCACGCCACAGTT TCC-3'。

1.3.3 CCK-8 消化并離心轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞及對照組細(xì)胞，按照2×103/孔種于96孔板中，并于第24、48、72和96 h使用酶標(biāo)儀檢測其在450 nm波長處的吸光度值。在每次檢測前2 h在每孔中加入10 μL的CCK-8試劑，避光置于培育箱中。最后計(jì)算不同時間段細(xì)胞的增殖水平。

1.3.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染48 h后的每組細(xì)胞按照2×103/孔均勻種植于新的6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培育12 d。收集細(xì)胞時使用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色1 h，最后拍照并統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞增殖的水平。

1.3.5 EdU實(shí)驗(yàn) 使用銳博生物的EdU試劑盒來檢測細(xì)胞的增殖能力。將轉(zhuǎn)染48 h后的實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞按照6000/孔均勻種于96孔板中，加入試劑A孵育2 h后，將細(xì)胞固定在4%多聚甲醛中，用Apollo染色液染色30 min，之后用Hoechst33342對細(xì)胞核進(jìn)行30 min染色。最后在熒光顯微鏡（200×）下對增殖的陽性細(xì)胞進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)。

1.3.6 Transwell實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)需提前將Transwell小室的上室中均勻鋪入50μL的基質(zhì)膠，將轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞及其對照組細(xì)胞重懸于無血清培養(yǎng)基中，重新計(jì)數(shù)，按照5×104/孔細(xì)胞移植到小室的上室，下室中則加入600μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培育24 h，用含4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色1 h。最后在倒置顯微鏡下拍照、統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞遷移的百分比。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)則不需鋪基質(zhì)膠，其他步驟同細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染24 h后的每組細(xì)胞按照一定密度均勻鋪入6孔板中（以過夜后貼壁細(xì)胞密度達(dá)80%左右為宜），第2天使用黃色槍頭在六孔板中劃出一條直線，PBS清洗后置于電子顯微鏡下拍照記錄0 h劃痕的面積。將六孔板中加入2 mL無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培育，48 h后再次在倒置顯微鏡下拍照記錄劃痕愈合的面積，分析計(jì)算愈合面積的比率并評估兩組細(xì)胞的遷移能力。

1.3.8 Western blot實(shí)驗(yàn) 從分組處理后細(xì)胞中裂解并提取總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，加入適量的上樣緩沖液煮沸10 min。每組樣本取等量的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉2 h后，在4 ℃下將PVDF膜與按比例稀釋的一抗孵育過夜。TBST沖洗3次，繼續(xù)將PVDF膜與二抗在室溫下孵育2 h，最后使用超敏ECL顯色液進(jìn)行曝光和顯色。

1.3.9 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 采用冰凍切片進(jìn)行雙標(biāo)法免疫熒光實(shí)驗(yàn)。將肝癌組織冰凍切片取出后室溫晾干15 min，PBS洗3次，每次5min。使用3%BSA室溫封閉1 h，然后加入TMEM64和CD8（Abcam）一抗4 ℃孵育過夜。PBS清洗3次，10 min/次，分別加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗室溫孵育1 h。細(xì)胞核利用DAPI染色。滴加抗熒光淬滅劑封片后在激光共聚焦顯微鏡下拍照。

1.3.10 CD8+T細(xì)胞檢測分析 將新鮮提取的人外周血單個核淋巴細(xì)胞（PBMC）活化后重新計(jì)數(shù)，并與轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞及其對照組細(xì)胞按照10∶1的比例共培養(yǎng)。收集細(xì)胞后用不同通道熒光標(biāo)記的CD45、CD3和CD8抗體（BioLegend）對細(xì)胞進(jìn)行染色，并在室溫下與細(xì)胞一起孵育1 h。通過流式細(xì)胞術(shù)分析CD8+T淋巴細(xì)胞比例。

1.3.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 8.0軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組和對照組間計(jì)數(shù)結(jié)果采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行分析評估，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMEM64在肝癌和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平

基于TCGA數(shù)據(jù)庫，分析了TMEM64在泛癌中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TMEM64在多種惡性腫瘤中均呈現(xiàn)高表達(dá)（P＜0.001，圖1A）。此外，TMEM64在肝癌中的表達(dá)水平在非配對樣本和配對樣本中均顯著高于鄰近的癌旁組織（P＜0.001，圖1B、C）。受試者工作特征曲線（ROC）表明TMEM64具有良好的肝癌診斷價值，ROC曲線下的區(qū)域（AUC）為0.723（95%CI=0.672-0.773，圖1D）。RT-qPCR結(jié)果表明，TMEM64在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)水平也顯著高于正常肝細(xì)胞系（P＜0.01，圖1E）。

2.2 Kaplan-Meier分析評估肝癌患者TMEM64的表達(dá)與預(yù)后的價值

根據(jù)TMEM64 表達(dá)的中位數(shù)，肝癌患者被分為TMEM64高表達(dá)組（n=187）和低表達(dá)組（n=186）。如圖2A示，與TMEM64低表達(dá)組相比，TMEM64高表達(dá)組患者OS 較差（OS：危險(xiǎn)比[HR]=1.58，95%CI=1.11-2.25，P=0.011）。多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析表明，TMEM64的表達(dá)水平是肝癌患者總生存時間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OS：危險(xiǎn)比[HR]=1.693，95%CI=1.087-2.638，P=0.02，圖2B，表1）。

表1 肝癌患者總生存期的單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析Tab.1 Univariate and multivariate analyses of overall survival in patients with Hepatocellular Carcinoma

圖2 Kaplan-Meier方法評估肝癌患者TMEM64表達(dá)的預(yù)后價值Fig. 2 Prognostic value of TMEM64 expression in patients with HCC assessed with the Kaplan-Meier method.A:Overall survival(OS)of patients with high-and low-expression of TMEM64 in HCC.B:Forest map of OS based on multivariate Cox analysis.

2.3 Kaplan-Meier 方法評估不同亞組肝癌患者中TMEM64表達(dá)水平的預(yù)后預(yù)測價值

與TMEM64低表達(dá)相比，TMEM64高表達(dá)肝癌患者預(yù)后在T1～T3、N0、M0、I～I(xiàn)II期、G1～G3、BMI＞25kg/m2、年齡＞60歲、體質(zhì)量＞70 kg以及男性亞組中明顯更差（P＜0.05，圖3）。

圖3 Kaplan-Meier方法評估肝癌患者不同亞組中TMEM64表達(dá)的預(yù)后預(yù)測價值Fig. 3 OS curves of TMEM64 expression levels in different subgroups of liver cancer patients.A-I: OS survival curves of T stage,N stage,M stage,Pathologic stage,Histologic grade,BMI＞25 kg/m2,Age＞60 years,Weight＞70 kg,and Gender subgroups between high-and low-TMEM64 patients with HCC.

2.4 TMEM64表達(dá)水平與肝癌組織中免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性

TMEM64 高表達(dá)組中肝癌組織中的NK 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞和pDCs 的富集分?jǐn)?shù)明顯低于TMEM64低表達(dá)組（圖4A～C）。TMEM64 的表達(dá)與NK 細(xì)胞（r=-0.138，P=0.007）、CD8+T細(xì)胞（r=-0.114，P=0.027）和pDCs（r=-0.321，P＜0.001）的免疫細(xì)胞浸潤水平呈負(fù)相關(guān)（圖4D～F）。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與TMEM64低表達(dá)的肝癌組織相比，TMEM64高表達(dá)的肝癌組織中CD8+T細(xì)胞腫瘤浸潤水平顯著降低（圖4G）。

圖4 TMEM64的表達(dá)與肝癌組織中免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性Fig. 4 Correlation of TMEM64 expression with immune infiltration level in HCC. A-C: Comparison of immune cell infiltration levels between high-and low-TMEM64 groups.D-F:Correlation between the relative enrichment of immune cells(NK cells,CD8+T cells and pDCs cells)and TMEM64 expression.G:Double-labeled immunofluorescence results indicate that the number of infiltrating CD8+T cells is decreased in HCC tissues with high expression of TMEM64.*P＜0.05,**P＜0.05,***P＜0.001 vs low TMEM64 expression group.

2.5 TMEM64相關(guān)的差異表達(dá)基因功能富集分析

比較TMEM64高表達(dá)組和低表達(dá)組的相關(guān)差異基因表達(dá)情況（圖5A），前10 個DEGs 為HS3ST4、MAGEA4、AC016717.2、ANKFN1、CYP11B2、SH3GL3、AC062015.1、PPDPFL、CCR3 和ISM2（圖5B）。GO富集分析顯示，DEGs顯著富集的生物過程包括化學(xué)突觸傳遞的調(diào)控、信號釋放、受體配體活動和經(jīng)突觸信號傳遞的調(diào)節(jié)等（圖5C）。KEGG通路富集分析表明，DEGs顯著富集的途徑包括神經(jīng)活性配體與受體的相互作用、Wnt信號通路和MAPK信號通路（圖5D）。GSEA 富集分析發(fā)現(xiàn)高TMEM64 表達(dá)組中Wnt/βcatenin、JAK/STAT3、KRAS和P53信號通路被顯著富集（圖5E）。

圖5 TMEM64相關(guān)的差異表達(dá)基因及功能富集分析Fig. 5 TMEM64-related differentially expressed genes (DEGs) and functional enrichment analysis of TMEM64 in HCC. A: Volcano map of the DEGs. B: Heat map of the correlation between TMEM64 expression and the top 10 differential genes.C-D:GO enrichment analysis and KEGG enrichment analysis of the DEGs.E:Gene set enrichment analysis(GSEA)of the DEGs.

2.6 構(gòu)建和驗(yàn)證基于TMEM64 表達(dá)的nomogram 和calibration曲線

根據(jù)多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析中有關(guān)的臨床變量（TMEM64的表達(dá)水平和T分期），生成了基于OS獨(dú)立因素的Nomogram來預(yù)測患者1年、3年和5年的預(yù)后情況。在Nomogram中，總點(diǎn)數(shù)越高，預(yù)后越差（圖6A）。Nomogram的自舉校正C指數(shù)為0.644（95%CI=0.618-0.67），該模型對肝癌患者的OS具有中等的預(yù)測準(zhǔn)確性，其中患者5年OS的模型準(zhǔn)確性和一致性預(yù)測效能較好（圖6B～D）。

圖6 預(yù)測肝癌患者1年、3年和5年總生存率的nomogram和calibration曲線Fig. 6 Nomogram and calibration curves for predicting OS at 1,3 and 5 years in patients with HCC.A:A nomogram for predicting 1-,3-and 5-year OS of HCC patients.B-D:Calibration curves for 1-,3-and 5-year nomogram predictions.

2.7 敲低TMEM64能抑制HCCLM3細(xì)胞的增殖和侵襲

利用siRNA在TMEM64表達(dá)相對較高的肝癌細(xì)胞HCCLM3 中敲低TMEM64，使用RT-qPCR 和Western blots 驗(yàn)證si-TMEM64#1 和si-TMEM64#2 的敲低效率（圖7A、B）。細(xì)胞克隆形成、CCK-8和EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低TMEM64能明顯抑制HCCLM3細(xì)胞的增殖（圖7C-E）。細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，與對照組相比，si-TMEM64#1 和si-TMEM64#2 組 中HCCLM3細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低（圖7F、G）。將轉(zhuǎn)染后的HCCLM3細(xì)胞與活化的PBMC共培養(yǎng)，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD8+T 細(xì)胞比例，結(jié)果顯示敲低TMEM64的肝癌細(xì)胞中浸潤的CD8+T細(xì)胞比例增加（圖7H）。

圖7 敲低TMEM64能抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲Fig. 7 TMEM64 knockdown inhibits proliferation and invasion of HCC cells.A,B:RT-qPCR and Western blotting for detecting TMEM64 expression levels in HCCLM3 cells transfected with si-TMEM64#1 and si-TMEM64#2.C,D:Colony formation assay and CCK-8 assay for assessing the effect of TMEM64 knockdown on HCCLM3 cell proliferation.E:EdU assay for assessing the effect of TMEM64 knockdown on proliferation of HCCLM3 cells (×200). F, G: Migration and invasion of HCCLM3 cells with TMEM64 knockdown assessed by Transwell assay and wound healing assay (×200). H: Flow cytometry for detecting the proportion of infiltrated CD8+T cells in PBMC co-cultured with transfected HCCLM3 cells.**P＜0.01,***P＜0.001.

2.8 過表達(dá)TMEM64能促進(jìn)Huh7細(xì)胞的增殖和侵襲

在TMEM64表達(dá)相對較低的肝癌細(xì)胞Huh7中過表達(dá)TMEM64。與對照組相比，轉(zhuǎn)染TMEM64的過表達(dá)質(zhì)粒后，Huh7細(xì)胞中TMEM64的表達(dá)水平顯著增高（圖8A、B）；CCK-8、細(xì)胞克隆形成和EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)TMEM64能顯著促進(jìn)Huh7細(xì)胞的增殖（圖8C～E）。細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，與對照組相比，過表達(dá)TMEM64組中Huh7細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)（圖8F、G）。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，將轉(zhuǎn)染后的Huh7細(xì)胞與活化的PBMC共培養(yǎng)，過表達(dá)TMEM64組的肝癌細(xì)胞中浸潤的CD8+T細(xì)胞比例減少（圖8H）。

圖8 過表達(dá)TMEM64能促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲Fig. 8 TMEM64 overexpression promotes proliferation and invasion of HCC cells.A, B: RT-qRCR and western blotting for verifying TMEM64 overexpression in Huh7 cells.C,D:Colony formation assay and CCK-8 assay for measuring the effect of TMEM64 overexpression on Huh7 cell proliferation. E: EdU assay for verifying the effect of TMEM64 overexpression on Huh7 cell proliferation (× 200). F, G: Wound healing assay and Transwell assay for evaluating migration and invasion of Huh7 cells with TMEM64 overexpression(×200;scale bar=200 μm). H: Flow cytometry for detecting the proportion of infiltrated CD8+T cells in PBMC cocultured with transfected Huh7 cells.**P＜0.01,***P＜0.001.

3 討論

TMEMs的表達(dá)失調(diào)與腫瘤生長轉(zhuǎn)移［14］及預(yù)后［15］密切相關(guān)，在肝癌中TMEM106C被發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中高表達(dá)，可作為肝癌預(yù)后預(yù)測標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)［16］。有研究報(bào)道TMEM64可以通過調(diào)節(jié)Wnt3a的分泌調(diào)控前列腺癌的進(jìn)展［17］。TMEM64是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的七次跨膜蛋白，本研究中首次證實(shí)TMEM64是肝癌的潛在預(yù)后指標(biāo)。

本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析了TMEM64在肝癌中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TMEM64在肝癌中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，并且高表達(dá)的TMEM64與肝癌患者不良總生存時間相關(guān)。進(jìn)一步通過Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)TMEM64的表達(dá)水平是肝癌患者總生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。我們得出新的結(jié)論，TMEM64可能是肝癌不良預(yù)后和臨床轉(zhuǎn)移的預(yù)測的指標(biāo)。近年來，列線圖在惡性腫瘤患者的風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后預(yù)測中應(yīng)用較廣泛［18,19］。Nomogram圖可使用現(xiàn)有的臨床信息，將復(fù)雜的回歸分析結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)橹庇^的可視化圖形［18,20］。為了更準(zhǔn)確、更科學(xué)的計(jì)算肝癌患者的總體生存概率，本研究構(gòu)建了基于OS獨(dú)立因素列線圖預(yù)后模型來預(yù)測患者1年、3年和5年的預(yù)后情況，更直觀的展示了肝癌患者的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。本研究中的校準(zhǔn)曲線也表明：預(yù)測模型與實(shí)際結(jié)果相符，其中患者5年的預(yù)測風(fēng)險(xiǎn)最接近實(shí)際結(jié)果。

腫瘤細(xì)胞生長被浸潤免疫細(xì)胞包圍的復(fù)雜微環(huán)境中［21］，腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的預(yù)后價值已在實(shí)體惡性腫瘤中得到證實(shí)［22,23］。浸潤免疫細(xì)胞也被證明可以預(yù)測對新輔助化療和免疫檢查點(diǎn)抑制（ICI）治療的反應(yīng)［24,25］。因此，篩查肝癌浸潤性免疫細(xì)胞可輔助ICI治療，并對ICI治療有潛在的預(yù)測價值。本研究通過GSEA富集分析評估免疫細(xì)胞在肝癌中的相對富集分?jǐn)?shù)，并研究TMEM64的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤水平之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，TMEM64高表達(dá)與NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、和pDCs的浸潤呈負(fù)相關(guān)。有研究報(bào)道，TMEM205與CD8+T的浸潤呈正相關(guān)，并通過降低免疫抑制細(xì)胞水平和促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境的浸潤來改善肝癌患者的預(yù)后［9］。TMEM60的異常高表達(dá)影響了巨噬細(xì)胞、Tregs等免疫細(xì)胞的分布，增加了腫瘤的異質(zhì)性，促進(jìn)了腫瘤對治療的抵抗，導(dǎo)致患者預(yù)后不良［26］。CD8+T細(xì)胞通常被認(rèn)為是抗腫瘤免疫的主要介質(zhì)［21］。CD8+T細(xì)胞在活化后通常會分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞滲透到腫瘤核心或侵襲部位，在殺傷癌細(xì)胞中起重要作用。作為天然免疫效應(yīng)細(xì)胞，激活的pDCs和NK細(xì)胞都被證明可以阻止肝癌細(xì)胞的生長［27］。本研究中采用雙標(biāo)記免疫熒光法驗(yàn)證肝癌組織中TMEM64的表達(dá)與CD8+T細(xì)胞浸潤關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TMEM64高表達(dá)的肝癌組織中CD8+T細(xì)胞腫瘤浸潤水平顯著降低。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，將轉(zhuǎn)染后的Huh7 細(xì)胞與活化的PBMC 共培養(yǎng)，過表達(dá)TMEM64組的肝癌細(xì)胞中浸潤的CD8+T細(xì)胞比例減少。這些結(jié)果表明，TMEM64的過度表達(dá)可能通過調(diào)節(jié)浸潤性T細(xì)胞的水平來影響肝癌的進(jìn)展和預(yù)后。

Sébastien等［28］闡述TMEM家族的蛋白是癌細(xì)胞傳播的潛在貢獻(xiàn)者，強(qiáng)調(diào)了TMEMs在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)中的影響。Shen等［29］發(fā)現(xiàn)，敲低TMEM45B通過JAK2/STAT3途徑抑制胃癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲。Zhang等［30］發(fā)現(xiàn)，TMEM116可通過PDK1/AKT/FOXO3A信號通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和腫瘤的轉(zhuǎn)移。Chen等［31］發(fā)現(xiàn)，TMEM196通過Wnt/β-catenin信號通路抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展。TMEMs已被證實(shí)參與多種調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的通路，而TMEM64在肝癌中的潛在機(jī)制暫無相關(guān)研究，針對TMEM64可能參與調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的信號通路，本研究中進(jìn)行KEGG和GSEA富集分析發(fā)現(xiàn)高TMEM64 表達(dá)組中Wnt/β-catenin、JAK/STAT3、KRAS和P53信號通路被顯著富集，這些結(jié)果我們將在后續(xù)研究中進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為了進(jìn)一步探究TMEM64在肝癌細(xì)胞中是否具有生物學(xué)功能，本研究首次從細(xì)胞學(xué)水平探究TMEM64對肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響，發(fā)現(xiàn)敲低TMEM64 能明顯抑制HCCLM3細(xì)胞的增殖和侵襲；而過表達(dá)TMEM64可促進(jìn)Huh7細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究通過生物信息學(xué)分析和體外實(shí)驗(yàn)對TMEM64在肝癌的表達(dá)水平、預(yù)后及生物學(xué)功能進(jìn)行研究，在后續(xù)研究中我們將深入探索其調(diào)控肝癌進(jìn)展的分子機(jī)制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TMEM64在肝癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)升高，且其高表達(dá)水平與患者不良預(yù)后相關(guān)。TMEM64能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，可能參與調(diào)控肝癌的惡性進(jìn)展，有望成為肝癌診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。