脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2自限性抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化

陳梓鋒，李勝發(fā)，張祐鳴，楊婉雯，王婷

1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，廣東 廣州 511400；2南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院臨床研究中心，廣東 廣州 510260；3南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)，廣東 廣州510515

老年性骨質(zhì)疏松（SOP）主要原因在于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)成骨分化減少，導(dǎo)致成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成（骨合成代謝）嚴(yán)重減少，而目前臨床藥物主要作用于成骨細(xì)胞靶點(diǎn)的藥物很少［1］。甲狀旁腺激素激動劑-特立帕太主要通過增強(qiáng)成骨細(xì)胞形成以及抑制成骨細(xì)胞凋亡來起到抗骨質(zhì)疏松的作用［2］，但該藥是高鈣血癥患者禁用［3］，價格昂貴，長期使用會增加患骨肉瘤的風(fēng)險并且會損害皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致骨折風(fēng)險的進(jìn)一步增加［4］。雷諾昔芬屬于選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，通過促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收來起到抗骨質(zhì)疏松作用，但雷諾昔芬有增加中風(fēng)和靜脈血栓栓塞的風(fēng)險［5］。所以研究可以促進(jìn)BMSC成骨分化的靶點(diǎn)對于改善骨質(zhì)疏松的藥物研發(fā)起著重要意義。

脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2（Lcn2）也稱為中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，是一種25 000的分泌蛋白，可結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)小的疏水物質(zhì)［6］。Lcn2在成骨細(xì)胞和白色脂肪細(xì)胞有較高表達(dá)［7］，并在免疫細(xì)胞，肝細(xì)胞和腎小管細(xì)胞表達(dá)，其表達(dá)在病理狀態(tài)下上調(diào)［8］。Lipocalin-2是急性和慢性腎臟疾病、心力衰竭和肥胖相關(guān)醫(yī)學(xué)并發(fā)癥的功能性生物標(biāo)志物［9］。成骨細(xì)胞中過表達(dá)Lcn2的轉(zhuǎn)基因小鼠存在骨量減少［10］，且小鼠顱骨成骨細(xì)胞在模擬微重力條件下成骨分化減弱，而此時在多種基因中Lcn2的上調(diào)最明顯［11］，表明微重力條件下Lcn2可能參與成骨分化的抑制。在模擬微重力條件下，小鼠成骨細(xì)胞中出現(xiàn)Lcn2 基因的上調(diào)，而小鼠原代成骨細(xì)胞中過表達(dá)Lcn2則導(dǎo)致骨形成減低［12］。以上數(shù)據(jù)提示Lcn2在微重力條件下可能反過來抑制成骨分化，但在骨發(fā)育和老年性骨質(zhì)疏松的作用尚不清楚。Lcn2分泌蛋白對MSC成骨分化能力的作用值得研究，可為靶向Lcn2治療老年骨質(zhì)疏松提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

C3H/10T1/2（ATCC），MEM 培養(yǎng)基（Biological Industries)，血清（Biological Industries），ALP試劑盒（碧云天），Lcn2 RP（R&D），OSX 抗體、OCN（abcam），βactin、二抗抗兔、二抗抗鼠（北京銳抗），Lcn2 RP ELISA試劑盒（elabscience），Trizol（Takara），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara)，qPCR試劑盒（諾唯贊)。3月齡和16月齡雄性C57BL/6J小鼠購自廣東斯嘉景達(dá)生物科技有限公司，飼養(yǎng)于SPF級動物房。本研究動物實驗已通過論理委審核（L2018179）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) C3H/10T1/2細(xì)胞系使用MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，添加10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺、1%丙酮酸鈉以及1%雙抗，在37 ℃、CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2 d/次更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞百分百融合以后，加入成骨誘導(dǎo)液：終濃度50 μmol/L的維生素C，終濃度10 mmol/L的β-磷酸甘油和0.1 μmol/L終濃度地塞米松，成骨誘導(dǎo)7 d。對照組（control）為不加入Lcn2 RP；實驗組（Lcn2 RP）為在成骨誘導(dǎo)液中額外加入50、100、200、500 ng/mL的Lcn2 RP培養(yǎng)7 d。

1.2.2 堿性磷酸酶（ALP）染色 將C3H/10T1/2細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞完全融合后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)7 d后按ALP顯色試劑盒操作說明對細(xì)胞進(jìn)行固定、清洗、染色、掃描并記錄。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.3 實時定量熒光PCR 用Trizol法按說明書操作提取細(xì)胞RNA，測定濃度后并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參照諾唯贊試劑盒的說明書進(jìn)行。Lcn2和內(nèi)參基因β-actin引物序列如下：

Lcn2:Forward Primer:TGGCCCTGAGTGTCATGTG Reverse Primer:CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC β-actin: Forward Primer: GGCTGTATTCCCCTCCAT CG

Reverse Primer:CCAGTTGGTAACAATGCCATGT

1.2.4 免疫印跡實驗（Westem blot）將C3H/10T1/2 細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞完全融合后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)7 d后提取細(xì)胞總蛋白后進(jìn)行Westem blot實驗。蛋白上樣，10%SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜，5%BSA 封閉液封閉1 h，一抗置于4 ℃孵育過夜，洗膜3次，37 ℃孵育二抗1 h，洗膜3次，化學(xué)發(fā)光顯影。Image J軟件分析電泳條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，得出蛋白相對表達(dá)水平。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）小鼠麻醉后心臟取血，離心機(jī)3000 r/min離心10 min，獲取上清液即為小鼠血清。稀釋小鼠血清在Lcn2的ELISA試劑盒濃度范圍內(nèi)。將Lcn2的ELISA試劑盒從4℃冰箱取出，平衡至室溫。按說明書操作。酶標(biāo)儀檢測A值算出相應(yīng)血清的Lcn2濃度。

1.2.6 RNA測序 RNA樣品收集、建庫、測序參見課題組論文［13］，GEO:GSE169224。

1.2.7 染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）測序及數(shù)據(jù)分析 將C3H10T1/2 MSC細(xì)胞以前述成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)3 d（OB 3 d）或不作處 理（control），參照Cell Signaling Technology（CST）試劑盒裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞核提取染色質(zhì)，以H3K27AC和H3K9Me3抗體進(jìn)行免疫沉淀。純化的DNA委托諾禾致源公司進(jìn)行建庫和雙末端測序。簡要步驟：首先利用Bowtie2將所有reads匹配到小鼠基因組（mm10），而后以MACS2.0檢測peak并以Diffbind比較差異。以Deeptools將bam文件轉(zhuǎn)換成bw格式，而后以IGV進(jìn)行可視化展示。超級增強(qiáng)子通過ROSE［14］進(jìn)行定義和比較。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)采用Graphpad prism7統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗。當(dāng)P＜0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 老年骨質(zhì)疏松小鼠的松質(zhì)骨和血清中Lcn2的蛋白表達(dá)和分泌顯著升高

老年性骨質(zhì)疏松與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，本研究篩選了在16月齡雄鼠股骨遠(yuǎn)端中上調(diào)的氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白（圖1A）。iTRAQ-MS/MS結(jié)果顯示，16月齡的老年雄鼠的松質(zhì)骨中Lcn2蛋白表達(dá)相對于3月齡雄鼠明顯上調(diào)（P＜0.01，圖1B）。與此對應(yīng)，ELISA結(jié)果顯示16月齡老年雄鼠血清中Lcn2含量比3月齡對照（control）雄鼠明顯升高（P＜0.01，圖1C）。

圖1 老年鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨中Lcn2蛋白表達(dá)增強(qiáng)致血清中分泌增多Fig. 1 Increased expression of lipocalin 2(Lcn2)in the distal femoral cancellous bone of aged mice causes an increased serum level of Lcn2.A:Up-regulated proteins in 16-month-old male mice analyzed with GO_BP functional annotation with Clusterprofiler,which identified 4 oxidative stress-related proteins,including Lcn2.B:Specific fold upregulation of Lcn2.C:Serum level of Lcn2 in aged mice detected by ELISA(Mean±SD).**P＜0.01.

2.2 Lcn2劑量依賴地抑制C3H/10T1/2的成骨分化

與未加Lcn2重組蛋白的對照組相比，ALP染色結(jié)果和定量結(jié)果顯示加入50 ng/mL的Lcn2 RP未見明顯差異，加入100、200、500 ng/mL濃度Lcn2 RP后ALP表達(dá)減弱且有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05，圖2）。

圖2 Lcn2 RP對C3H/10T1/2細(xì)胞系成骨分化7d后ALP染色和定量結(jié)果Fig. 2 ALP staining of C3H/10T1/2 cells treated with recombinant lipocalin 2 protein(Lcn2 RP)at 7 days of osteogenic induction and quantitative analysis of the results(Mean±SD).*P＜0.05,**P＜0.01.

2.3 Lcn2劑量依賴地抑制早期和晚期關(guān)鍵成骨分化基因的表達(dá)

與ALP染色結(jié)果一致，Westem blot定量結(jié)果顯示成骨分化早期轉(zhuǎn)錄因子osterix（OSX）和成骨分化晚期標(biāo)志骨鈣素（OCN）在100、200、500ng/mL濃度的Lcn2 RP組中的表達(dá)減低，呈劑量依賴性且具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05，圖3）。

圖3 Lcn2 RP對C3H/10T1/2細(xì)胞系成骨分化7d后OSX和OCN蛋白表達(dá)的影響Fig. 3 Effect of Lcn2 RP treatment on protein expressions of OSX and OCN in C3H/10T1/2 cells induced for osteogenesis for 7 days.A:Western blots of OSX and OCN proteins.B:Quantitative results of the results(Mean±SD).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.4 MSC成骨分化中Lcn2的編碼基因出現(xiàn)超級增強(qiáng)子，mRNA表達(dá)隨之上調(diào)

在誘導(dǎo)成骨分化3 d（OB）后，Lcn2基因全域結(jié)合的H3K27AC信號明顯增強(qiáng)，而H3K9Me3信號則維持極低水平（圖4A），提示Lcn2 全域處于轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài)。ROSE軟件（利用H3K27AC信號計算）顯示成骨誘導(dǎo)后Lcn2 基因區(qū)域出現(xiàn)超級增強(qiáng)子（圖4A 上圖，底部）。RNA-seq結(jié)果證實Lcn2在C3H10T1/2成骨誘導(dǎo)后上調(diào)的倍數(shù)在所有基因中位列第4（圖4B、C）。與此一致，圖1B 中C3H10T1/2 成骨誘導(dǎo)后上調(diào)倍數(shù)最高的Zbtb16基因區(qū)域也在成骨誘導(dǎo)后出現(xiàn)超級增強(qiáng)子（圖4A下圖，底部）。結(jié)果數(shù)據(jù)描述Lcn2的mRNA水平在成骨誘導(dǎo)后急劇升高（P＜0.001，圖4D）。

圖4 成骨分化初期Lcn2基因全域出現(xiàn)超級增強(qiáng)子并促進(jìn)其mRNA表達(dá)Fig. 4 Detection of super-enhancers in whole lipocalin 2 (Lcn2) gene domain in the early stage of osteogenic differentiation.A:Signals of H3K27AC,H3K9Me3 and Input of the Lcn2 locus and the signals of H3K27AC and Input of the Zbtb16 locus displayed by IGV software. B: RNA-sequencing results of the top 10 up-regulated genes in C3H10T1/2 cells after 3 days of osteogenic induction (OB). C: Relative fold upregulation of Lcn2 (ordinate: RPKM). D: Real-time quantitative PCR showing relative expression of Lcn2 in C3H10T1/2 cells after 3 days of osteogenic induction.Data are presented as Mean±SD.*P＜0.05;***P＜0.001.

3 討論

骨質(zhì)疏松癥（OP）屬于代謝性骨病，其特征為骨量的丟失，成骨細(xì)胞減弱或破骨細(xì)胞增多引起的失衡使得骨脆性增加進(jìn)而容易發(fā)生骨折［15］。SOP老年性骨質(zhì)疏松癥是由衰老、氧化應(yīng)激等原因?qū)е鲁晒羌?xì)胞介導(dǎo)的骨形成（骨合成代謝）嚴(yán)重減少，繼發(fā)骨合成代謝（骨形成）/分解代謝（骨吸收）失衡，導(dǎo)致骨丟失及骨組織退行性變的代謝性疾病［16］。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有多種分化潛能，可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或軟骨細(xì)胞，在維持正常骨穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用［16］。

隨著年齡的增長，骨形成減少是由于MSCs分化為成骨細(xì)胞譜系受損，從而導(dǎo)致骨髓脂肪生成增加［17］。MSCs的減少和分化改變是老年骨質(zhì)疏松癥的主要原因之一［18］。老年性骨質(zhì)疏松主要與骨形成減少有關(guān)，骨基質(zhì)和礦物質(zhì)成分的變化也可能導(dǎo)致骨脆性增加［19］。老年C57BL/6J雄鼠的股骨遠(yuǎn)端/脛骨近端是分析老年性骨質(zhì)疏松的理想模型［17］。我們分析了16 月齡C57BL/6J雄鼠相對于3月齡雄鼠股骨遠(yuǎn)端總蛋白表達(dá)譜的差異［16］。

MSCs 向成骨細(xì)胞的命運(yùn)決定和分化過程中，osterix（OSX）是關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［20］。未成熟的成骨細(xì)胞分化成成熟的成骨細(xì)胞，表達(dá)堿性磷酸酶（ALP）以使細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成熟。ECM成熟后，基質(zhì)礦化通過各種成骨細(xì)胞標(biāo)志物，如骨鈣素OCN的表達(dá)以高度有序的過程發(fā)生。OSX可誘導(dǎo)ALP和OCN的表達(dá)［21］。衰老細(xì)胞穩(wěn)定停滯，產(chǎn)生復(fù)雜的分泌物如：促炎細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（SASP）［22］，并經(jīng)歷包括轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳、形態(tài)學(xué)和代謝改變在內(nèi)的特征性變化，衰老細(xì)胞主要通過SASP產(chǎn)生有害影響［23］。

分泌蛋白Lcn2在老年小鼠中股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨中表達(dá)進(jìn)一步增多，且在血清中分泌增強(qiáng)。由于老年小鼠的BMSC成骨分化相對于年輕小鼠顯著減弱，老年小鼠中表達(dá)增強(qiáng)的Lcn2可能反而抑制BMSC的成骨細(xì)胞分化。C3H/10T1/2 細(xì)胞系屬于一種可靠的MSCs細(xì)胞模型［24］。本研究進(jìn)一步使用不同濃度梯度的Lcn2 RP處理間充質(zhì)干細(xì)胞系C3H/10T1/2，證實了Lcn2導(dǎo)致其成骨分化減弱（體現(xiàn)在ALP活性減低及成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子OSX和OCN蛋白的表達(dá)減低）。

與本研究結(jié)果相符，Lcn2 水平升高與非脊柱骨折住院治療密切相關(guān)，特別是髖部、上肢以及肋骨和胸骨骨折［25］。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松女性血清Lcn2明顯高于對照組且有統(tǒng)計學(xué)差異，表明在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者中Lcn2升高［26］。血清中Lcn2的mRNA在骨質(zhì)疏松人群中表達(dá)升高［27］。Lcn2與衰老障礙有關(guān)。例如，它在大腦中的過度表達(dá)與高胰島素抵抗增加有關(guān)，從而導(dǎo)致肥胖［28］。Lcn2也被認(rèn)為是多發(fā)性硬化癥的標(biāo)志物［29］，并被描述為與氧化應(yīng)激、炎癥和神經(jīng)元脫髓鞘有關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知障礙［30］。RNA-seq監(jiān)測小鼠9個月、15個月和24個月時四種組織（包括大腦、血液、皮膚和肝臟），在衰老過程中Lcn2隨著年齡的增長而表達(dá)增加［31］。分析老年小鼠血清Lcn2蛋白升高原因，可能是由于衰老組織中Lcn2表達(dá)增強(qiáng)所致分泌增多。

為進(jìn)一步闡明Lcn2抑制成骨分化的可能作用機(jī)制，我們利用ChIP-seq 分析了誘導(dǎo)成骨分化前后C3H10T1/2間充質(zhì)干細(xì)胞Lcn2基因座位的修飾組蛋白結(jié)合情況，以期明確：成骨分化過程中，Lcn2基因區(qū)域的組蛋白修飾在表觀遺傳學(xué)層面對其表達(dá)的調(diào)控。既往研究顯示，H3K27AC富集于轉(zhuǎn)錄活化的啟動子和增強(qiáng)子區(qū)，而H3K9Me3則富集于轉(zhuǎn)錄抑制的基因區(qū)域。然而，Lcn2對于MSC的成骨分化過程卻是必須的，體現(xiàn)在如下幾個方面：MSC成骨分化的過程中，轉(zhuǎn)錄活化標(biāo)志-組蛋白H3K27AC在Lcn2基因啟動子區(qū)和基因體區(qū)的結(jié)合明顯增強(qiáng)，超級增強(qiáng)子（根據(jù)H3K27AC信號以ROSE軟件計算）覆蓋整個Lcn2基因座位并直接導(dǎo)致其表達(dá)水平急劇上升，提示Lcn2是間充質(zhì)干細(xì)胞正常成骨分化所必須的。相反，轉(zhuǎn)錄抑制標(biāo)志-組蛋白H3K9me3在這些區(qū)域的結(jié)合則持續(xù)處于較低水平。這些組蛋白修飾導(dǎo)致Lcn2的mRNA表達(dá)水平急劇升高。

Lcn2這種在發(fā)育階段促進(jìn)成骨分化，而在老年時分泌增多抑制成骨分化的現(xiàn)象提示Lcn2可能具有反向多效性［32］，即在發(fā)育時與成骨分化密切關(guān)聯(lián)，但在衰老時過度表達(dá)和分泌以自限性抑制MSC的成骨分化。

綜上所述，在成骨分化的早期，Lcn2基因的啟動子區(qū)和基因體形成超級增強(qiáng)子促進(jìn)Lcn2表達(dá)；而在老年小鼠中Lcn2表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)并反過來抑制成骨細(xì)胞分化，提示Lcn2在骨發(fā)育和骨衰老中的作用具有反向多效性。本研究為靶向Lcn2治療老年骨質(zhì)疏松提供了理論基礎(chǔ)，但還需進(jìn)一步明確血清升高的Lcn2和老年小鼠骨形成減弱之間的因果關(guān)系和具體作用機(jī)制。