ARHGAP21通過(guò)失活WNT信號(hào)通路抑制非小細(xì)胞肺癌中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

謝紫平，劉立威，房錦存，鐘星怡，林俊豪，陳逢生

1南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州 510315；2南方醫(yī)科大學(xué)附屬何賢紀(jì)念醫(yī)院，廣東 廣州511400

肺癌是全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域面臨的一項(xiàng)嚴(yán)重挑戰(zhàn)。它在腫瘤發(fā)病率排名第二，死亡率位居第一［1］。其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是最常見(jiàn)的肺癌類(lèi)型，占所有病例的80%～85%［2,3］。近年來(lái)肺癌在分子生物學(xué)領(lǐng)域的重要突破，尤其是在基因和表觀遺傳學(xué)的研究中，為我們理解它的發(fā)生機(jī)制、改善診斷手段和研發(fā)新型靶向、免疫治療策略提供了新的可能。此外，還可能通過(guò)尋找新的腫瘤標(biāo)志物，幫助我們提高肺癌的早期診斷能力［4-6］。這種現(xiàn)代化精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的治療方式，正在改變我們對(duì)肺癌的認(rèn)識(shí)和治療策略，也能為患者帶來(lái)更大的希望。

RhoGTPases是Ras超家族的一個(gè)亞家族，它們?cè)诩?xì)胞骨架、細(xì)胞黏附和遷移等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［7-9］。ARHGAP21是一種RhoGTPase激活蛋白，它通過(guò)加速RhoGTPase的GTP水解，負(fù)性調(diào)節(jié)RhoGTPase的活性［10］。ARHGAP21被報(bào)道參與調(diào)控多種腫瘤。Carles等［11］研究表明，ARHGAP21在頭頸鱗癌中高表達(dá)。Bigarella 等［12］發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，ARHGAP21 與FAK 相互作用以抑制細(xì)胞遷移和侵襲。Lazarini等［13］發(fā)現(xiàn)，缺乏ARHGAP21可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞遷移并減少細(xì)胞增殖?，F(xiàn)有關(guān)于ARHGAP21的研究主要集中在細(xì)胞骨架重組和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)動(dòng)態(tài)性方面的作用。然而，這些研究并未全面揭示ARHGAP21在生物體內(nèi)的具體功能。尤其是在肺癌中，尚未有人深入研究。因此，ARHGAP21在肺癌中發(fā)揮的生物功能仍需進(jìn)一步探索。另一方面，盡管有研究報(bào)道ARHGAP21在一些腫瘤中可能起抑癌因子的作用，但其在肺癌遷移和轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制尚不清楚。我們通過(guò)生物信息學(xué)分析首次關(guān)注到ARHGAP21與破壞復(fù)合物之間的關(guān)系。這一發(fā)現(xiàn)為我們提供了一種全新的角度，有助于更深入地理解ARHGAP21，特別是其在NSCLC的作用機(jī)制，也可能為肺癌的治療提供新的靶點(diǎn)，具有重要的研究意義。

1 材料和方法

1.1 材料

肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299、PC-9、H1975、H322、H460和人支氣管上皮細(xì)胞系（16HBE）均來(lái)自南方醫(yī)科大學(xué)。肺癌組織芯片（HLugA180Su04，上海芯超），并得到倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)（YB M-05-02）。3～5周齡的BALB/c裸鼠（雌性，謹(jǐn)為生物）。動(dòng)物研究由南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：2022-070）。DMEM、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco）；Lipofectamine 3000（賽默飛）；細(xì)胞總RNA提取試劑盒（福際生物）；TB Green Premix Ex Taq II 試劑盒、Prime Script RT試劑盒（寶日醫(yī)生物）；10%凝膠試劑盒（雅酶）；免疫組化檢測(cè)試劑盒（PV9000，中杉金橋）；肺癌組織芯片（HLugA180Su04，芯超生物）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299、PC-9、H1975、H322、H460和人支氣管上皮細(xì)胞系（16HBE）均在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所有細(xì)胞均在37 ℃和5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞狀態(tài)、更換新鮮培養(yǎng)基、當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代操作。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 接種合適數(shù)量的細(xì)胞，使用Lipofectamine 3000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)ARHGAP21的表達(dá)水平。

1.2.3 ARHGAP21敲低表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建 使用上海和元生物科技有限公司設(shè)計(jì)包裝的敲低ARHGAP21慢病毒和空載體慢病毒，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。使用含有2 mg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。病毒含有熒光素酶和綠色熒光蛋白，可用于觀察動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中肺轉(zhuǎn)移瘤的情況。

1.2.4 RT-qPCR 使用細(xì)胞總RNA提取試劑盒提取總RNA，隨后使用Prime Script RT試劑盒對(duì)RNA樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。最后使用TB Green Premix Ex Taq II 試劑盒在Light Cycler 480 II系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。引物序列如表1所示。

表1 本研究所使用的引物序列Tab.1 Primer sequences used in this study

1.2.5 Western blot檢測(cè) 蛋白質(zhì)樣本用十二烷基硫酸鈉（SDS）處理后存儲(chǔ)在-80 ℃冰箱中。使用10%凝膠試劑盒進(jìn)行電泳，并使用BIO-RAD轉(zhuǎn)膜機(jī)將樣品轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。使用5%脫脂奶粉封閉膜，并根據(jù)分子大小裁成適當(dāng)?shù)臈l帶。在4 ℃的環(huán)境下，將條帶置于搖床振蕩過(guò)夜孵育12 h。隨后使用相應(yīng)的二抗孵育條帶。最后向條帶中加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑，并使用MiniChemi化學(xué)發(fā)光成像與分析系統(tǒng)顯影條帶。本文使用的抗體包括anti-ARHGAP21（22183-1-AP）、anti-N-cadherin（66219-1-Ig）、anti-GAPDH（10494-1-AP）、Anti-Ubiquitin（10201-2-AP）和anti-β-Catenin（51067-2-AP）（武漢三鷹）；anti-GSK3β (A6164)、anti-AXIN1（A16019）抗體（愛(ài)博泰克生物）；Anti-APC（2504S，CST）。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移取1×105個(gè)細(xì)胞，接種在上室中，上室底部為8μm孔徑的膜。往上室加入適量無(wú)血清培養(yǎng)基，往下室加入適量含10%胎牛血清的RPMI 1640。于37 ℃、5%CO2的條件下孵育8 h，等待細(xì)胞通過(guò)上室的孔隙遷移至下室。使用4%的多聚甲醛對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定。使用結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞染色，最后通過(guò)顯微鏡觀察遷移的細(xì)胞數(shù)量.

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 首先在六孔板中接種適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞，等待細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿，然后使用無(wú)酶的移液槍頭在細(xì)胞皿上水平豎直劃若干條直線，最后觀察和分別拍攝0、24、48和72 h后劃痕處的缺口愈合情況。

1.2.8 裸鼠模型構(gòu)建 選擇3～5周齡的BALB/c裸鼠（雌性）。將H1299-shNC、H1299-shARHGAP21細(xì)胞通過(guò)尾靜脈分別注射到對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的裸鼠體內(nèi)，構(gòu)建體內(nèi)異種移植轉(zhuǎn)移模型（6只/組，注射細(xì)胞2.5×106/只）。在腫瘤細(xì)胞注射后的第5周，通過(guò)腹腔注射熒光素鈉鹽（150 mg/kg）在活體成像儀中檢測(cè)裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況。隨后，將裸鼠處死，收集肺組織并在熒光鏡下拍照。最后，將裸鼠肺組織固定在4%的多聚甲醛中，進(jìn)行石蠟包埋，并切成3 μm厚的切片。

1.2.9 免疫共沉淀和蛋白泛素水平檢測(cè) 取1×107細(xì)胞并用含磷酸酶和蛋白酶抑制劑的IP裂解緩沖液裂解。收集細(xì)胞裂解物的上清液并與抗β-catenin抗體或正常兔IgG抗體在搖床上于4 ℃下孵育24 h。磁珠用洗滌緩沖液洗滌兩次，隨后與蛋白質(zhì)抗體混合物一同置于室溫條件下的搖床上孵育30 min。將混合物用磁珠分離并用洗滌緩沖液清洗4次。將清洗后的磁珠沉淀物加入30 μL SDS，并在95 ℃下變性10 min。收集磁珠分離后的上清液。待后續(xù)進(jìn)行Western blot檢測(cè)，使用抗泛素抗體來(lái)檢測(cè)IP樣品的泛素化水平。

1.2.10 免疫組織化學(xué)染色 使用免疫組化檢測(cè)試劑盒進(jìn)行肺癌組織芯片的染色，經(jīng)過(guò)脫蠟、抗原修復(fù)的操作隨后阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、孵育一抗、孵育反應(yīng)增強(qiáng)液、孵育酶標(biāo)二抗，最后使用DAB顯色。芯片染色結(jié)果評(píng)分＜4和≥4分別定義為陰性和陽(yáng)性。此外，對(duì)于癌組織，0-6分和＞6分的評(píng)分分別表示低表達(dá)和高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個(gè)體外實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行了3次獨(dú)立的重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間分析。采用Kaplan-Meier生存分析以O(shè)S，PFS和DFS為觀測(cè)指標(biāo)。使用Fisher精確檢驗(yàn)評(píng)估ARHGAP21表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用GraphPad Prism6軟件進(jìn)行，檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARHGAP21在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)下調(diào)

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示，肺癌組織中ARHGAP21的mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.001，圖1A～F），ARHGAP21的蛋白質(zhì)水平也有所下降（P＜0.001，圖1G）。肺癌組織芯片免疫組化染色（圖1H）結(jié)果顯示在非配對(duì)樣本（P＜0.01，圖1I）和配對(duì)樣本（P＜0.05，圖1J）中ARHGAP21在肺癌組織中表達(dá)水平降低。Western-blot蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示在大多數(shù)NSCLC細(xì)胞系（A549、PC-9、H1975、H460）中ARHGAP21的表達(dá)較正常人支氣管上皮細(xì)胞低（圖1K）。

圖1 ARHGAP21在非小細(xì)胞癌中被下調(diào)Fig. 1 ARHGAP21 is downregulated in NSCLC.A: Heat map of tissue type and ARHGAP21 expression. B-F:Analysis of the correlation of ARHGAP21 mRNA expression with tissue type,pathologic stage,T stage,N stage,M stage based on data from the TCGA database. G: Analysis of correlation between ARHGAP21 protein expression and tissue type based on data from the CPTAC database. H-J: Immunohistochemical (IHC) staining of tissue microarrays and statistical analysis of corresponding immunohistochemical staining scores.The tissue microarray included 77 tumor tissues and 71 normal tissues,66 of which were paired (scale bar: 50 μm). K: Western blotting of ARHGAP21 expression in normal bronchial epithelial cell line (16HBE) and NSCLC cell lines(A549,H1299,PC-9,H1975,H322,and H460).***P＜0.001 vs Normal.

2.2 ARHGAP21的下調(diào)與NSCLC的不良預(yù)后相關(guān)

KM-plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，ARHGAP21的下調(diào)與更短的總生存時(shí)間有關(guān)（P＜0.01，圖2A）［14］。組織芯片預(yù)后信息分析結(jié)果顯示，ARHGAP21的表達(dá)與年齡、性別、T分期、N分期、病理分期、組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)之間沒(méi)有顯著相關(guān)性（表2）。然而，高表達(dá)ARHGAP21的患者具有更長(zhǎng)的總生存期（P＜0.05，圖2B）。單因素COX回歸分析表明，ARHGAP21的下調(diào)是患者的獨(dú)立不良因素（圖2C），盡管多因素COX 回歸分析中ARHGAP21下調(diào)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但尚不能排除混雜因素的影響（圖2D）。

圖2 ARHGAP21的下調(diào)與預(yù)后不良有關(guān)Fig. 2 ARHGAP21 downregulation of was associated with poor prognosis of NSCLC.A: Overall survival of NSCLC patients with different ARHGAP21 expression levels based on the Km-plotter database. B: Tissue microarray IHC scores. C, D:Univariate and multivariate Cox regression of overall survival.

表2 肺腺癌臨床病理特征與ARHGAP21表達(dá)的相關(guān)性Tab.2 Correlation between clinicopathological features of lung adenocarcinoma andARHGAP21 expression

2.3 ARHGAP21表達(dá)下調(diào)促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞在體內(nèi)外的遷移和轉(zhuǎn)移

通過(guò)Western blot鑒定了其敲低效率（圖3A、B）。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ARHGAP21表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移（P＜0.001，圖3C、D）。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ARHGAP21表達(dá)下調(diào)可加速邊緣細(xì)胞向中心的愈合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移能力（P＜0.001，圖3E、F）。在裸鼠肺轉(zhuǎn)移腫瘤模型中，相比對(duì)照組，敲低ARHGAP21的細(xì)胞株在裸鼠肺部顯示出較高的信號(hào)區(qū)域，且有較多數(shù)目的轉(zhuǎn)移腫瘤灶（P＜0.05，圖4A、B）。同時(shí)，免疫組化顯示ARHGAP21表達(dá)下調(diào)促進(jìn)了腫瘤轉(zhuǎn)移部位腫瘤細(xì)胞的N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)（圖4C）。

圖3 ARHGAP21的敲低促進(jìn)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞在體外的遷移Fig. 3 ARHGAP21 knockdown promotes migration of NSCLC cells in vitro.A,B:Western blotting for verifying ARHGAP21 knockdown efficiency.C-F:Cell migration detected by Transwell assay and wound healing assay in ARHGAP21 knockdown and control cell lines(scale bar:200 μm).*P＜0.05;***P＜0.001 vs NC group.

圖4 敲低ARHGAP21促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞在體內(nèi)遷移Fig. 4 ARHGAP21 knockdown promotes migration of NSCLC cells in vivo.A:In vivo imaging for detecting metastasis ability of ARHGAP21 knockdown cells and control cells in mice. B:Representative image of a lung metastatic tumor and the statistical analysis of the fluorescence area.C:IHC staining of lung metastatic tumor(scale bar:50 μm).*P＜0.05 vs NC group.

2.4 ARHGAP21的生物信息學(xué)分析及預(yù)測(cè)其可能的作用機(jī)制

從GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選并展示了前十個(gè)與ARHGAP21 表達(dá)具有高相關(guān)性的基因（P＜0.001，圖5A～J）。特別注意的是其中APC基因作為WNT信號(hào)通路的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子（圖5J）。隨后，通過(guò)GO注釋對(duì)前100個(gè)與ARHGAP21存在相關(guān)性的基因進(jìn)行富集分析（圖5K）。分析結(jié)果表明，這些基因在細(xì)胞骨架和細(xì)胞粘附中有著顯著的富集。蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示了與ARHGAP21有潛在相互作用的蛋白質(zhì)［15］，例如CCDC85B、CCDC85C和ARRB1（圖5L）。值得注意的是，CCDC85B、CCDC85C和ARRB1都與WNT通路或β-catenin有關(guān)。此外，我們還在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中分析了ARHGAP21與破壞體復(fù)合物組分（APC、Axin1、GSK3β和CK1）以及β-catenin的表達(dá)關(guān)系（圖5M～P）。分析結(jié)果顯示，ARHGAP21與APC、Axin1和GSK3β表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.001），但與CK1和β-catenin無(wú)相關(guān)性。

圖5 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)ARHGAP21的可能作用機(jī)制Fig. 5 Bioinformatic analysis for predicting possible mechanism of action of ARHGAP21. A-J: Correlation analysis between ARHGAP21 and the top 10 most similar genes based on data from the TCGA database and GEPIA database.K:GO annotation enrichment of the top 100 most similar genes of ARHGAP21.BP: Biological Process;MF: Molecular Function;CC: Cellular Component. L: PPI network analysis of ARHGAP21. M-P: Correlation analysis of ARHGAP21 with theAxin1,GSK3β,CK1 and β-catenin.

2.5 ARHGAP21下調(diào)促進(jìn)WNT信號(hào)通路的激活，從而促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

qPCR 結(jié)果顯示，ARHGAP21 敲低下調(diào)了APC、GSK3β、Axin和β-catenin的mRNA表達(dá)水平（P＜0.001，圖6A～E）。Western blot 結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，ARHGAP21敲低細(xì)胞系中APC、GSK3β、Axin的蛋白水平下調(diào)，而β-catenin及其下游EMT相關(guān)蛋白N-鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)（圖6F）。此外，通過(guò)檢測(cè)ARHGAP21敲低后β-catenin泛素化水平的變化結(jié)果顯示ARHGAP21敲低會(huì)降低β-catenin的泛素化水平，從而進(jìn)一步上調(diào)βcatenin的蛋白水平（圖6G）。

圖6 敲低ARHGAP21通過(guò)激活WNT信號(hào)促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化Fig. 6 ARHGAP21 knockdown promotes epithelial-mesenchymal transition by activating WNT signaling.AD:qPCR analysis of ARHGAP21,APC,GSK3β and Axin1 mRNA expression after ARHGAP21 knockdown in lung cancer cells compared with the control cells.E:Western blotting for ARHGAP21,APC,GSK3β,Axin1,βcatenin and N-cadherin protein expressions in lung cancer cells after ARHGAP21 knockdown. F: qPCR analysis of ARHGAP21 and β-catenin mRNA expression in lung cancer cells after ARHGAP21 knockdown.G:Effect ofARHGAP21 knockdown on ubiquitination of β-catenin.***P＜0.001.

3 討論

非小細(xì)胞肺癌是一種具有高發(fā)病率和高死亡率的惡性腫瘤［16］。早期肺癌主要通過(guò)手術(shù)治療。然而，由于其發(fā)病隱匿，被診斷出時(shí)，病情往往已經(jīng)發(fā)展到中晚期，需要綜合治療。分子靶向治療和免疫治療是改善患者預(yù)后的有效方法之一，為部分患者帶來(lái)了前所未有的生存益處［3,17,18］。然而，NSCLC的總治愈率和生存率仍然非常低。因此，尋找更多的分子靶點(diǎn)對(duì)于NSCLC的診斷和治療具有重要意義。

RhoGTPases是屬于Ras超家族的小型核苷酸依賴(lài)性GTP結(jié)合蛋白，它們參與了細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞遷移、黏附和增殖等多種生物學(xué)過(guò)程［19］。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移會(huì)顯著降低腫瘤患者的生存率。RhoGTPases的紊亂可能促進(jìn)癌癥的轉(zhuǎn)移［20］。ARHGAP21是RhoGTPases的負(fù)性調(diào)節(jié)因子之一，在多種腫瘤中被報(bào)道，是潛在的腫瘤抑制因子。Bigarella等［12］發(fā)現(xiàn)ARHGAP21與FAK相互作用，進(jìn)一步失活FAK和CDC42以抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤遷移。Lazarini等［13］揭示ARHGAP21抑制RhoC的活性以抑制細(xì)胞遷移。他們也發(fā)現(xiàn)ARHGAP21可能擾亂內(nèi)皮素-1通路以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖。有研究證明ARHGAP21和PK1是兩個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞極性蛋白，它們通過(guò)調(diào)節(jié)RhoA來(lái)控制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)［21］。有研究提出ARHGAP21通過(guò)幫助穩(wěn)定α-微管蛋白來(lái)調(diào)節(jié)EMT特性［22］?？傮w而言，先前的研究表明ARHGAP21通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、細(xì)胞極性和細(xì)胞骨架等影響細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。然而，ARHGAP21在肺癌中發(fā)揮的具體作用及其機(jī)制尚未有學(xué)者深入報(bào)道。

我們發(fā)現(xiàn)ARHGAP21 在肺癌組織和大部分NSCLC細(xì)胞系中均表達(dá)下調(diào)，并且ARHGAP21的低表達(dá)是一個(gè)不良預(yù)后因素。這個(gè)證據(jù)與既往的研究一致，認(rèn)為ARHGAP21可能是一種腫瘤抑制分子。為了探究ARHGAP21在NSCLC中的生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了敲低ARHGAP21的肺癌細(xì)胞系。基于ARHGAP21廣泛參與細(xì)胞骨架、細(xì)胞黏附等過(guò)程，我們著重檢測(cè)了在肺癌細(xì)胞中敲低ARHGAP21后遷移及轉(zhuǎn)移能力的變化。結(jié)果顯示，ARHGAP21的敲低促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞在體外和體內(nèi)的遷移和轉(zhuǎn)移。

基于GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)［23］，我們篩選了與ARHGAP21表達(dá)高度相關(guān)的基因并對(duì)前100個(gè)相關(guān)基因進(jìn)行GO富集分析，富集結(jié)果包括細(xì)胞骨架、細(xì)胞黏附、細(xì)胞質(zhì)微管、微管相關(guān)復(fù)合物等方面，這提示我們ARHGAP21可能在細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要的作用［13,21,22］。此外APC與ARHGAP21 之間的高度相關(guān)性引起了我們的注意。APC是破壞復(fù)合物的重要組成部分之一，與WNT信號(hào)通路相關(guān)［24,25］。在WNT/β-catenin信號(hào)通路中，當(dāng)WNT信號(hào)失活時(shí)，破壞復(fù)合物（包括APC、Axin、CK1和GSK3β）與β-catenin 相互作用并介導(dǎo)其磷酸化。磷酸化的βcatenin被β-TrCP識(shí)別，在泛素化修飾后被降解［25］。當(dāng)WNT信號(hào)被激活或破壞復(fù)合物出現(xiàn)異常時(shí)，β-catenin的降解也隨之減弱。上調(diào)的β-catenin在核周積累并被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核。作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，β-catenin與LEF/TCF轉(zhuǎn)錄因子家族相互作用，促進(jìn)多個(gè)下游癌基因的表達(dá)［26］。基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析，我們發(fā)現(xiàn)ARHGAP21不僅與APC mRNA表達(dá)相關(guān)，還與Axin1和GSK3β相關(guān)，但與β-catenin的mRNA表達(dá)水平無(wú)關(guān)。此結(jié)果與已有研究相一致，即破壞復(fù)合物通過(guò)促進(jìn)其泛素化降解而抑制β-catenin的表達(dá)，而不是通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄來(lái)實(shí)現(xiàn)。

為了進(jìn)一步闡明ARHGAP21對(duì)破壞復(fù)合物的影響，我們檢測(cè)了ARHGAP21敲低后APC、GSK3β、Axin和β-catenin的mRNA和蛋白水平變化。與預(yù)測(cè)結(jié)果相似，敲低ARHGAP21 抑制了APC、Axin 和GSK3β的mRNA和蛋白水平，并上調(diào)了β-catenin的蛋白表達(dá)。值得注意的是，ARHGAP21敲低下調(diào)了β-catenin 的mRNA水平，這可能與β-catenin蛋白水平增加引起的負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。此外，我們分析了ARHGAP21敲低后β-catenin泛素化水平的變化。與破壞復(fù)合物的功能一致，ARHGAP21減少導(dǎo)致β-catenin的泛素化水平降低，從而進(jìn)一步上調(diào)β-catenin。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是一種生物過(guò)程，指的是上皮細(xì)胞通過(guò)特定的程序轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)表型的細(xì)胞［27］。EMT在胚胎發(fā)育、慢性炎癥、組織重構(gòu)、癌癥轉(zhuǎn)移以及多種纖維化疾病中發(fā)揮著重要作用。EMT是一種重要的生物過(guò)程，其中上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞通過(guò)EMT進(jìn)程獲得了遷移和侵襲能力。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，EMT對(duì)轉(zhuǎn)移的功能影響重大［28,29］。EMT由多個(gè)信號(hào)通路調(diào)節(jié)，如TGF-β信號(hào)通路、WNT信號(hào)通路和Notch信號(hào)通路。WNT信號(hào)介導(dǎo)的異常激活在許多不同類(lèi)型的癌癥中發(fā)現(xiàn)［30-32］。EMT的共同特點(diǎn)是E-鈣粘蛋白向N-鈣粘蛋白的轉(zhuǎn)化和細(xì)胞骨架中細(xì)胞角蛋白向波形蛋白的轉(zhuǎn)化。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)ARHGAP21的沉默上調(diào)了β-catenin和N-鈣粘蛋白，增強(qiáng)了EMT。先前的研究表明ARHGAP21通過(guò)穩(wěn)定α-微管蛋白來(lái)調(diào)節(jié)EMT［22］。我們的研究提示ARHGAP21通過(guò)失活WNT信號(hào)通路來(lái)抑制EMT過(guò)程。

因此，本結(jié)果表明，作為一種腫瘤抑制因子，ARHGAP21在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)水平降低，其低表達(dá)是預(yù)后不良的因素。敲低ARHGAP21基因后促進(jìn)了細(xì)胞的體外和體內(nèi)遷移和轉(zhuǎn)移能力。分子機(jī)制研究表明，敲低ARHGAP21 基因抑制了APC、Axin 和GSK3β的表達(dá)，阻止了破壞復(fù)合物的形成，降低了βcatenin的降解，進(jìn)而促進(jìn)了上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。這些發(fā)現(xiàn)提示，ARHGAP21有望成為非小細(xì)胞肺癌新的診斷和治療靶點(diǎn)。對(duì)肺癌的臨床診療可能具有積極指導(dǎo)意義。