乙酰紫堇靈通過(guò)抑制腸上皮細(xì)胞凋亡改善三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的小鼠克羅恩病樣結(jié)腸炎

李晴晴，黃菊，孫洋，徐赟輝，王煉，張小鳳，王月月，耿志軍，宋雪，左蘆根，5，李靜，胡建國(guó)

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1檢驗(yàn)科，3中心實(shí)驗(yàn)室，4胃腸外科，安徽 蚌埠 233004；2蚌埠醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233030；5炎癥相關(guān)性疾病基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蚌埠233004

克羅恩?。–D）是一種以腸道慢性復(fù)發(fā)性炎癥為主要表現(xiàn)的炎癥性腸?。↖BD），具有致殘性和不可治愈性等特點(diǎn)［1,2］。臨床上多使用生物抗炎制劑緩解CD患者的癥狀，但是并不能理想地控制疾病的手術(shù)率和復(fù)發(fā)率［3］。CD的發(fā)病率在我國(guó)呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)，而發(fā)病機(jī)制不明嚴(yán)重阻礙了疾病診療水平的提高［4］。正常情況下，腸上皮細(xì)胞、細(xì)胞間緊密連接以及菌膜三者構(gòu)成腸道的機(jī)械屏障，可阻止腸道內(nèi)細(xì)菌及其產(chǎn)生的脂多糖（LPS）等有害物質(zhì)損傷腸粘膜并進(jìn)入血液循環(huán)［5］。然而，CD患者存在腸上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡的病理特征，使得腸屏障結(jié)構(gòu)和功能破壞而參與加重腸炎進(jìn)展［6-8］。因此，尋找以抑制腸上皮細(xì)胞凋亡并保護(hù)腸屏障的新型藥物將為CD診療提供新的參考。乙酰紫堇靈（Ace）是從中藥紫堇中提取的生物堿活性成分，具有抗炎作用，被證實(shí)可以抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡進(jìn)而緩解帕金森模型小鼠的癥狀［9］，提示其可能具有潛在的抗腸炎和腸上皮細(xì)胞凋亡的作用，然而目前Ace在CD中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬采用TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型，觀察Ace對(duì)CD樣腸炎的作用，以腸上皮細(xì)胞凋亡和腸屏障損傷為研究重點(diǎn)，分析Ace的作用途徑，并進(jìn)一步使用脂多糖誘導(dǎo)的結(jié)腸類(lèi)器官凋亡模型及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析等技術(shù)，探究Ace調(diào)控上皮細(xì)胞凋亡保護(hù)腸屏障的作用機(jī)制，以期為CD臨床治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

6～8周齡，體質(zhì)量19～25 g的C57BL/6品系雄性野生型小鼠（WT）40只，購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境為無(wú)特定病原菌（SPF），溫度22～25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，晝夜周期12 h/12 h，自由飲食。本研究通過(guò)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查（倫理批準(zhǔn)號(hào)：[2021]第226號(hào)）。

Acetylcorynoline（上海源葉科技有限公司）；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，Sigma）、脂多糖（LPS，Sigma）及牛血清白蛋白（BSA，Sigma）；HE染色試劑盒（索萊寶科技有限公司）；ZO-1、Claudin-1、C-caspase3、Bax、Bcl-2、AKT、PI3K、p-AKT、p-PI3K和β-actin（Abcam）；740Y-P（MCE）；細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒（碧云天）；Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）；DMEM-F12（gibco）；D-PBS（STEMCELL）；溫和細(xì)胞解離試劑（GCDR，STEMCELL）、小鼠類(lèi)器官培養(yǎng)基（STEMCELL）、鼠類(lèi)器官生長(zhǎng)因子（STEMCELL）、基質(zhì)膠（康寧）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 將WT小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（WT組）、模型組（TNBS組）和Ace干預(yù)組[Ace-10組（10 mg/kg Ace）、Ace-20組（20 mg/kg Ace）和Ace-40組（40 mg/kg Ace）]，8只/組。TNBS組和Ace干預(yù)組小鼠進(jìn)行TNBS造模，過(guò)程簡(jiǎn)述如下：小鼠麻醉后（1%戊巴比妥鈉，腹腔注射，40 mg/kg），將聚乙烯軟管（3.5 F）連接1 mL注射器，經(jīng)肛門(mén)緩慢置入直腸（約4 cm），推注100 μL 的2.5%TNBS酒精溶液（5%TNBS與無(wú)水乙醇溶液1∶1混合），并倒立4 min。造模后，Ace干預(yù)組小鼠每日給予Ace灌胃（10、20、40 mg/kg，0.2 mL，1次/d，連續(xù)6 d），其余兩組每日均予等量生理鹽水灌胃。造模后第7天取檢結(jié)腸組織：一部分用10%福爾馬林中固定用于組織學(xué)分析；另一部分直接凍存于液氮中，用于分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.2.2 結(jié)腸類(lèi)器官提取、培養(yǎng)及干預(yù) 選取4只WT鼠進(jìn)行結(jié)腸類(lèi)器官的提取。簡(jiǎn)述如下［10］：處死小鼠，取出結(jié)腸，剔除腸管附著的筋膜、脂肪和糞便。將組織轉(zhuǎn)移至EP管中，剪碎，進(jìn)入預(yù)冷的D-PBS，吹打混勻后，待自然沉降后棄上清，重復(fù)沖洗數(shù)十次。加入GCDR，在4 ℃、70 r/min的搖床上孵育30 min，經(jīng)4 ℃、2500 r/min離心5 min后棄上清。使用基質(zhì)膠混合液在24孔板內(nèi)進(jìn)行點(diǎn)膠。將24孔板移至37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，孵育0.5～1 h。待膠凝固，加入小鼠腸類(lèi)器官培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為4組：Control組、脂多糖組、脂多糖+Ace組（Ace組）及脂多糖+Ace+740Y-P組（Ace+740Y-P組），Control組為正常培養(yǎng)的類(lèi)器官；脂多糖組為類(lèi)器官經(jīng)脂多糖（100 μg/mL）干預(yù)24 h；Ace組為類(lèi)器官經(jīng)脂多糖（100 μg/mL）和Ace（20 μmol）同時(shí)干預(yù)24 h［11,12］；Ace+740Y-P 組為類(lèi)器官經(jīng)脂多糖（100 μg/mL）、Ace（20 μmol）和740Y-P（30 μg/mL）同時(shí)干預(yù)24 h［13］。收集各組類(lèi)器官用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3 疾病癥狀、結(jié)腸長(zhǎng)度及腸炎組織學(xué)評(píng)估 每日記錄各組小鼠體質(zhì)量；取檢當(dāng)天采用腸炎疾病活動(dòng)度（DAI）評(píng)估小鼠疾病癥狀，DAI=（體質(zhì)量指數(shù)+大便形狀+出血情況）/3，分值范圍為0～4分，評(píng)分越高提示腸炎臨床癥狀越重［14］；取檢時(shí)測(cè)量各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度；對(duì)小鼠結(jié)腸組織切片進(jìn)行常規(guī)HE染色及結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分，該量表評(píng)分范圍為0～4分，0分為無(wú)炎癥；1分為少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)固有層；2分為單核細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致隱窩分離和輕度粘膜增生；3分為大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致粘膜結(jié)構(gòu)紊亂，杯狀細(xì)胞丟失和明顯的粘膜增生；4分為隱窩膿腫和潰瘍，分值越高代表腸炎越重［15］。

1.2.4 評(píng)估Ace對(duì)腸屏障功能的影響（1）石蠟切片免疫熒光染色：將固定后的結(jié)腸組織進(jìn)行石蠟包埋，制作4 μm厚度切片，切片經(jīng)烤片、脫蠟水化、抗原修復(fù)、5%BSA封閉后，孵育一抗（Claudin-1，1∶400）和熒光二抗，滴加DAPI染核，70%甘油封片；（2）結(jié)腸類(lèi)器官免疫熒光染色：結(jié)腸類(lèi)器官經(jīng)4%多聚甲醛固定、30%蔗糖溶液孵育、1%Triton破膜、5%BSA封閉、孵育Claudin-1抗體和熒光二抗，滴加DAPI染核，使用明膠溶液重懸類(lèi)器官，置于共聚焦中采集照片；（3）Western blot檢測(cè)：依據(jù)細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，提取小鼠結(jié)腸組織及結(jié)腸類(lèi)器官中總蛋白和細(xì)胞膜蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗（ZO-1、Claudin-1和β-actin，1∶1000）和HRP標(biāo)記的二抗，再經(jīng)ECL超敏發(fā)光液顯色和采集圖片。最后，通過(guò)ImageJ軟件分析目的條帶的灰度值，并計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 評(píng)估Ace對(duì)腸上皮細(xì)胞凋亡的影響（1）Tunel染色：根據(jù)Tunel檢測(cè)試劑盒操作步驟對(duì)脫蠟水化后的結(jié)腸組織切片染色。隨機(jī)挑選5個(gè)不重復(fù)視野，計(jì)算細(xì)胞凋亡率：細(xì)胞凋亡率（%）=（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%；（2）凋亡相關(guān)蛋白的Western blot 檢測(cè)：Ccaspase3、Bax和Bcl-2（1∶1000），步驟同上。

1.2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 篩選Ace潛在作用靶點(diǎn)及CD相關(guān)靶點(diǎn)：首先從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得Ace 的SMILES結(jié)構(gòu)式，將其導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)［16］，以可能性（probability＞0）為限制條件篩選Ace潛在作用靶點(diǎn)。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索CD相關(guān)靶點(diǎn)并剔除得分較低的靶點(diǎn)。將篩選得到的Ace潛在作用靶點(diǎn)及CD相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1 在線工具繪制韋恩圖，得到二者共同靶點(diǎn)基因。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）。最后采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析，限定物種為“Homo Sapiens”，并將KEGG富集的通路選擇前15條進(jìn)行可視化處理。

1.2.7 評(píng)估Ace體內(nèi)外干預(yù)對(duì)PI3K-AKT信號(hào)通路的影響 Western blot檢測(cè)AKT、PI3K、p-AKT和p-PI3K（1∶1000）的蛋白表達(dá)量，方法同實(shí)驗(yàn)方法1.2.4 中Western blot檢測(cè)。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每組試驗(yàn)至少重復(fù)3次，且所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組之間的比較采用t檢驗(yàn)（參數(shù)）或Mann-Whitney test（非參數(shù)）。當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ace干預(yù)可改善TNBS模型小鼠的疾病癥狀

與TNBS組相比，Ace干預(yù)后小鼠的平均體質(zhì)量逐漸增加（圖1A）和DAI評(píng)分顯著降低（P＜0.05，圖1B）。根據(jù)體質(zhì)量變化和DAI評(píng)分的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20 mg/kg的Ace給藥劑量治療結(jié)腸炎的效果最佳（圖1）。

圖1 Ace干預(yù)對(duì)TNBS模型小鼠疾病癥狀的影響Fig. 1 Effect of acetylcorynoline (Ace) on disease symptoms of TNBS-induced mice.A: Changes of body weight.B:Changes of DAI scores.*P＜0.05 vs WT group.#P＜0.05 vs TNBS.

2.2 Ace干預(yù)可緩解TNBS模型小鼠的腸道炎癥反應(yīng)

相比于TNBS組，Ace-20組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯增加（P＜0.05，圖2A、B）。HE 染色和組織學(xué)評(píng)分顯示，Ace-20組小鼠腸炎組織學(xué)評(píng)分減低（P＜0.05，圖2C、D）。

圖2 Ace干預(yù)對(duì)TNBS模型小鼠腸道炎癥的影響Fig. 2 Effect of acetylcorynoline(Ace)on intestinal inflammation in TNBS mice.A,B:Comparison of colon length among different groups.C:HE staining of the colon tissue.D:Histopathological score of the colon.*P＜0.05 vs WT group.#P＜0.05 vs TNBS group.

2.3 Ace干預(yù)可保護(hù)TNBS模型小鼠腸屏障結(jié)構(gòu)

TNBS組小鼠結(jié)腸組織中Claudin-1存在缺失及移位，而經(jīng)Ace 治療后得到明顯改善（圖3A）。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與TNBS組相比，Ace-20組小鼠結(jié)腸組織及細(xì)胞膜中Claudin-1和ZO-1的蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05，圖3B～E）。

圖3 Ace干預(yù)對(duì)TNBS模型小鼠腸屏障結(jié)構(gòu)的影響Fig. 3 Effect of acetylcorynoline(Ace)on intestinal barrier structure of TNBS mice.A:Immunofluorescence assay of claudin-1 expression in the colon of the mice. B, C: Western blotting of claudin-1 and ZO-1 expressions in the colon tissues.D,E:Western blotting of cell membrane proteins of claudin-1 and ZO-1.*P＜0.05 vs WT group.#P＜0.05 vs TNBS group.

2.4 Ace干預(yù)減少TNBS模型小鼠腸上皮細(xì)胞凋亡

Tunel檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與TNBS組相比，Ace-20組結(jié)腸組織中腸上皮細(xì)胞凋亡的數(shù)量減少（P＜0.05，圖4A、B）。Western blot結(jié)果表明，Ace-20組結(jié)腸組織中抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)上調(diào)，而凋亡蛋白C-caspase3 及Bax的水平降低（P＜0.05，圖4C、D）。

圖4 Ace干預(yù)對(duì)TNBS模型小鼠腸上皮細(xì)胞凋亡的影響Fig. 4 Effect of acetylcorynoline(Ace)on intestinal epithelial cell apoptosis in TNBS mice.A:TUNEL staining of the colon tissue.B:Apoptosis rate of intestinal epithelial cells.C,D:Western blotting of C-caspase3,Bax and Bcl-2.*P＜0.05 vs WT.#P＜0.05 vs TNBS.

2.5 Ace干預(yù)保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的結(jié)腸類(lèi)器官屏障結(jié)構(gòu)

免疫熒光結(jié)果顯示，脂多糖組結(jié)腸類(lèi)器官中Claudin-1存在缺失，而經(jīng)Ace干預(yù)后明顯改善（圖5A）。與脂多糖組相比，Ace組結(jié)腸類(lèi)器官組織和細(xì)胞膜中Claudin-1 和ZO-1 的蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05，圖5B～E）。

圖5 Ace干預(yù)對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腸類(lèi)器官屏障結(jié)構(gòu)的影響Fig. 5 Effect of Ace on barrier structure of LPS-induced colonic organoid. A: Immunofluorescence assay of claudin-1 in colonic organoid. B, C: Western blotting of claudin-1 and ZO-1 in colonic organoid tissues. D, E: Western blotting of membrane proteins of claudin-1 and ZO-1.*P＜0.05 vs Control group.#P＜0.05 vs LPS group.

2.6 Ace干預(yù)減少脂多糖誘導(dǎo)的結(jié)腸類(lèi)器官上皮細(xì)胞凋亡

與脂多糖組相比，Ace組抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著上調(diào)，而凋亡蛋白C-caspase3及Bax的表達(dá)則顯著降低（P＜0.05，圖6A、B）。

2.7 Ace治療CD的交集靶點(diǎn)及KEGG通路富集分析

Venny圖顯示，Ace和CD潛在交集作用靶點(diǎn)共有45個(gè)（圖7A），并導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)得出PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖7B）。此外，KEGG通路富集預(yù)測(cè)分析表明，PI3K-AKT信號(hào)通路與Ace治療CD具有相關(guān)性（圖7C）。

圖7 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果Fig. 7 Results of network pharmacological analysis.A:Venn diagram of CD gene-Ace target genes.B:PPI network diagram.C:KEGG enrichment pathways of the intersection targets ofAce and CD.

2.8 Ace減少腸上皮細(xì)胞凋亡可能與調(diào)控PI3K-AKT通路有關(guān)

相對(duì)于TNBS組小鼠（圖8A、B）和脂多糖誘導(dǎo)的結(jié)腸類(lèi)器官（圖8C、D），經(jīng)Ace干預(yù)后Ace組中p-PI3K及p-AKT蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。

圖8 Ace干預(yù)對(duì)體內(nèi)和體外PI3K/AKT通路的影響Fig. 8 Effect of Ace on the PI3K/AKT pathway in both the in vivo and in vitro models.A,B:Western blotting of PI3K,p-PI3K,AKT and p-AKT expressions in the in vivo model.C, D: Western blotting of PI3K,p-PI3K,AKT and p-AKT expressions in the in vitro model.*P＜0.05 vs WT and Control groups.#P＜0.05 vs TNBS and LPS groups.

2.9 Ace可通過(guò)抑制PI3K-AKT信號(hào)通路減少腸上皮細(xì)胞凋亡

與Ace組相比，經(jīng)PI3K-AKT激活劑740Y-P干預(yù)后，p-PI3K 及p-AKT 的蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.05，圖9A、B），Ace+740Y-P組結(jié)腸類(lèi)器官中Bcl-2的表達(dá)降低，而C-caspase3 和Bax 的表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05，圖9C、D）。

圖9 PI3K-AKT信號(hào)通路激活劑對(duì)Ace治療腸上皮細(xì)胞凋亡的影響Fig. 9 Effect of PI3K-AKT signaling pathway activator on Ace-treated intestinal epithelial cell apoptosis. A, B: Western blotting of PI3K,p-PI3K,AKT and p-AKT expressions in vitro. C, D:Western blotting of C-caspase3,Bax and Bcl-2 expressions in vitro.*P＜0.05 vsAce.

3 討論

目前CD仍無(wú)法治愈，臨床上還是以藥物治療為主，但是存在大量副作用［17］。因此，尋找新的且安全有效的藥物仍是當(dāng)前探索CD治療的主要策略［18-20］。本文通過(guò)體內(nèi)與體外研究，證實(shí)Ace可能是通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)的激活減少腸上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而保護(hù)腸屏障和發(fā)揮抗腸炎的作用。

中藥因其整體性治療及安全性等優(yōu)勢(shì)，有望在CD治療中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景［21］。近年來(lái)，有研究報(bào)道中藥成分對(duì)于治療TNBS模型小鼠CD樣腸炎有較好的緩解作用。例如，綠茶多酚（GTP）是綠茶中的天然藥效成分之一，可發(fā)揮抗炎及腸粘膜屏障結(jié)構(gòu)保護(hù)作用［22］；黨參總皂苷（TSC）是黨參中重要的活性成分之一，對(duì)TNBS誘導(dǎo)的大鼠腸粘膜損傷具有顯著的保護(hù)作用［23］。Ace是中藥紫堇中的生物堿成分，具有抗炎作用，可顯著抑制LPS刺激樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）分泌TNF-α和IL-6等炎性因子［24］；在小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷時(shí)，紫堇靈及乙酰紫堇靈可減輕肝臟損害程度，尤以乙酰紫堇靈作用最為顯著［25］。Ace的抗炎作用表明其可能在CD中具有潛在的治療價(jià)值?；诖?，本文首次應(yīng)用Ace探究其在TNBS模型小鼠腸炎中的作用效果。本文發(fā)現(xiàn)，Ace干預(yù)后結(jié)腸炎小鼠的體質(zhì)量、結(jié)腸長(zhǎng)度、DAI和腸炎評(píng)分得到了改善，以及結(jié)腸組織幾乎未見(jiàn)紅腫和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，這些數(shù)據(jù)表明Ace可緩解CD樣結(jié)腸炎。CD患者常伴有腸屏障損傷，且越來(lái)越多的研究證明腸屏障結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙影響腸炎進(jìn)展［26］。于是，我們使用TNBS小鼠和脂多糖誘導(dǎo)的結(jié)腸類(lèi)器官模型，證實(shí)Ace改善了結(jié)腸組織和類(lèi)器官中Claudin-1缺失和移位，且促進(jìn)Claudin-1和ZO-1的表達(dá)水平。以上結(jié)果均表明Ace具有抗腸炎及保護(hù)腸屏障的作用，但是調(diào)控機(jī)制不明。

細(xì)胞凋亡是維持腸上皮細(xì)胞正常功能的重要環(huán)節(jié)，但在病理狀態(tài)下腸上皮細(xì)胞的異常凋亡會(huì)破壞腸粘膜的完整性和屏障功能［27,28］。研究顯示，CD患者腸上皮細(xì)胞凋亡率顯著增加［29］。因此，抗上皮細(xì)胞凋亡可作為改善CD腸屏障功能受損的一種干預(yù)模式。有文獻(xiàn)報(bào)道乙酰紫堇靈可能通過(guò)降低egl-1的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡途徑，進(jìn)而減少神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡［9］。在本研究中，我們探討了Ace是否通過(guò)減少腸上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)TNBS模型小鼠腸屏障的作用。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，Ace干預(yù)顯著抑制腸上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)量，且抑制C-caspase3及Bax的表達(dá)。以上結(jié)果均提示Ace干預(yù)可減少腸上皮細(xì)胞凋亡，這可能是Ace發(fā)揮對(duì)腸屏障保護(hù)作用的途徑之一，但是Ace抑制腸上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析技術(shù)探究Ace抗腸上皮細(xì)胞凋亡進(jìn)而改善腸屏障可能的作用機(jī)制。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析最終得到45個(gè)Ace和CD的交集靶點(diǎn)，KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路與Ace治療CD具有一定的相關(guān)性。PI3K/AKT信號(hào)通路能夠參與細(xì)胞凋亡、自噬和增殖等細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程［30,31］，且越來(lái)越多的證據(jù)表明PI3K/AKT參與CD疾病進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)原花青素B2（PCB2）可能通過(guò)抑制腸道PI3K/AKT信號(hào)途徑對(duì)TNBS結(jié)腸炎模型小鼠發(fā)揮抗炎及腸粘膜功能和結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用［32］；黃芪苷（Baicalin）可通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路減少腸上皮細(xì)胞凋亡，增加緊密連接蛋白的表達(dá)進(jìn)而減輕TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎［33］。因此，我們推測(cè)Ace可能通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路減少腸上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善腸屏障功能。通過(guò)Western blot驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Ace干預(yù)后結(jié)腸組織和結(jié)腸類(lèi)器官中的p-PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)顯著降低。體外上調(diào)PI3KAKT信號(hào)通路后，p-PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)降低，而凋亡蛋白C-caspase3及Bax的表達(dá)則顯著升高。以上結(jié)果均提示，Ace可通過(guò)抑制PI3K-AKT信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)TNBS模型小鼠腸炎和腸屏障功能的保護(hù)作用。

本研究具有一定的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值，不僅擴(kuò)充了Ace抗腸上皮細(xì)胞凋亡的生物學(xué)功能及機(jī)制，也擴(kuò)大了Ace治療疾病的范圍，為CD的臨床藥物治療提供了重要參考。

本研究還存在一些不足：我們使用的是TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型，但目前還沒(méi)有更準(zhǔn)確的有關(guān)CD的動(dòng)物模型；在該研究中發(fā)現(xiàn)Ace可通過(guò)減少腸上皮細(xì)胞凋亡保護(hù)腸屏障，但不排除Ace也可能通過(guò)其他作用途徑發(fā)揮抗腸炎的作用；Ace抑制腸上皮細(xì)胞凋亡可能與抑制PI3K/AKT信號(hào)激活有關(guān)，但其也可能涉及其他的調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，Ace可能通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)的激活，抑制腸上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而保護(hù)腸屏障受損和改善TNBS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎。