無菌體液標(biāo)本中碳青霉烯類異質(zhì)性耐藥銅綠假單胞菌的危險(xiǎn)因素分析

賴漢瑜,岑麗蓮

肇慶市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東肇慶 526060

銅綠假單胞菌(Pae)是引起醫(yī)院內(nèi)感染的主要條件致病菌,可引起人體多部位感染,如消化道、呼吸道、泌尿道、肺部、心臟瓣膜和手術(shù)部位感染,甚至還能引起血流感染[1-4]。Pae易對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐藥性,因此臨床治療Pae感染一直具有挑戰(zhàn)性[3]。亞胺培南(IPM)和美羅培南(MEM)等碳青霉烯類藥物已被廣泛用于治療嚴(yán)重感染,且對(duì)Pae表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性[3]。有研究表明,異質(zhì)性耐藥(HR)的出現(xiàn)可能會(huì)降低碳青霉烯類的有效性[4]。HR定義為在同一培養(yǎng)皿中存在具有更高抗生素耐藥性水平的亞株[5]。HR分離株通過常規(guī)藥敏試驗(yàn)確定為敏感菌,當(dāng)患者連續(xù)大劑量暴露于抗生素后,高水平耐藥亞群發(fā)展為優(yōu)勢(shì)菌,最終導(dǎo)致治療失敗,甚至反復(fù)感染[6]。目前,國(guó)內(nèi)外僅有少量關(guān)于描述碳青霉烯HR Pae(CHPA)分離株發(fā)病率的流行率數(shù)據(jù),這些數(shù)據(jù)可能準(zhǔn)確地呈現(xiàn)了臨床環(huán)境中HR的動(dòng)態(tài)變化。本研究分析了臨床送檢無菌體液中分離的Pae中CHPA的檢出情況,以期為感染控制和指導(dǎo)臨床合理用藥提供參考依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1一般資料 (1)菌株來源:選取2020年1月至2021年12月本院臨床送檢無菌體液中非重復(fù)培養(yǎng)標(biāo)本,剔除同一患者同一部位重復(fù)分離的菌株,分離出首次非重復(fù)Pae 139株作為研究標(biāo)本。所有菌株均由Vitek2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行常規(guī)抗菌藥物敏感性測(cè)試。(2)患者臨床資料:收集患者的基本信息與臨床資料,如性別、年齡、入住科室、是否接受侵入性醫(yī)療操作(包括手術(shù)、氣管插管、胃管、尿管、引流管和胃腸鏡檢查等)及分離后是否持續(xù)或反復(fù)發(fā)生細(xì)菌感染。記錄菌株分離前、后1天內(nèi)的常規(guī)生化項(xiàng)目,包括鉀(K)、鈉(Na)、氯(Cl)、鈣(Ca)、二氧化碳結(jié)合力(CO2CP)、肌酐(Cr)、血糖(Glu)、尿素氮(BUN),以及分離前、后1 d內(nèi)的白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(NEUT)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(LYMPH)等。所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2試劑 血平板、微生物培養(yǎng)基(MH平板)均購(gòu)自梅里埃(上海)生物制品有限公司;MEM和IPM藥敏紙片(10 μg/片)均購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司;MEM和IPM干粉均購(gòu)自美國(guó)Apexbio公司。采用標(biāo)準(zhǔn)菌株CHPA ATCC27853進(jìn)行質(zhì)量控制,標(biāo)準(zhǔn)菌株由國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心提供。

1.3方法

1.3.1K-B紙片擴(kuò)散法 所有操作均按照《臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版[7]進(jìn)行。藥敏試驗(yàn)結(jié)果參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)指南(CLSI)2020年版標(biāo)準(zhǔn)判定。結(jié)果判讀時(shí)觀察抑菌圈內(nèi)是否有菌落生長(zhǎng),根據(jù)生長(zhǎng)情況將菌株分為3類:(1)HR為抑菌圈內(nèi)有細(xì)菌生長(zhǎng);(2)非HR為抑菌圈內(nèi)無細(xì)菌生長(zhǎng);(3)完全耐藥為沒有抑菌圈。

1.3.2群體譜分析(PAP)實(shí)驗(yàn) PAP實(shí)驗(yàn)是確認(rèn)HR表型的金標(biāo)準(zhǔn)[5]。配制 0.25～32 μg/mL共8個(gè)質(zhì)量濃度梯度且含抗菌藥物的MH平板。菌株復(fù)蘇后接種于血平板37 ℃培養(yǎng)16～18 h后,挑取單個(gè)菌落接種于MH肉湯,37 ℃培養(yǎng)過夜以增菌,取50 μL菌液均勻涂布于配置好抗菌藥物的平板上,37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。對(duì)照菌株由國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心提供,為非HR的CHPA ATCC27853和完全耐藥的p2020(本實(shí)驗(yàn)室分離的菌株)。

2 結(jié) 果

2.1CHPA檢出情況

2.1.1K-B法初篩 139株臨床分離的Pae中初篩結(jié)果提示存在碳青霉烯HR,主要表現(xiàn)為碳青霉烯類藥物藥敏試驗(yàn)紙片的抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)了分散菌落。見圖1。

圖1 分離株對(duì)碳青霉烯HR的現(xiàn)象(K-B 法)

2.1.2確證試驗(yàn) 使用PAP對(duì)初篩HR陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行確證試驗(yàn)。HR菌株的PAP曲線隨抗菌藥物濃度升高而降低,并在抗菌藥物濃度高于最低抑菌濃度的平板上仍可生長(zhǎng)。非HR的CHPA ATCC27853 表現(xiàn)為在最低抑菌濃度附近菌落數(shù)急劇下降至無菌生長(zhǎng)。經(jīng)PAP確認(rèn),139株臨床分離株中有61株為CHPA菌株,HR率為43.88%。其中對(duì)IPM-HR檢出29株,HR率為20.86%;MEM-HR檢出19株,HR率為13.67%。同時(shí)對(duì) MEM 和 IPM 均表現(xiàn)為HR的CHPA有13株,占9.35 %。見表1、圖2。

表1 CHPA檢出結(jié)果[n(%),n=139]

圖2 分離株對(duì)碳青霉烯HR的PAP 分析

2.23種分離株的臨床特征情況比較 將確證試驗(yàn)中的3種分離株分別進(jìn)行比較,將只對(duì)IPM產(chǎn)生HR、對(duì) MEM 和 IPM 均產(chǎn)生HR的菌株作為IPM-HR分離株(42株),其余作為IPM-非HR分離株(97株)。將只對(duì)MEM產(chǎn)生HR、對(duì)MEM和IPM 均產(chǎn)生HR的菌株作為MEM-HR分離株(32株),其余作為MEM-非HR分離株(107株)。將對(duì)IPM和(或)MEM產(chǎn)生HR的菌株作為CHPA-HR分離株(61株),其余對(duì)兩種藥物都不產(chǎn)生HR的作為CHPA-非HR分離株(78株)。與IPM-非HR比較,IPM-HR男性、老年、侵入治療手段、多次感染比例及CO2CP測(cè)量值均更高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與MEM-非HR比較,MEM-HR 侵入治療手段、多次感染比例均更高,WBC、BUN、Cr測(cè)量值均更低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與CHPA-非HR比較,CHPA-HR男性、侵入治療手段、多次感染比例及CO2CP測(cè)量值均更高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3種分離株的臨床特征情況比較

2.3多因素Logistic回歸分析 將上述表2中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)進(jìn)行多因素Logistic回歸分析患者感染CHPA菌株的危險(xiǎn)因素。因變量為分離株的HR情況,自變量為侵入治療手段、多次感染、老年、男性、WBC、CO2CP、BUN、Cr。其中,WBC、CO2CP、BUN、Cr以實(shí)際測(cè)量值賦值,其余變量賦值見表3。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,侵入治療手段(OR=5.165,95%CI:1.158～23.033,P=0.031)、多次感染(OR=13.203,95%CI:3.698～47.136,P<0.001)、老年(OR=3.258,95%CI:1.054～10.076,P=0.040)和男性(OR=47.793,95%CI:4.406～518.371,P=0.001)是IPM-HR感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;而WBC升高(OR=0.848,95%CI:0.740～0.973,P=0.018)是IPM-HR感染的保護(hù)因素。多次感染(OR=3.582,95%CI:1.284～9.999,P=0.015)是MEM-HR感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。侵入治療手段(OR=16.046,95%CI:4.231～60.853,P<0.001)、多次感染(OR=14.700,95%CI:5.279～40.938,P<0.001)和男性(OR=3.312,95%CI:1.074～10.215,P=0.037)是CHPA感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;而WBC升高(OR=0.891,95%CI:0.798～0.995,P=0.041)是CHPA感染的保護(hù)因素。

表3 變量賦值

3 討 論

有研究表明,HR發(fā)生率涉及殺菌類抗生素,包括β-內(nèi)酰胺類、糖肽類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類和作用于厭氧菌的硝基咪唑抗生素,且對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的HR相對(duì)多見,對(duì)于革蘭陰性菌HR的文獻(xiàn)報(bào)道多集中在Pae、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和大腸埃希菌等臨床常見致病菌[8-9]。HR中更具耐藥性的亞群在無抗生素培養(yǎng)基中連續(xù)傳5～10代后,一部分可恢復(fù)到母菌的耐藥水平且同時(shí)保留HR的特性,而其他亞群則保持其高水平的抗性[10]。這些亞群難以被傳統(tǒng)微生物藥敏試驗(yàn)檢出,可能對(duì)細(xì)菌耐藥檢測(cè)產(chǎn)生很大影響,甚至影響患者預(yù)后。因此需要了解細(xì)菌HR的現(xiàn)狀。研究CHPA的流行情況、感染的危險(xiǎn)因素及臨床意義對(duì)耐藥性監(jiān)測(cè)和評(píng)估患者的預(yù)后至關(guān)重要。

本研究經(jīng)PAP確認(rèn),139株臨床分離株中61株為 CHPA 菌株,HR率為43.88%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,無菌體液標(biāo)本中CHPA分離株在中國(guó)西南部的檢出率可達(dá)80%以上,而廣東地區(qū)則在30%左右[11]。此外,本研究觀察到具有IPM-HR的CHPA分離株比MEM-HR更常見,這與其他地區(qū)的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不一致,可能與不同地區(qū)使用碳青霉烯治療嚴(yán)重感染的用藥習(xí)慣不同及碳青霉烯藥物處方增加造成的選擇壓力有關(guān)。

本研究大部分CHPA主要來源于重癥醫(yī)學(xué)科,可能是這些病區(qū)的患者基本都接受了侵入性治療并有留置管,而CHPA則是引起導(dǎo)管相關(guān)性細(xì)菌感染最主要的細(xì)菌之一[12]。侵入治療手段(OR=16.046,95%CI:4.231～60.853,P<0.001)是CHPA感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,也是CHPA發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素。侵入性操作對(duì)患者造成不同程度的損傷,人體的正常屏障受到破壞,長(zhǎng)期置管使得CHPA更容易感染這部分患者。有創(chuàng)性操作的插管內(nèi)壁上可檢出生物膜,而CHPA極易形成生物膜[13]。生物膜的特性表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng),延緩了抗菌劑的滲透,降低了微生物的生長(zhǎng)速率,促進(jìn)菌株中具有不同水平耐藥性亞群的出現(xiàn)[14]。另有研究表明,CHPA中分離的耐藥亞群比非CHPA菌株更容易形成生物膜,在CHPA的耐藥機(jī)制中,生物膜的形成與CHPA的發(fā)生具有相輔相成、互相促進(jìn)的作用[4]。而CHPA來源的標(biāo)本類型主要為痰,與呼吸機(jī)的應(yīng)用相關(guān)。有學(xué)者指出,少數(shù)CHPA同時(shí)存在對(duì)多種抗生素HR的現(xiàn)象[4]。本研究結(jié)果顯示,與MEM-非HR比較,MEM-HR 侵入治療手段、多次感染比例均更高,WBC、BUN、Cr測(cè)量值均更低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與CHPA-非HR比較,CHPA-HR男性、侵入治療手段、多次感染比例均更高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？赡芘c患者患有慢性基礎(chǔ)疾病相關(guān),患有多種基礎(chǔ)疾病的患者基礎(chǔ)情況較差、多數(shù)處于昏迷狀態(tài)或病情較重,使得這部分患者容易感染HR菌。

綜上所述,本院無菌體液分離的Pae中存在CHPA的情況。有學(xué)者指出,碳青霉烯類藥物消耗的增加與碳青霉烯HR菌株的生長(zhǎng)呈正相關(guān),常規(guī)推薦劑量的抗生素對(duì)HR細(xì)菌引發(fā)的感染并非最佳治療方案,若這些細(xì)菌長(zhǎng)期處在抗生素的壓力下容易引起耐藥基因的突變而發(fā)展為多重耐藥菌,導(dǎo)致治療失敗,甚至感染復(fù)發(fā)[14]。因此在進(jìn)行藥敏試驗(yàn)時(shí)可對(duì)易感人群補(bǔ)充臨床常用抗菌藥物的K-B法藥敏試驗(yàn),提高CHPA檢出率;在治療過程中應(yīng)合理使用抗生素,且避免長(zhǎng)期使用一種抗生素,且盡量聯(lián)合用藥,利用協(xié)同效應(yīng)達(dá)到療效,減少侵入性操作的次數(shù)、縮短置管時(shí)間等,進(jìn)一步防控CHPA的感染和傳播。