血清miR-520h和miR-376c對妊娠期高血壓患者發(fā)生妊娠結(jié)局不良的多因素分析及臨床價值

吳麗華,陳 辰,高玲玲

復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科,上海 200090

妊娠期高血壓(HDCP)是妊娠期特發(fā)疾病,其發(fā)病率為5%～10%,且呈逐年升高趨勢[1]。HDCP一般發(fā)生在妊娠20周至分娩后2周,表現(xiàn)為血壓升高,出現(xiàn)蛋白尿和水腫等癥狀,易導(dǎo)致多種妊娠結(jié)局不良的發(fā)生[2]。因此,發(fā)現(xiàn)早期預(yù)測HDCP患者發(fā)生妊娠結(jié)局不良的標(biāo)志物,對改善母嬰預(yù)后有重要意義。微小核糖核酸(miRNAs)是由22個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA,在基因的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[3]?，F(xiàn)有研究證實(shí),子癇前期(PE)患者足月胎盤和血漿中的miR-376c水平降低,其被認(rèn)為是PE診斷的標(biāo)志物。并發(fā)現(xiàn)miR-376c可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞活力、遷移和侵襲,其水平下降會導(dǎo)致孕婦妊娠并發(fā)癥的發(fā)生[4]。另一項(xiàng)研究顯示,miR-520h在孕婦細(xì)胞、胎盤和血液中呈高水平,故被認(rèn)為是PE診斷的重要標(biāo)志物[5]。miR-520h和miR-376c對HDCP患者發(fā)生妊娠結(jié)局不良的診斷價值尚未明確。本研究通過觀察HDCP患者血清miR-520h和miR-376c水平,分析其對HDCP患者發(fā)生妊娠結(jié)局不良的預(yù)測效能,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年1月至2022年12月于本院就診的HDCP患者128例作為HDCP組,HDCP組年齡24～43歲,平均(31.66±4.50)歲;孕周36～40周,平均(38.16±0.87)周。根據(jù)HDCP患者的疾病嚴(yán)重程度分為妊娠高血壓組54例,輕度PE組41例和重度PE組33例。另選取同期在本院體檢的健康孕婦75例作為對照組,年齡24～43歲,平均(31.04±4.96)歲;孕周36～40周,平均(37.92±0.80)周。納入標(biāo)準(zhǔn):患者符合HCDP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6];單胎妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn):病歷資料不完整;存在心、肝、腎等重要功能障礙;伴高血壓、冠心病和肺病等慢性疾病;合并腫瘤或其他免疫性疾病;智力低下和有精神疾病;未定期進(jìn)行產(chǎn)檢。HDCP組與對照組研究對象年齡、孕周比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。所有患者均知情同意,并簽署知情同意書,本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2方法

1.2.1血液標(biāo)本留取 留取所有研究對象的清晨空腹靜脈血10 mL,取5 mL放置在無抗凝劑的試管中,分離血清并將其放置在1.5 mL的離心管中,再將其置于在4 ℃的環(huán)境下按照3 000 r/min的速度離心10 min,然后以12 000 r/min的速度離心15 min,清除細(xì)胞沉積物后,將其置于-80 ℃的冰箱保存。另5 mL靜脈血用于測定血脂和miRNAs水平。采用全自動生化儀(OTA-400 型,沈陽萬泰醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司)測定血清血紅蛋白、總膽固醇和甘油三酯。留取HDCP患者24 h尿液,通過生化分析儀測定24 h尿蛋白。所有的試劑盒均為配套試劑盒,嚴(yán)格按照說明書操作。

1.2.2實(shí)時熒光定量PCR 提取總RNA:采用Trizol 法對血漿進(jìn)行總RNA提取,按照總RNA分離試劑盒說明書操作。合成cDNA:采用Taqman 探針法合成,首先配置反應(yīng)體系。RNA 4.5 μL,RNA引物1.5 μL,無水核糖核酸酶(RNase)0.4 μL,脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)0.2 μL,10×buffer 0.8 μL和抑制劑0.1 μL。反應(yīng)條件:在95 ℃的環(huán)境下先以起始模板預(yù)變性10 min,在中模板中95 ℃環(huán)境下變性15 s,在60 ℃環(huán)境下退火1 min,共循環(huán)40次。其中引物序列為miR-520h正向引物:5′-ACA AAGUGCUUCCCUUUAGA-3′,反向引物:5′-UCUAAAGGGAAGCACUUGUUU-3′。miR-376c正向引物:5′-GGGGACACTTTGGAC-3′,反向引物:5′-GGTCCGTGAGGGATGATGTC-3′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)正向引物:5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3,反向引物:5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。PCR反應(yīng)體系:dNTP 1.6 μL、10 μmol/L的正反向引物1.0 μL、Taq DNA 聚合酶1.0 μL、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2×)12.5 μL,加反應(yīng)反沖液至25.0 μL。PCR反應(yīng)條件:在95 ℃環(huán)境下變性10 s,在65 ℃環(huán)境下退火20 s,在75 ℃環(huán)境下延伸在15 s,共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt計(jì)算出miR-520h和miR-376c的水平。

1.2.3妊娠結(jié)局 選擇發(fā)生早產(chǎn)、胎膜早破、產(chǎn)后出血、胎兒生長受限、新生兒窒息和胎兒窘迫等的HDCP患者為妊娠結(jié)局不良組(55例),其余患者為妊娠結(jié)局良好組(73例)。

1.2.4觀察指標(biāo) 觀察HDCP組和對照組血清miR-520h和miR-376c水平變化;比較HDCP患者妊娠結(jié)局良好組與不良組的一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo);分析HDCP患者發(fā)生妊娠結(jié)局不良的多因素;比較不同嚴(yán)重程度HDCP患者的血清miR-520h和miR-376c水平;評估血清miR-520h和miR-376c水平對HDCP患者發(fā)生妊娠結(jié)局不良的預(yù)測效能。

2 結(jié) 果

2.1HDCP組和對照組患者血清miR-520h和miR-376c水平比較 HDCP組血清miR-520h水平高于對照組,而血清miR-376c水平低于對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 HDCP組和對照組患者血清miR-520h和miR-376c水平比較

2.2不同嚴(yán)重程度HDCP患者的血清miR-520h和miR-376c水平比較 重度PE組患者的血清miR-520h水平高于輕度PE組和妊娠高血壓組,輕度PE組患者的血清miR-520h水平高于妊娠高血壓組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);重度PE組血清miR-376c水平低于輕度PE組和妊娠高血壓組,輕度PE組低于妊娠高血壓組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同嚴(yán)重程度HDCP患者的血清miR-520h和miR-376c水平比較

2.3HDCP患者妊娠結(jié)局良好組與妊娠結(jié)局不良組的一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 兩組發(fā)病孕周、不同HDCP嚴(yán)重程度及收縮壓、24 h尿蛋白和血清miR-520h和血清miR-376c水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 HDCP患者妊娠結(jié)局良好組與不良組的一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較或n(%)]

2.4影響HDCP患者妊娠結(jié)局的二元Logistic回歸分析 將表3中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)[發(fā)病孕周(≥38周=1,<38周=0)、HDCP嚴(yán)重程度(妊娠期高血壓=1,輕度PE=2,重度PE=3)、收縮壓(≥131.12 mmHg=1,<131.12 mmHg=0)、24 h尿蛋白(≥5.97 g/24 h=1,<5.97 g/24 h=0)、miR-520h(≥2.70=1,<2.70=0)和miR-376c(≥1.67=1,<1.67=0)]進(jìn)行賦值,根據(jù)是否發(fā)生妊娠結(jié)局不良進(jìn)行二元Logistic回歸分析,結(jié)果顯示發(fā)病孕周≥38周、HDCP嚴(yán)重程度越高、血清miR-520h≥2.70是HDCP患者發(fā)生妊娠結(jié)局不良的危險因素(P<0.05),miR-376c≥1.67是HDCP患者發(fā)生妊娠結(jié)局不良的保護(hù)因素(P<0.05)。見表4。

表4 HDCP患者妊娠結(jié)局影響因素的二元Logistic回歸分析

2.5血清miR-520h和miR-376c水平對HDCP患者發(fā)生妊娠結(jié)局不良的預(yù)測效能 根據(jù)HDCP患者是否發(fā)生妊娠結(jié)局不良進(jìn)行Logistic分析,聯(lián)合應(yīng)用時建立回歸預(yù)測模型:Y= 1.39×XmiR-520h-3.73×XmiR-376c+1.65。結(jié)果顯示血清miR-520h和miR-376c聯(lián)合檢測的靈敏度為76.4%,特異度為94.5%,曲線下面積(AUC)為0.929高于miR-520h(AUC=0.805)和miR-376c(AUC=0.880)單獨(dú)檢測。見表5。

表5 血清miR-520h和miR-376c水平對HDCP患者發(fā)生妊娠結(jié)局不良的預(yù)測效能

3 討 論

HDCP是最常見的妊娠特有的并發(fā)癥,隨著病情加重,患者常發(fā)生妊娠結(jié)局不良。HDCP病理基礎(chǔ)是全身小血管痙攣導(dǎo)致胎盤供血減少,出現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足,引起母嬰并發(fā)癥發(fā)生[7-8]。目前尚未找有效預(yù)測HDCP患者發(fā)生妊娠結(jié)局不良的靈敏指標(biāo)。miRNA對細(xì)胞增殖、分化和凋亡有明顯的調(diào)控作用,在維持胎盤功能穩(wěn)態(tài)中起到重要作用,有望成為預(yù)測HDCP患者發(fā)生妊娠結(jié)局不良的靈敏指標(biāo)[9-10]。因此本研究采用血液作為標(biāo)本,檢測HDCP患者血清miR-520h、miR-376c水平,觀察其在HDCP患者發(fā)生妊娠結(jié)局不良的預(yù)測價值,因?yàn)閙iRNA在血液中較為穩(wěn)定,可以在反復(fù)凍融,且不同酸堿度和裂解酶的條件下保持miRNA的穩(wěn)定性,同時血液標(biāo)本易得,可重復(fù)檢測。

本研究表明,HDCP組血清miR-520h水平高于對照組,并且隨著HDCP嚴(yán)重程度升高而升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明miR-520h與HDCP的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。有研究證實(shí)miR-520h水平在晚期乳腺癌患者中明顯升高,認(rèn)為miR-520h是一種對癌細(xì)胞具有保護(hù)作用的RNA,是腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物[11-12]。有研究表明,miR-520h在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的絨毛組織中呈高水平,可導(dǎo)致DNA損傷,促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡,并提示miR-520h作為一種新的抑制因子可能與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有關(guān)[13]。有研究顯示,miR-520可通過抑制核因子-kB信號激活,減少炎癥因子釋放,調(diào)控炎癥的發(fā)生發(fā)展[14]。本研究通過二元Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)miR-520h水平升高是HDCP患者發(fā)生妊娠結(jié)局不良的危險因素(P<0.05),提示血清miR-520h水平越高,孕婦發(fā)生妊娠結(jié)局不良的可能性越高。因此對這類患者是否要采取干預(yù)措施,需進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示,HDCP組血清miR-376c水平低于對照組,并且血清miR-376c水平隨著HDCP嚴(yán)重程度升高而降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明miR-376c參與了HDCP的發(fā)生發(fā)展。miR-376c在多種腫瘤細(xì)胞中的水平不一,在子宮頸癌[15]和膽管癌[16]等腫瘤中呈高水平,而在卵巢癌[17]中呈低水平,作為抑癌基因參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為,從而影響腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡。在關(guān)于HDCP的研究中發(fā)現(xiàn),miR-376c水平在PE胎盤中明顯降低,并與胎盤細(xì)胞的增殖和胎盤的發(fā)育有關(guān),因此認(rèn)為胎盤miR-376c水平降低,可以導(dǎo)致胎盤異常發(fā)育甚至發(fā)生孕婦早產(chǎn)[18]。本研究顯示,miR-376c水平上升是HDCP患者發(fā)生妊娠結(jié)局不良的保護(hù)因素(P<0.05);血清miR-520h和miR-376c聯(lián)合預(yù)測HDCP患者發(fā)生妊娠結(jié)局不良的AUC為0.929,明顯高于各項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)預(yù)測,說明miR-520h和miR-376c在診斷HDCP患者發(fā)生妊娠結(jié)局不良方面具有某種互補(bǔ)性,2個基因水平具有某種平衡,這種平衡被打破可能導(dǎo)致患者發(fā)生妊娠結(jié)局不良,對于2個基因水平均異常的患者,是否需要采取進(jìn)一步的干預(yù)措施,需要在未來的研究中進(jìn)行證實(shí)。

總之,血清miR-520h和miR-376c參與HDCP的發(fā)生發(fā)展,聯(lián)合檢測miR-520h和miR-376c水平有助于預(yù)測HDCP患者妊娠結(jié)局。