金屬鹽強化乙醇預處理和添加劑聯合對楊木酶解的影響

朱光輝，黃心宇，毛翠平，謝君，張紅丹※

（1. 華南農業(yè)大學生物質工程研究院，廣州 510642；2. 山東天成工程咨詢有限公司，濰坊 261100）

0 引言

能源危機、環(huán)境污染和溫室效應使得人們迫切地需要尋找一種可以替代石化能源的可再生資源。生物質能源由植物體通過光合作用所得到，其儲量巨大、來源方便、可再生，可以直接轉化為化學品和液體燃料，其中，木質纖維素是生物質能源最主要的存在形式，通過生化轉化的手段將木質纖維素轉變成可發(fā)酵糖，并進一步轉化為燃料乙醇和化學品是生物煉制的重要途徑之一，從而受到了各國廣泛的關注和研究[1]。楊木作為一種速生豐產樹種，是一種極具潛力的生物質能源，它主要由纖維素、半纖維素和木素組成，它們相互連接，形成一種致密的抗降解屏障，這種結構將影響纖維素酶對楊木的可及性，從而影響酶解效率，進而增加纖維素乙醇的生產成本，因此預處理是將林木生物質轉化為燃料乙醇的最重要一步[2]。

有機溶劑預處理是指采用有機溶劑或其水溶液在100～250 ℃下去除木質纖維原料中的木素和/或半纖維素[3]，有機溶劑乙醇因其可回收、低毒和低成本的優(yōu)點而被廣泛應用于預處理過程中，然而僅靠半纖維素中乙酰基的脫落所形成的乙酸來催化乙醇預處理以降解木素和半纖維素是不夠的，因此需要在預處理過程中添加酸性催化劑以提高其酶解效率[4]。金屬鹽預處理因能實現木質纖維素組分的有效分離，達到傳統(tǒng)酸預處理效果的同時還可規(guī)避對設備腐蝕等缺點[5-6]，正逐漸替代傳統(tǒng)無機酸作為催化劑用于生物質原料的預處理。其作為催化劑進行預處理能有效水解半纖維素組分，原因在于酸性金屬鹽溶于水后生成的水合氫離子能有效破壞木質纖維素的緊密結構，并產生更易被酶水解的固體殘留物[7]，此外，路易斯酸中某些特定的離子對酶活性有積極影響[8]。

有機溶劑預處理和金屬鹽預處理的聯用(即金屬鹽強化的有機溶劑預處理)能夠在大量地去除木質素和半纖維素的情況下，保持較高的催化效率。ZHANG等[9]通過對比未處理的和分別經過FeCl3、CuCl2、AlCl3強化乙醇預處理后的巴沙木的酶解效率，發(fā)現預處理后樣品的糖得率在81.54%～85.81%，遠高于未處理的巴沙木直接酶解的葡萄糖得率9.98%。HAN等[10]在CuCl2強化的乙醇預處理后楊木酶解過程中進行茶皂素的添加，葡萄糖和木糖得率分別達到97.96%和87.1%。綜合以上研究報道，雖然對金屬鹽強化有機溶劑預處理和表面添加劑聯用能夠促進木質纖維素的酶解效率，但對不同金屬鹽強化有機溶劑預處理與不同種類添加劑聯用的作用效果及其機制不清楚。

本研究旨在探究不同金屬鹽強化乙醇預處理對楊木化學組成、預處理液糖成分、微觀物理結構和酶解葡萄糖產率的影響，分析酶解階段不同種類階添加劑(吐溫80、茶皂素、BSA、木聚糖酶)的添加對楊木酶解葡萄糖得率和增長率的影響，以期為進一步揭示金屬鹽強化乙醇預處理聯合添加劑對楊木酶解促進效果的影響機理提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中使用的楊木約0.5～0.1 mm，意大利楊，生長于河南，由華南農業(yè)大學木材加工廠提供，在室溫下用密封袋保存。楊木原料的化學成分含量根據美國國家可再生能源實驗室提出的方法進行測定[11]，其中纖維素的質量分數為45.56%、半纖維素的質量分數為14.98%、酸不溶木素的質量分數為22.86%、酸溶木素的質量分數為3.31%。

無水乙醇（分析純），購于中國國藥集團化學試劑有限公司。吐溫80(化學純)，購于科密歐化學試劑有限公司。牛血清白蛋白（化學純），購于伯奧生物科技有限公司。茶皂素（純度≥95%）和木聚糖酶（100 000 U/mg），皆購于上海麥克林生化科技有限公司。賽力二代纖維素酶，購于諾維信中國生物技術公司，采用DNS 方法測得其濾紙酶活為138 FPU/mL，于4 ℃冰箱中保存。FeCl3、CrCl3、CuCl2、FeCl2、ZnCl2、MnCl2、MgCl2、CaCl2、NaCl、LiCl、乙酸和乙酸鈉等化學藥品，皆為分析純，購于上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 金屬鹽強化乙醇預處理

準確稱量15 g 絕干楊木于300 mL 的高壓反應釜（Parr-4500,美國Parr 公司）中，加入150 mL 60%（體積比）的乙醇溶液，使其固液比為1:10，加入相當于0.025 mol/L 的金屬鹽（FeCl3、CrCl3、CuCl2、FeCl2、ZnCl2、MnCl2、MgCl2、CaCl2、NaCl 和LiCl），充分攪拌均勻后，蓋緊密封蓋，套上加熱套，設置轉速為300 r/min，在200 ℃下持續(xù)反應10 min[12]。當試驗溫度達到預定溫度時開始計時，反應結束后立即停止加熱，拆下加熱套，用流動水將其冷卻至室溫，然后進行真空抽濾分離預處理液體和殘渣，收集部分預處理液以測預處理液中的單糖和低聚糖。收集剩下的預處理殘渣，用自來水和去離子水充分洗滌至中性后，裝入密封袋，放入4 ℃冰箱中平衡水分，然后稱取少量預處理樣品進行水分含量測定，計算預處理后楊木的固體殘留率。

1.3 預處理樣品的酶解

準確稱取相當于2 g 不同金屬鹽強化乙醇預處理絕干樣品，分別加入含有100 mL pH 值為4.8 的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（0.05 mol/L）的150 mL 錐形瓶中，其固液比為2%，加入15 FPU/g 干物質的纖維素酶，混合均勻后放于50 ℃、150 r/min 的搖床中進行酶解，并在酶解時間為6、12、24、48 和72 h 時，分別取0.5 mL 上清液，沸水浴10 min 使其中的纖維素酶滅活，然后測量酶解液中的葡萄糖含量。

1.4 添加劑添加試驗

根據我們前期實驗結果，選取吐溫80、茶皂素、BSA 和木聚糖酶等4 種添加劑分別按照30、40、40、0.8 mg/g 底物進行添加，探究不同種類添加劑對酶解效率的影響[10]。

1.5 分析方法

1.5.1 組分分析

預處理液及酶解液中的葡萄糖、木糖含量通過高效液相色譜儀HPLC（UV-2 600,島津（香港）有限公司）測定，所用色譜柱為KS801 柱，配有示差折光檢測器。檢測條件為：流動相為經過脫氣處理的去離子水，流速為0.4 mL/min，柱溫為60 ℃；進樣量為10 μL，檢測運行時間為30 min[10]。

預處理液及酶解液中的葡聚糖、木聚糖含量的測定，需要先將低聚糖降解為單糖，再通過單糖的增加量計算。具體操作步驟為：取2 mL 預處理液于玻璃耐壓瓶中，加入10 mL 4%的稀硫酸，搖勻后置于高壓滅菌鍋中，在121 ℃下反應1 h，反應完成后，待高壓滅菌鍋內溫度降至室溫，將中和后液體通過HPLC 測量其中的總葡萄糖和總木糖含量。

1.5.2 掃描電鏡(SEM)分析

采用EVO18 掃描電鏡（Carl Zeiss AG,Germany）對楊木原料以及預處理樣品的微觀物理形態(tài)變化進行分析。取少量楊木原料以及預處理后的樣品，充分烘干后研磨粉碎，均勻地灑落在貼有導電雙面膠的樣品臺上，用吸耳球吹去未被粘牢的樣品顆粒，在真空環(huán)境下進行鍍金處理，在物料表面蒸鍍一層導電層后，進行掃描電鏡分析，攝像記錄，加速電壓為10 kV。

1.5.3 X-射線衍射（XRD）分析

楊木原料和預處理樣品的結晶度指數（XCrI）是用Bruker D8 AdvanceX 射線衍射儀（Bruker Corporation,Germany）測定的。采用Al 靶產生的X 射線（Ka=0.154 nm），用Ni 濾波片濾掉特定波長的光。衍射角（2θ）的掃描范圍為5°～80°，掃描速度為2°/min，掃描電壓30 kV，掃描電流30 mA。結晶度指數(XCrI)由衍射圖譜上結晶峰的強度與總強度（I002）的高度比確定[13]，如式（1）：

式中I002是22.5°左右的主峰的衍射強度，Iam是18°左右的無定形區(qū)域的衍射強度。

1.5.4 數據處理方法

酶解過程中葡萄糖得率及葡萄糖增長率的計算方式分別如式（2）和式（3）所示。

2 結果與分析

2.1 不同金屬鹽強化的乙醇預處理對楊木的影響

本研究探討了不同金屬鹽強化的乙醇預處理對楊木原料的影響，預處理后的固體回收率和化學組成分析如表1 所示。由表可知，楊木原料中葡聚糖、木聚糖、酸不溶性木質素（acid insoluble lignin,AIL）和酸溶性木質素（acid soluble lignin,ASL）的含量分別為45.56%、14.98%、22.86%和3.31%。經預處理后，樣品中半纖維素和木素的質量分數顯著降低，這是因為金屬鹽強化乙醇破壞木素和半纖維素中的酯鍵、醚健以及糖苷鍵所致[14]；由于木素和半纖維素的去除，使得預處理后楊木中纖維素含量迅速增加。對于FeCl3、CrCl3、CuCl2、FeCl2、ZnCl2和MnCl2等過渡金屬鹽強化的乙醇預處理樣品來說，半纖維素和木素的質量分數僅為2.27%～9.18%和5.49%～11.06%，而纖維素的質量分數增至70%左右，這說明半纖維素和木素的去除不僅能夠打破由纖維素、半纖維素和木素所形成的致密結構，而且纖維素含量的增加為后續(xù)纖維素酶的酶解提供更多地可接觸位點。對于堿土金屬鹽（MgCl2和CaCl2）和堿金屬鹽(NaCl 和LiCl)強化乙醇預處理樣品來說，半纖維素和木素的降解有限，從而得到較高的固體回收率，且纖維素的含量僅有些許升高。

表1 不同金屬鹽強化乙醇預處理對固體回收率及楊木組分的影響Table 1 Effect of metal-salts catalyzed ethanol pretreatment on solid recovery and chemical compositions of poplar %

由表1 可知，在金屬鹽強化的乙醇預處理過程中會發(fā)生半纖維素和木素的去除以及部分纖維素的降解，因此我們對預處理液中單糖和聚糖含量進行測定，結果如表2 所示。由表可知，預處理液中的總葡萄糖質量分數非常少（＜1.08 g/100 g 原料），且大部分是以低聚葡萄糖的形式存在，這說明金屬鹽強化的乙醇預處理可以保留楊木中大部分纖維素。對于金屬鹽強化的乙醇預處理來說，半纖維素降解產物總木糖的質量分數在2.20 g/100 g原料以上，最高可達4.83 g/100 g 原料，且大部分以低聚木糖的形式存在。由此可見，金屬鹽強化的乙醇預處理液中釋放的木糖比葡萄糖多，這是因為相對于結晶態(tài)纖維素來說，無定形態(tài)的半纖維素更容易降解[15-16]，且金屬鹽強化的乙醇預處理更有利于低聚木糖的回收，從而提升其利用價值。

表2 不同金屬鹽強化乙醇預處理液中糖的含量Table 2 Sugar content in metal-salts catalyzed ethanol pretreatment liquor g·(100 g)-1

2.2 預處理后樣品表征

為對比不同價態(tài)金屬鹽強化乙醇預處理楊木表面形貌和結晶度的影響，分別對三價態(tài)金屬鹽（FeCl3和CrCl3）、二價態(tài)過渡金屬代表（FeCl2）和堿土金屬代表（MgCl2）以及一價態(tài)金屬鹽（NaCl 和LiCl）進行表征分析。

2.2.1 掃描電鏡分析

對預處理前后楊木表面形貌放大2 000 倍后進行掃描電鏡分析，結果如圖1 所示。與預處理后樣品相比，未經處理的楊木表面完整光滑，纖維束排列整齊，這樣致密結構阻礙了纖維素酶對纖維素的進攻，不利于后續(xù)的酶水解。按照金屬鹽價態(tài)進行對比，可以發(fā)現一價態(tài)金屬鹽如NaCl 和LiCl 處理后的楊木表面仍然保持較為光滑的表面，出現少許裂紋。二價態(tài)金屬鹽如FeCl2和MgCl2處理后的楊木表面裂紋明顯增多并出現少量孔洞。而三價態(tài)金屬鹽如FeCl3和CrCl3處理后的楊木表面裂紋多，有較多的孔洞，表面粗糙。

圖1 楊木原料和不同金屬鹽強化乙醇預處理后樣品的SEM 圖像Fig.1 SEM images of raw and metal-salts catalyzed ethanol pretreated poplar

因此，可以得出不同金屬鹽強化的乙醇預處理后，楊木基質表面出現了裂紋和孔洞，變得松散、無序，使纖維暴露程度增大，結合表1 中不同預處理后楊木組分剩余的木質素和半纖維素，可以得出這是由于金屬鹽強化乙醇預處理過程中半纖維素和木素的去除，使原本的致密結構遭到破壞，為纖維素酶提供更多的活性位點，提高酶對纖維素的可及性，從而提高其酶解效率[17-18]。

2.2.2 不同預處理楊木結晶度分析

纖維原料的結晶度是影響酶解效率的一個重要影響因素。許多研究表明由于預處理能去除部分半纖維素或木素，進而改變纖維原料的結晶度，為此我們對楊木原料和不同金屬鹽強化乙醇預處理后樣品進行了X 射線衍射分析，并根據Segal 公式計算得出其相對結晶度。楊木原料的結晶度（CrI）為64.14%，經FeCl3、CrCl3、FeCl2、MgCl2、NaCl 和LiCl 強化的乙醇預處理后其CrI分別上升至78.63%、78.65%、78.92%、77.26%、75.79%和70.33%。我們推測這是因為在金屬鹽強化的乙醇預處理過程中，由于無定形態(tài)半纖維素和木素的脫除，使得預處理樣品中結晶態(tài)纖維素相對含量增加，導致了預處理樣相對結晶度增加[19]。為此，我們將結晶度與金屬鹽強化乙醇預處理過程中半纖維素和木素去除率進行相關性分析，結果如圖2 所示。由圖可知，金屬鹽強化乙醇預處理后樣品的結晶度與半纖維素和木素去除率均具有較強相關性，R2分別為0.801 3 和0.893 9，這說明隨著金屬鹽強化乙醇預處理中半纖維素或木素脫除的增加，預處理后樣品的結晶度逐漸增加。盡管金屬鹽強化乙醇預處理樣品的結晶度比楊木原料高，但是其酶解效率較楊木原料有很大提升，這是由于預處理過程中無定形態(tài)半纖維素和木素的去除使得更多的纖維素暴露在表面，有利于酶的進攻，進而提高了酶解效率；同時由于預處理后樣品中木素含量的降低，減少了木素對纖維素酶的無效吸附，為纖維素提供更多的游離酶，從而提升酶解效率[20]。

圖2 結晶度與木質素去除率和半纖維素去除率擬合Fig.2 Fitting of XCrI with the removal rate of hemicellulose and lignin.

2.3 不同金屬氯化物強化的乙醇預處理后楊木酶解的影響

為進一步評價預處理效果，我們對金屬鹽強化的乙醇預處理后樣品進行酶解，酶解葡萄糖得率如圖3 所示。由圖可知，對楊木原料直接進行酶解，24 h 后的葡萄糖得率為11.3%，當酶解時間延長到72 h 時，原料的葡萄糖得率降至9.9%。與楊木原料直接進行酶解相比，金屬鹽強化的乙醇預處理樣品的酶解效率有明顯提升，這主要是因為通過金屬鹽如FeCl3不僅可以去除楊木中木質素和碳水化合物之間的醚鍵和一部分的酯鍵，降低聚合度而且可以去除楊木中的半纖維素，從而暴露了結晶纖維素核心，增強酶解效果[21]。乙醇預處理同樣也可以去除木質素和碳水化合物之間的醚鍵，促進木質素分解成木質素碎片的能力，而乙醇脫木質素的動力學受到溶劑對木質素碎片的溶解能力的影響[22]，通過金屬鹽強化乙醇處理有助于木質素碎片溶解能力的提高，從而在去除半纖維素的同時提高對木質素的移除能力，從而極大的提高酶解效率。

圖3 不同金屬氯化物強化乙醇預處理對楊木酶解產葡萄糖得率Fig.3 Effect of different metal-salts catalyzed ethanol pretreatment on the glucose yield from poplar

可以發(fā)現，不同種類金屬鹽對酶解效率的提升作用不同。對于三價金屬鹽FeCl3和CrCl3強化的乙醇預處理楊木來說，酶解72 h 的葡萄糖得率分別為89.08%和75.06%。對于二價金屬鹽強化的乙醇預處理楊木來說，酶解72 h 的葡萄糖得率分別為72.51%（CuCl2）、86.45%（FeCl2）、66.96%（ZnCl2）、74.67%（MnCl2）、62.60%（MgCl2）和47.35%（CaCl2）。對于一價金屬鹽NaCl和LiCl 強化的乙醇預處理楊木來說，其酶解效率明顯低于三價和二價金屬鹽強化的乙醇預處理后楊木，僅為30.51%和32.58%。由以上分析可知，不難發(fā)現在不同金屬鹽強化的乙醇預處理對酶解葡萄糖收率的作用由大到小依次為：三價金屬氯化物、二價金屬氯化物、一價金屬氯化物[23]。

根據不同陽離子相對應的元素在元素周期表中的分布，這些金屬氯化物可分為：過渡金屬氯化物（FeCl3、CrCl3、CuCl2、FeCl2、ZnCl2和MnCl2）、堿土金屬氯化物（MgCl2和CaCl2）和堿金屬氯化物（NaCl 和LiCl）。在這些金屬鹽中，過渡金屬氯化物（FeCl3、CrCl3、CuCl2、FeCl2、ZnCl2和MnCl2）的加入顯著提升了乙醇預處理樣品的葡萄糖收率，這是因為金屬鹽陽離子具有路易斯酸的特性，有助于糖苷鍵的斷裂，脫除較多的半纖維素，破壞其致密結構，從而提升其酶解效率，但是由于不同金屬鹽接受電子的能力以及金屬離子間的離子半徑不同，使得不同其酸性不同，從而呈現不同的酶解效率[24-25]。堿土金屬陽離子（Mg2+和Ca2+）的電子受體能力弱于過渡金屬陽離子。與過渡金屬和堿土金屬陽離子相比，堿金屬陽離子（Na+和Li+）在接受電子方面表現最弱，對生物質原料中的酯鍵和糖苷鍵的斷裂最少，無法提高糖的回收率[26]。此外，根據前人的研究結果表明，Cl-離子的濃度高低也會影響木聚糖和纖維素的分解[27]。因此，乙醇預處理過程中三價金屬氯化物FeCl3和CrCl3的添加對預處理底物酶解產生了強烈的影響，促使酶解效率大大提升。而FeCl2添加的影響優(yōu)于CrCl3的影響，可能是因為：1）楊木經過CrCl3強化乙醇預處理后，其中的大部分半纖維素和木質素被去除，原本的纖維結構發(fā)生坍塌，纖維素與酶的可接觸面積減少，導致CrCl3強化乙醇預處理的酶解糖產率小于FeCl2；2）鉻作為重金屬元素會使纖維素酶變性和失活，導致Cr3+預處理楊木樣品酶解的效率變差。

2.4 添加劑對預處理后楊木樣品酶解的影響

2.4.1 吐溫80 的添加對預處理后楊木酶解效果的影響

由以上分析可知，楊木原料經過不同氯化物強化乙醇預處理后的酶解效果存在差異，為進一步提升其酶解效率，擬在酶解段進行添加劑（吐溫80、茶皂素、BSA、木聚糖酶）的加入以提升其酶解效率。

吐溫80（30 mg/g 底物）的加入對不同金屬鹽強化的乙醇預處理樣品酶解葡萄糖得率及其葡萄糖增長率的影響如圖4 所示。吐溫80 是一種非離子添加劑，酶解段吐溫80 的添加可以提高底物對纖維素分解酶的吸附/脫附能力，減少酶的非生產性結合和無效吸附，使纖維素酶可以降解更多的纖維素[28-29]。由圖可知，吐溫80 的加入對葡萄糖得率具有明顯提升作用，其中經FeCl3強化的乙醇預處理后樣品的葡萄糖的得率達到最大，酶解48 h 后，其葡萄糖得率為91.18%，高于未添加添加劑下酶解72 h 的葡萄糖得率（89.08%），繼續(xù)增加其酶解時間至72 h，可得最高葡萄糖得率為93.44%，此時其葡萄糖增長率隨著時間的延長從40.59%（6 h）逐漸降低至4.90%（72 h）。

圖4 吐溫80 的添加對不同金屬鹽強化乙醇預處理后楊木葡萄糖得率和葡萄糖增長率的影響Fig.4 Effects of tween 80 on glucose yield and increased glucose yield of poplar after different metal-salts catalyzed ethanol pretreatment

對于金屬鹽強化的乙醇預處理后樣品來說，其酶解過程中葡萄糖的增長率均呈現先增加后降低的趨勢，增長最明顯的是NaCl 強化的乙醇預處理，在酶解24 h 時，其最大增長率可達88.68%，盡管酶解72 h 后其葡萄糖增長率仍保持在76.53%，但是其葡萄糖得率僅為53.85%，這主要是歸因于NaCl 強化的乙醇預處理并未徹底地破壞楊木原料的致密結構，從而阻礙纖維素酶對纖維素的進攻，同時未被脫除的木素的在未添加吐溫80 的情況下對纖維素酶具有無效吸附作用，進而影響其酶解效率，而隨著吐溫80 的加入，未被脫除的木素與纖維素酶的結合減少，使得更多的纖維素酶吸附于纖維素表面，從而大幅提升其酶解效率[30]。除了NaCl 外，CaCl2、LiCl、ZnCl2、MnCl2強化的乙醇預處理后楊木在吐溫80 的作用下均表現出優(yōu)異的葡萄糖增長率（20.65%～51.12%，72 h），但是僅ZnCl2和MnCl2強化的乙醇預處理后樣品的葡萄糖得率增長至90.09%以上，這主要是由于添加添加劑吐溫80 時CaCl2和LiCl 強化的乙醇預處理后樣品較低的葡萄糖得率32.58%～47.35%。與此同時，對于FeCl2和MgCl2強化的乙醇預處理后樣品來說，盡管在酶解前期吐溫80 的加入能大幅提升其酶解效率，但酶解達72 h 時其葡萄糖得率沒有增加。

2.4.2 茶皂素的添加對預處理后楊木酶解效果的影響

圖5 所示為茶皂素的添加(40 mg/g 樣品)對不同的金屬鹽強化乙醇預處理樣品酶解葡萄糖產率和增長率的影響。由圖可知，除MgCl2強化的乙醇預處理樣品外，其余金屬鹽強化的乙醇預處理樣品均對葡萄糖得率明顯提升，酶解72 h 后其葡萄糖得率分別提升至FeCl3（92.30%）、CrCl3（83.12%）、CuCl2（87.32%）、FeCl2（87.84%）、ZnCl2（86.93%）、MnCl2（85.36%）、MgCl2（48.63%）、CaCl2（64.56%）、NaCl（45.94%）和LiCl（38.32%）。這是因為茶皂素作為一種天然添加劑，能夠促進纖維素酶在底物上的吸附，并介導吸附的酶的釋放，同時減少酶對木質素的無效吸附[31-32]。對于葡萄糖增長率來說，茶皂素的加入隨著酶解時間的延長仍然呈現先增加后減低的趨勢，酶解72 h 后其葡萄糖增長率仍保持在3.19%～66.93%之間，這說明茶皂素的加入對不同金屬鹽強化的乙醇預處理楊木酶解均有很好的促進作用，加快了酶解速度，并且增加了最終葡萄糖得率。

2.4.3 BSA 的添加對預處理后楊木酶解效果的影響

添加劑牛血清白蛋白（BSA）的加入（40 mg/g 樣品）對不同金屬鹽強化乙醇預處理樣品酶解效果的影響如圖6 所示。由圖可知，酶解6 h 時，除了CrCl3和CuCl2強化的乙醇預處理楊木，BSA 的添加對其葡萄糖得率沒有增加，隨著酶解時間的延長，在酶解進行24 h 時其葡萄糖增長率達到最大，以CuCl2強化的乙醇預處理樣品最為明顯，達到44.17%。這是因為酶解過程中BSA 的加入可防止酶與底物中木素的非生產性吸附，提高酶解過程中的游離酶含量，進而提高酶解葡萄糖得率，同時BSA 還可以減少了外切葡聚糖酶的失活[33-34]。然而繼續(xù)延長酶解時間至72 h 后，葡萄糖增長率相較24 h 時具有明顯下降，但仍對CrCl3、CuCl2、MnCl2、MgCl2、NaCl和LiCl 等強化的乙醇預處理楊木的葡萄糖得率具有明顯提升，使其最終的葡萄糖得率分別達83.58%、83.82%、80.31%、65.46%、25.64%和29.88%。

圖6 BSA 的添加對不同金屬鹽強化乙醇預處理后楊木葡萄糖得率和葡萄糖增長率的影響Fig.6 Effects of BSA on glucose yield and increased glucose yield of poplar after different metal-salts catalyzed ethanol pretreatment

2.4.4 木聚糖酶的添加對預處理后楊木酶解效果的影響

木聚糖酶的添加(0.8 mg/g 樣品)對不同金屬鹽強化乙醇預處理樣品酶解葡萄糖得率和葡萄糖增長率的影響如圖7 所示，除了FeCl3、CrCl3和MgCl2強化的乙醇預處理樣品外，其余金屬鹽強化乙醇預處理樣品在6 h 時均呈現不同程度的葡萄糖增長率（5.73%～34.30%），這是因為木聚糖酶通過部分溶解半纖維素，從而進一步增強酶對纖維素的可及性，同時與內切葡聚糖酶表現出良好的協(xié)同作用，進而提升酶解效率[35]。當酶解時間延長至24 h 時，CuCl2、MnCl2和MgCl2強化的乙醇預處理樣品達到最大的葡萄糖增長率，然而隨著酶解時間的延長（72 h），其葡萄糖增長率明顯下降，但CuCl2、ZnCl2、MnCl2和NaCl 等金屬鹽強化的乙醇預處理仍對葡萄糖得率具有一定的促進作用，酶解72 h 后其葡萄糖得率分別達到86.63%、68.51%、84.30%和31.39%。這主要是因為經CuCl2、ZnCl2、MnCl2和NaCl 等金屬鹽強化的乙醇預處理后，仍有較多的半纖維素殘留，殘留的半纖維素在木聚糖酶的作用下發(fā)生降解，從而為纖維素酶提供更多的反應活性位點，進而提升其酶解效率[36-37]。

圖7 木聚糖酶的添加對不同金屬鹽強化乙醇預處理后楊木葡萄糖得率和葡萄糖增長率的影響Fig.7 Effects of xylanase on glucose yield and increased glucose yield of poplar after different metal-salts catalyzed ethanol pretreatment

2.4.5 四種不同添加劑對酶解葡萄糖最終得率的影響

圖8 對比分析了4 種添加劑的使用對不同金屬鹽強化的乙醇預處理樣品酶解72 h 葡萄糖得率影響。如圖可知，在酶解階段加入吐溫80，相較無添加劑的酶解，經FeCl3、CrCl3、CuCl2、ZnCl2、MnCl2、CaCl2、NaCl 和LiCl 預處理后樣品酶解葡萄糖得率均有提升。在酶解階段加入茶皂素，相較無添加劑的酶解，經FeCl3、CrCl3、CuCl2、FeCl2、ZnCl2、MnCl2、CaCl2、NaCl 和LiCl 預處理后樣品酶解葡萄糖得率均有提升。在酶解階段進行BSA 的添加，相較于無添加劑的酶解，經CrCl3、CuCl2、ZnCl2、MnCl2、MgCl2和CaCl2預處理的樣品酶解葡萄糖得率有所提升。在酶解階段加入木聚糖酶，相較無添加劑的酶解，經CuCl2、FeCl2、ZnCl2、MnCl2和NaCl預處理的樣品酶解葡萄糖得率均有提升。由以上分析可知，吐溫80、茶皂素、BSA 和木聚糖酶等添加劑的使用對不同金屬鹽強化的乙醇預處理樣品的最終葡萄糖得率有不同程度的提升，同時添加劑的使用加快了酶解速度，縮短酶解時間，在吐溫80 的作用下，FeCl3強化的乙醇預處理后樣品酶解葡萄糖最高得率達93.44%。

圖8 四種添加劑對不同金屬鹽強化乙醇預處理后楊木72 h 葡萄糖得率比較Fig.8 Effect of additives on the glucose yield after 72 h hydrolysis for different metal-salts catalyzed ethanol pretreated poplar

3 結論

本文研究了不同金屬鹽強化乙醇預處理對楊木化學組成、預處理液糖成分、微觀物理結構和酶解葡萄糖產率的影響，并進一步研究了不同種類添加劑對楊木酶解葡萄糖得率和增長率的影響，主要結論如下：

1）通過對楊木進行不同金屬鹽強化乙醇預處理，發(fā)現三價和二價金屬鹽對半纖維素和木素的降解較為明顯，通過對其進行SEM 和結晶度分析可知，其楊木纖維所形成的致密結構遭到破壞，纖維素含量的增加導致其相對結晶度升高，暴露更多的可接觸位點，從而提升其酶解效率。不同價位金屬鹽對酶解葡萄糖得率的作用從強到弱排序為：三價金屬鹽、二價金屬鹽、一價金屬鹽。

2）通過分析4 種添加劑的加入對金屬鹽強化乙醇預處理楊木酶解葡萄糖得率和葡萄糖增長率的影響，發(fā)現添加劑的加入可提升酶解速度、縮短酶解時間、增加酶解效率。其中，添加劑吐溫80 對金屬鹽強化乙醇預處理樣品的適用范圍最廣，效果更優(yōu)異，將吐溫80 加入到FeCl3強化的乙醇預處理后楊木的酶解過程中，可獲得最高的葡萄糖得率為93.44%。