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    基于高通量測序分析玉米浸泡液細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及多樣性

    2023-09-13 06:19:32陳麗王敬敬賀明君黎銘軒劉陽
    食品研究與開發(fā) 2023年17期
    關(guān)鍵詞:浸泡液乳酸菌群落

    陳麗,王敬敬,賀明君,黎銘軒,劉陽,2*

    (1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 佛山 528225;2.全國名特優(yōu)新農(nóng)產(chǎn)品全程質(zhì)量控制技術(shù)佛山中心,廣東 佛山 528000)

    玉米淀粉生產(chǎn)工藝包括濕法工藝和干法工藝,干法工藝中的脂肪和蛋白質(zhì)含量高,但淀粉純度較低,所以大部分工廠普遍采用濕法工藝制備玉米淀粉[1]。濕法工藝又分為靜止浸泡法和逆流浸泡法,靜止浸泡法操作簡單,但隨著浸泡時(shí)間的延長,浸泡液中的滲透作用逐漸達(dá)到平衡,玉米粒中的可溶性物質(zhì)不再析出,導(dǎo)致玉米淀粉提取率較低,所以此方法不適用于工廠。逆流浸泡法又稱擴(kuò)散法,由若干個(gè)浸泡罐、管道和泵組成,多個(gè)浸泡罐利用管道串聯(lián)在一起,形成浸泡罐裝置,通過裝置的連接作用,使浸泡液沿著裝玉米相反的方向流動(dòng)[2]。逆流浸泡法可以使新鮮的玉米籽粒中所包含的可溶性物質(zhì)與浸泡液溶液的濃度差始終保持在一個(gè)恒定的狀態(tài),充分提取玉米中的可溶性物質(zhì)[3],相比于靜止浸泡法,逆流浸泡法能提高玉米淀粉的提取率。因此,逆流浸泡法被大多數(shù)工廠采用[4]。

    玉米浸泡液是玉米粒在玉米淀粉生產(chǎn)過程中,通過濕法工藝得到的玉米加工副產(chǎn)物[5]。在浸泡過程中玉米浸泡液會(huì)產(chǎn)生大量微生物,特定的浸泡環(huán)境會(huì)使微生物大量繁殖,主要包括乳桿菌、短粗桿菌、芽孢桿菌、酵母菌等。其中乳酸菌在玉米淀粉提取階段起主要作用,乳酸菌產(chǎn)生的乳酸,在浸泡過程中也起著重要的作用。玉米顆粒中的蛋白質(zhì),在維持浸泡過程中的Ca 和Mg 金屬離子濃度的同時(shí),還能促進(jìn)乳酸引起的玉米粒的膨脹和轉(zhuǎn)換,減少不溶性物質(zhì)沉淀[6]。劉慶艾等[7]從玉米浸泡液篩選乳酸菌再加入到玉米浸泡液中,使得玉米淀粉提取率從59.22%提高到63.23%,浸泡周期從傳統(tǒng)的20 h 減少為10 h。叢澤峰等[8]的研究表明人為添加乳酸菌到玉米浸泡液中,既會(huì)提高玉米浸泡液的質(zhì)量,同時(shí)也會(huì)縮短浸泡周期??梢娪衩捉菀褐械奈⑸锒鄻有院途航Y(jié)構(gòu)對于改善玉米淀粉提取工藝幫助較大。

    本研究利用Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)對玉米浸泡副產(chǎn)物中的新、老酸玉米浸泡液進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA V3~V4 測序,獲得玉米浸泡液新酸、老酸中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的組成及微生物多樣性,為玉米逆流浸泡階段的研究和提取玉米淀粉工藝改進(jìn)和優(yōu)化提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    隨機(jī)采集市售的不同批次老酸玉米浸泡液和新酸玉米浸泡液,新酸的SO2含量為1 300~1 500 mg/L,固形物少,老酸中SO2含量為80~120 mg/L,固形物多,浸泡溫度均為49~52 ℃。X 代表老酸,L 代表新酸,每個(gè)樣品取3 個(gè)生物學(xué)重復(fù),樣品信息見表1。

    表1 樣品名稱及分組信息Table 1 Sample names and group assignment

    E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 試劑盒:美國Omega Bio-tek 公司;瓊脂糖:西班牙biowest 公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒:美國Axygen 公司;建庫試劑盒:美國Bioo Scientific 公司;MiSeq Reagent Kit 測序試劑盒:美國Illumina 公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    5430 R 小型離心機(jī)、5424R 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī):德國Eppendorf 公司;NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì):美國Thermo Fisher Scientific 公司;DYY-6C 電泳儀:北京市六一儀器廠;BioTek ELx800 酶標(biāo)儀:美國Biotek 公司;ABI GeneAmp?9700 型聚合酶鏈反應(yīng)核酸擴(kuò)增儀:美國ABI 公司;Illumina Miseq 測序儀:美國Illumina 公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 樣品前處理

    將玉米浸泡液灌裝至500 mL 無菌藍(lán)蓋瓶中,低溫條件下運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室,于-80 ℃冰箱保存,備用。

    1.3.2 DNA 提取

    玉米浸泡液中微生物總DNA 的提取按照E.Z.N.A.?SoilDNAKit 試劑盒操作指導(dǎo)書進(jìn)行。吸取3μL DNA利用超微量分光光度計(jì)測定樣品OD 值,計(jì)算DNA純度,以電泳儀檢測核酸樣本的完整性,將檢測合格的DNA 提取物置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.3 聚合酶鏈反應(yīng)核酸擴(kuò)增

    參考鄧高文等[9]的方法進(jìn)行樣品細(xì)菌16S rRNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增及高通量測序Illumina MiSeq,使用338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')通用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增。將PCR 產(chǎn)物合格的樣品送至上海美吉生物技術(shù)有限公司進(jìn)行高通量測序。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    采用Illumina Miseq 的Miseq PE300 平臺(tái)測序,將測序得到的序列進(jìn)行拼接和過濾,按照97%的相似度進(jìn)行操作分類,使用OTU 分類單位(operational taxonomic units,OTU)[10]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 玉米浸泡液菌群α 多樣性分析

    玉米浸泡液細(xì)菌α 多樣性指數(shù)測定結(jié)果見表2。

    表2 玉米浸泡液細(xì)菌α 多樣性指數(shù)測定結(jié)果Table 2 Bacterial α-diversity indexes in corn soaking solution

    由表2 可知,在不同的玉米浸泡液樣本中進(jìn)行測序,得到的有效序列242 178 條,其中覆蓋率均達(dá)到了0.99,試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明覆蓋率高,測序深度可靠,所測序結(jié)果能夠真實(shí)反映玉米浸泡液中新酸、老酸樣品的細(xì)菌群落組成。

    α 多樣性通常用以下指數(shù)來評估[11],一是樣品物種的豐度(包括Chao 指數(shù)和ACE 指數(shù)),二是物種的多樣性(包括Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)),老酸中的Chao 指數(shù)比新酸更高,可能是因?yàn)殡S著浸泡時(shí)間的延長,浸泡液中的pH 值不斷升高,浸泡環(huán)境呈酸性,導(dǎo)致不耐受酸性的細(xì)菌逐漸消失,所以新酸樣品中細(xì)菌的群落豐度和多樣性降低。

    另外Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)反映了樣本物種的多樣性,Shannon 指數(shù)逐漸增大,代表樣本指數(shù)多樣性越高。由測序結(jié)果可見,玉米浸泡液老酸中的Shannon 指數(shù)高于新酸,可見玉米浸泡液樣品老酸中的菌群多樣性大于新酸。

    2.2 菌群結(jié)構(gòu)分析

    2.2.1 基于門水平玉米浸泡液中群落結(jié)構(gòu)分析

    在門水平上,圖1 顯示了根據(jù)豐度水平排名前10的物種,其他物種均被合并為其他。

    圖1 基于門水平玉米浸泡液的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.1 Bacterial community structure in corn soaking solution at the phylum level

    從圖1 可以看出,優(yōu)勢菌門有厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteriota)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidota)。在樣品中均檢測出厚壁菌門(Firmicutes),相對豐度均大于50%,表明在玉米浸泡液的浸泡過程中,厚壁菌門占主導(dǎo)地位,這也是因?yàn)楹癖诰T的部分厭氧菌可以在低氧、酸性和高酒精的環(huán)境中可以生存[12],其中屬于厚壁菌門中的乳酸菌也可以在低氧、低酸的環(huán)境下生長,由此可見,厚壁菌門在玉米浸泡的第一階段起著重要作用。

    2.2.2 基于目水平玉米浸泡液中群落結(jié)構(gòu)分析

    基于目水平玉米浸泡液的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)見圖2。

    圖2 基于目水平玉米浸泡液的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Bacterial community structure in corn soaking solution at the order level

    如圖2 所示,在目水平上,根據(jù)物種注釋結(jié)果,采用最大值排序法,選取在目水平最大豐度排名前10 的物種,老酸中有乳酸桿菌目(Lactobacillales)、芽孢桿菌目(Bacillales)、棒狀桿菌目(Corynebacteriales)、伯克霍爾德菌目(Burkholderiales)、類芽孢桿菌目(Paenibacillales)、梭菌目(Clostridiales)等,新酸中主要以乳酸桿菌目(Lactobacillales)為主。可見在玉米逆流浸泡的過程,新酸、老酸中主要以乳酸桿菌目為主。研究表明,在逆流浸泡階段,乳酸菌占主導(dǎo)地位,乳酸菌在生產(chǎn)過程中產(chǎn)乳酸,乳酸可以破壞玉米籽粒中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),使得可溶性物質(zhì)析出,從而提高玉米淀粉的產(chǎn)率[13]。在浸泡過程中,乳酸桿菌目這類菌種與亞硫酸共同作用,能改善浸泡周期過長的缺點(diǎn),促進(jìn)淀粉與蛋白質(zhì)分離,提高玉米淀粉產(chǎn)量。此外,也有研究證明,破壞蛋白質(zhì)與淀粉顆粒的結(jié)合,從而使蛋白能更好地溶出[14]。

    2.2.3 基于屬水平玉米浸泡液中群落結(jié)構(gòu)分析

    基于屬水平玉米浸泡液的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)見圖3。

    圖3 基于屬水平玉米浸泡液的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Bacterial community structure in corn soaking solution at the genus level

    從圖3 可以看出,老酸樣品中相對豐度最高的屬為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)。新酸中主要測到了乳酸桿菌屬(Lactobacillus),可見玉米浸泡液主要優(yōu)勢菌為乳酸桿菌屬。乳酸菌在玉米浸泡過程中發(fā)揮著重要作用,乳酸菌大多是厭氧菌或是部分厭氧的細(xì)菌[15],在浸泡期間可以在厭氧條件下生長和繁殖,它在發(fā)酵過程中具有重要的生物結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)功能[16],隨著玉米浸泡發(fā)酵期延長,在發(fā)酵體系中乙醇的濃度和酸度不斷地上升,含氧量逐漸下降,幾乎所有無法承受高酸度、高乙醇濃度和厭氧條件的微生物均逐漸減少,乳酸菌成為絕對優(yōu)勢菌。優(yōu)勢乳酸菌從糖類中產(chǎn)生乳酸和乙酸,造成浸泡液中的pH 值升高,高濃度的酸性環(huán)境會(huì)抑制其他細(xì)菌的生長繁殖,同時(shí),乳酸菌可以產(chǎn)生細(xì)菌素等拮抗物質(zhì),通過與其他微生物競爭底物來影響其他微生物的生長[17-19],乳酸菌還能降解其中的蛋白質(zhì),使浸泡液中的不可溶性物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇芪镔|(zhì),更利于后續(xù)的清洗工作[20]。因此,乳酸菌在浸泡過程中占有絕對優(yōu)勢。

    3 結(jié)論

    本試驗(yàn)利用Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)對玉米淀粉逆流浸泡階段中的新酸、老酸玉米浸泡液樣品中的微生物多樣性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)乳酸菌(Lactobacillus)在兩種樣品中均存在,說明在玉米浸泡這個(gè)重要階段乳酸菌(Lactobacillus)占據(jù)主導(dǎo)地位。研究表明,乳酸菌(Lactobacillus)影響玉米浸泡液的質(zhì)量從而影響玉米淀粉的提取質(zhì)量。本研究為玉米淀粉生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供了參考,同時(shí)為篩選玉米浸泡液中的優(yōu)勢菌群奠定基礎(chǔ)。

    試驗(yàn)結(jié)果表明,老酸浸泡液的細(xì)菌含量比新酸更豐富。原因可能為老酸浸泡液中營養(yǎng)物質(zhì)豐富,細(xì)菌在此條件下不斷生長繁殖;隨著浸泡時(shí)間的延長,浸泡環(huán)境逐漸呈酸性,酸性條件會(huì)抑制雜菌的生長,細(xì)菌豐度降低。因此,與老酸相比,新酸中的細(xì)菌群落降低。

    SO2濃度隨著浸泡時(shí)間的延長而增加,亞硫酸濃度增加,首先通過胚芽作用于玉米皮,使胚芽變鈍,表皮由半滲透膜變?yōu)闈B透膜,便于谷物中可溶性物質(zhì)浸出到玉米浸泡液中。添加亞硫酸被用來作為減少玉米浸泡中的可溶性物質(zhì)的手段,其作用是將玉米粒中的一些不溶性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為可溶性蛋白質(zhì),從而提高玉米淀粉的提取率。同時(shí)浸泡玉米的最佳溫度為50 ℃左右,一些細(xì)菌不能在高溫下生長,因此可以通過減少在50 ℃環(huán)境下不能生長的致病和有害細(xì)菌,提高玉米淀粉的質(zhì)量。

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