壯筋養(yǎng)血湯介導(dǎo)MAPK/P38-ERK通路調(diào)控成骨成脂分化的作用機制

溫蕊嘉 董鑫 莊皓文 王俊巖 張錦芳

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510405

2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510405

3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,廣東 廣州 510006

4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院(福田),廣東 深圳 518000

骨骼是人類及脊椎動物運動系統(tǒng)中的重要組成部分,與個體的生長發(fā)育、行動與生存能力密切相關(guān)。隨著個體年齡的增長,骨形成能力逐漸減弱,而骨吸收能力逐漸增強,從而引起骨代謝紊亂,最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥等骨疾病[1]。大多數(shù)骨質(zhì)疏松癥患者骨髓中脂肪細(xì)胞增多,導(dǎo)致骨質(zhì)流失[2]。骨髓脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞由共同的祖細(xì)胞-骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)發(fā)育而來。BMSCs是一類起源于中胚層的成體干細(xì)胞,具有自我更新及多向分化潛能,在一定微環(huán)境下分化為成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞[3]。在自然狀態(tài)下,成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞維持動態(tài)平衡,并可在特定條件下進行轉(zhuǎn)化,一旦這種動態(tài)平衡被打破,則會導(dǎo)致一系列骨代謝疾病[4-5]。因此,維持成骨與成脂的平衡可能是預(yù)防或治療骨代謝疾病的一種候選治療方法[6-7]。

骨橋蛋白(osteopontin,OPN)與Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)為成骨分化早期標(biāo)志物,對骨組織的形成和重建起著重要作用?，F(xiàn)代研究表明,在BMSCs向成骨細(xì)胞分化的過程中,RUNX2激活骨基質(zhì)蛋白如ALP、OPN、骨涎蛋白等的表達,同時可以調(diào)控骨形成的進程[8]。過氧化物酶體增殖物激活受體 (peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs) 的亞型PPARγ與CCAAT增強子結(jié)合蛋白α(C/EBPα) 是BMSCs成脂分化通路的晚期分子標(biāo)志物,對BMSCs成脂分化起關(guān)鍵性調(diào)控作用。BMSCs的活性降低及成骨與成脂分化平衡失調(diào)可導(dǎo)致骨再生減少,是大多骨代謝疾病的重要病理基礎(chǔ)之一。研究發(fā)現(xiàn)MAPK/ERK通路是骨機械和激素信號的重要中介,通過RUNX2和PPARγ的磷酸化刺激成骨細(xì)胞的生成并抑制脂肪的生成[9]。LncRNA與成骨分化有直接關(guān)系,可以調(diào)節(jié)BMSCs的成骨和成脂分化[10]。LncRNA ANRIL最初是由Pasmant等人在研究黑色素瘤時發(fā)現(xiàn),現(xiàn)有研究表明LncRNA ANRIL通過調(diào)控MiR-125a-3p/MAPK信號通路抑制卵巢癌細(xì)胞增殖[11],ANRIL通過miR-125a-3p/FGFR1/MAPK信號通路促進頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的進展[12]。然而LncRNA ANRIL在BMSCs成骨成脂中的調(diào)控機制尚不清晰。中醫(yī)學(xué)治療骨科疾病的歷史悠久,壯筋養(yǎng)血湯(Zhuangjin Yangxue Decoction,ZJYXD)是《傷科補要》中活血壯筋的經(jīng)典方劑,具有養(yǎng)血活絡(luò)、強筋壯腰的功效。本研究擬通過體外及體內(nèi)實驗探討壯筋養(yǎng)血湯通過LncRNA ANRIL對成骨成脂分化的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:用于制備含藥血清的實驗動物:SPF級7～8周雄性SD大鼠,共8只,體質(zhì)量180～200 g;用于提取骨髓間充質(zhì)細(xì)胞和造模的實驗動物:SPF級6～8周齡C57BL/6雄性小鼠32只,體質(zhì)量20～25 g。倫理申請?zhí)?20210119002,申請單位:廣州中醫(yī)藥大學(xué)。購買及飼養(yǎng)均在廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,許可證號:[SYXK(粵)2018-0001]。

1.1.2藥品與試劑:壯筋養(yǎng)血湯(白芍9 g、當(dāng)歸9 g、川芎6 g、川斷12 g、紅花5 g、生地12 g、牛膝9 g、牡丹皮9 g、杜仲6 g,廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院);β-甘油磷酸鹽(貨號G9422),地塞米松(貨號D4902),L-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽(貨號49752),吲哚美辛(貨號I8280),胰島素(貨號 I5523),3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(貨號I5879),美國默克公司;α-MEM培養(yǎng)基(貨號12571063),PBS(貨號8121447),FBS(貨號2173969RP),Lipofectamine 3000 Reagent(貨號:L3000001),美國賽默飛公司;電泳液(貨號P0561),BCA試劑盒(貨號P0012S),凝膠制備試劑盒(貨號P0690),堿性磷酸酶檢測試劑盒(貨號P0321S),BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(貨號C3206),茜素紅S染色液(貨號C0140),改良油紅O染色試劑盒(貨號C0158S),中國上海碧云天生物科技有限公司;CCK-8試劑盒(貨號CA1210),全蛋白提取試劑盒(貨號BC3710),北京索萊寶科技有限公司;顯影液(貨號KGP1121),中國南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;β-actin抗體(貨號20536-1-AP),PPARγ抗體(貨號16643-1-AP),C/EBPα抗體(貨號18311-1-AP),OPN抗體(貨號25715-1-AP),RUNX2抗體(貨號20700-1-AP),P-ERK抗體(貨號28733-1-AP),ERK1/2抗體(貨號51068-1-AP),P38抗體(貨號14064-1-AP),武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.1.3主要儀器:酶標(biāo)儀(型號Multiskan FC,美國賽默飛公司);倒置熒光顯微鏡(型號IX73),日本奧林巴斯公司;實時熒光定量PCR儀(型號CFX96),全自動凝膠成像系統(tǒng)(型號Gel Doc EZ),高壓電泳儀(型號Power Pac TMB asic),美國伯樂公司;離心機(型號Allegra X-30R),美國貝克曼公司;多模式小動物活體成像系統(tǒng)(型號FX Pro),美國Bruker公司。

1.2 方法

1.2.1大鼠含藥血清的制備:壯筋養(yǎng)血湯制備水煎液,加熱濃縮至含藥濃度1 g/mL。參照大鼠與人等劑量換算公式,ZJYXD劑量為8.085 g/kg進行灌胃,2次/d,連續(xù)灌胃1周。末次灌胃2 h后,深度麻醉大鼠,通過腹主動脈進行采血,制備血清,56 ℃水浴滅活1 h,過濾后凍存用于后續(xù)試驗。

1.2.2BMSCs原代細(xì)胞的提取:取6～8周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠8只,麻醉處死后,取雙下肢股骨,按文獻[13]中具體操作提取細(xì)胞。待細(xì)胞密度至80 %左右時,消化后進行傳代培養(yǎng)。

1.2.3小鼠股骨橫斷骨折模型:選用小鼠股骨橫斷骨折模型為實驗研究對象,具體方法參照文獻[14],選取髓內(nèi)針作為固定方法,縫合收緊,標(biāo)記骨折部位。

1.2.4CCK-8實驗檢測BMSCs細(xì)胞增殖活力:使用CCK-8試劑盒測定不同濃度的ZJYXD含藥血清對BMSCs細(xì)胞增殖的影響。細(xì)胞分別按0 %、2 %、4 %、6 %、8 %、10 %含藥血清分組進行相應(yīng)的處理,隨后按CCK-8試劑盒說明書進行操作。

1.2.5慢病毒感染BMSCs并進行分組給藥:取對數(shù)生長期的BMSCs細(xì)胞接種于6孔板中,分別將空載(NC)和LncRNA過表達(ANRIL)慢病毒按照Lipofectamine3000 Reagent試劑盒說明書轉(zhuǎn)染至BMSCs。將細(xì)胞分為NC組(陰性對照組),NC +ZJYXD組(對照組+6 % ZJYXD含藥血清組),ANRIL組(LncRNA ANRIL過表達組),ANRIL+ZJYXD組(LncRNA ANRIL過表達組+6 % ZJYXD含藥血清組)。隨后使用熒光顯微鏡觀察感染效率,qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中ANRIL mRNA的表達。

1.2.6成骨、成脂誘導(dǎo)各組BMSCs:細(xì)胞以每孔5×105個接種于12孔板中,貼壁后進行成骨、成脂誘導(dǎo)。成骨及成脂誘導(dǎo)分別按照文獻[15]說明進行誘導(dǎo)。每3天更換一次培養(yǎng)基。

1.2.7堿性磷酸酶、茜素紅染色及定量分析檢測各組細(xì)胞成骨能力:成骨誘導(dǎo)后第7天進行堿性磷酸酶染色與定量分析。對于堿性磷酸酶染色,根據(jù)BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒中的方案進行配制操作,于掃描儀上進行觀察。對于堿性磷酸酶的定量檢測,根據(jù)堿性磷酸酶檢測試劑盒說明書進行操作,置于酶標(biāo)儀檢測吸光值。成骨誘導(dǎo)后第14天進行茜素紅染色及定量分析。對于茜素紅染色,細(xì)胞進行固定后,加入茜素紅S染液,隨后清洗3～5次,置于掃描儀觀察拍照。對于茜素紅鈣鹽定量分析,取染色后孔板加入10 %氯化十六烷基吡啶,收集液體于560 nm檢測吸光值。

1.2.8油紅O染色檢測各組細(xì)胞成脂能力:成脂誘導(dǎo)7 d后進行油紅O染色,吸出培養(yǎng)基,4 %多聚甲醛進行固定,根據(jù)改良油紅O染色試劑盒說明進行溶液配制,染色30 min,隨后ddH2O清洗置于顯微鏡下拍照。

1.2.9qRT-PCR檢測成骨、成脂相關(guān)mRNA基因的表達:將細(xì)胞均勻鋪于六孔板上,根據(jù)分組進行不同處理,待細(xì)胞貼壁后,進行成骨成脂誘導(dǎo),誘導(dǎo)7 d后將細(xì)胞消化,離心提取RNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄,根據(jù)定量PCR試劑盒提供的方案進行加板上樣。使用實時熒光定量PCR法進行擴增,隨后進行定量分析,檢測相關(guān)基因的表達。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.10Western Blot法檢測成骨成脂及相關(guān)通路蛋白的表達:對細(xì)胞進行蛋白提取,運用BCA蛋白濃度定量法對蛋白濃度進行定量;采用SDS-PAGE凝膠經(jīng)80～120 V電泳分離目標(biāo)蛋白,隨后轉(zhuǎn)膜;5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入一抗(1∶1 000),4 ℃孵育過夜;加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h,隨后加入顯影液避光進行顯影,其中內(nèi)參為β-actin,使用軟件ImageJ進行結(jié)果分析。

1.2.11X-ray與Micro-CT檢測ZJYXD促進骨愈合的能力:造模小鼠術(shù)后3 d將慢病毒感染后的BMSCs細(xì)胞收集制成1×106個/mL細(xì)胞懸液,將小鼠按照1.2.4分組于皮膚標(biāo)記骨折處注射細(xì)胞,術(shù)后5 d開始進行灌胃。小鼠分為四組:NC組(陰性對照組),NC+ZJYXD組(對照組+6 % ZJYXD含藥血清組),ANRIL組(LncRNA ANRIL過表達組),ANRIL+ZJYXD組(LncRNA ANRIL過表達組+6 % ZJYXD含藥血清組),每組6只,其中NC+ZJYXD組與ANRIL+ZJYXD組參照小鼠與人等劑量換算公式,ZJYXD劑量為11.68 g/kg灌胃,其余兩組給予等量生理鹽水灌胃,2周后麻醉進行脫臼處死,取股骨進行X-ray與Micro-CT檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的ZJYXD對BMSCs細(xì)胞活力的影響

CCK-8結(jié)果見圖1,ZJYXD含藥血清能明顯促進BMSCs的增殖活性,與0 %含藥血清濃度相比,6 % ZJYXD含藥血清對BMSCs細(xì)胞增殖能力最強,故選用6 % ZJYXD含藥血清濃度進行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度ZJYXD含藥血清對BMSCs細(xì)胞增殖活性

2.2 BMSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染LncRNA ANRIL慢病毒及ZJYXD對ANRIL的影響

熒光顯微鏡下觀察熒光明顯,細(xì)胞存活較多。與NC組比較,NC+ZJYXD組ANRIL mRNA表達降低(P<0.01),ANRIL組ANRIL mRNA表達顯著提高(P<0.01);與NC+ZJYXD組對比,ANRIL+ZJYXD組ANRIL mRNA表達升高(P<0.01);ANRIL+ZJYXD組與ANRIL組相比不具有差異性(P>0.05)。見圖2。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染效率熒光對比及mRNA表達量(×200)

2.3 ZJYXD通過ANRIL調(diào)節(jié)BMSCs細(xì)胞成骨分化

染色結(jié)果見圖3。與NC組對比,NC+ZJYXD組染色更深,成骨分泌標(biāo)志物更多,細(xì)胞外礦化結(jié)節(jié)的形成與沉積較多(P<0.01);與NC組對比,ANRIL組染色淺,成骨分泌標(biāo)志物較少,礦化結(jié)節(jié)形成較少,堿性磷酸酶活性與鈣質(zhì)沉積量減少(P<0.01);與NC+ZJYXD組對比,ANRIL+ZJYXD組染色弱,堿性磷酸酶活性與鈣鹽沉積被抑制(P<0.01),表明ANRIL的表達抑制了ZJYXD促進骨形成作用。ANRIL+ZJYXD組與ANRIL組對比染色及定量分析無統(tǒng)計差異,表明ZJYXD促進成骨分泌及骨礦化結(jié)節(jié)的形成能力被ANRIL的過表達抑制(P>0.05)。

圖3 堿性磷酸酶染色、茜素紅染色及定量分析

2.4 ZJYXD通過ANRIL調(diào)節(jié)BMSCs細(xì)胞成脂分化

與NC組對比,NC+ZJYXD組脂肪顆粒較少,ANRIL組紅色脂肪細(xì)胞較多,成脂能力較強;與NC+ZJYXD組對比,ANRIL+ZJYXD組脂肪顆粒較多,成脂能力增強;ANRIL+ZJYXD組與ANRIL組對比脂肪顆粒變化不明顯。見圖4。

圖4 顯微鏡下觀察油紅O染色脂滴形成情況(×100)

2.5 ZJYXD通過ANRIL調(diào)節(jié)BMSCs細(xì)胞成骨成脂相關(guān)基因及蛋白的表達

與NC組對比,NC+ZJYXD組OPN、RUNX2的mRNA及蛋白表達顯著升高,C/EBPα、PPARγ的mRNA及蛋白表達顯著降低(P<0.01);ANRIL組OPN、RUNX2的mRNA及蛋白表達降低,C/EBPα、PPARγ的mRNA及蛋白表達升高(P<0.01);與NC+ZJYXD組對比,ANRIL+ZJYXD組OPN、RUNX2的mRNA及蛋白表達明顯降低,C/EBPα、PPARγ的mRNA及蛋白表達明顯升高(P<0.01);與ANRIL組對比,ANRIL+ZJYXD組成骨成脂相關(guān)基因及蛋白表達不具有差異性(P>0.05)。見圖5。

圖5 成骨成脂相關(guān)基因及蛋白的表達

2.6 ZJYXD通過ANRIL介導(dǎo)的MAPK/P38-ERK信號通路促進BMSCs成骨分化

與NC組對比,NC+ZJYXD組P-ERK、P38蛋白的表達增加(P<0.01),ANRIL組P-ERK、P38蛋白表達降低(P<0.01);與NC+ZJYXD組對比,ANRIL+ZJYXD組P-ERK、P38蛋白表達明顯降低(P<0.01);ANRIL+ZJYXD組與ANRIL組對比P-ERK、P38蛋白表達無差異性(P>0.05)。見圖6。

圖6 P38、ERK、P-ERK蛋白的表達

2.7 ZJYXD通過ANRIL促進骨折愈合,增加骨量

X-ray可見,與NC組對比,NC+ZJYXD組骨折后愈合能力增強,骨痂較厚,ANRIL組愈合能力較弱;與NC+ZJYXD組對比,ANRIL+ZJYXD組愈合能力減弱,骨痂形成量較少,表明ANRIL的表達抑制了ZJYXD的促進骨形成作用。Micro-CT也顯示出同樣的結(jié)果,進一步數(shù)據(jù)測算則準(zhǔn)確的反應(yīng)了骨折斷端的骨痂體積(TV)與骨量體積(BV)。這些數(shù)據(jù)表明ZJYXD促進骨折后愈合的能力被ANRIL的過表達抑制。見圖7。

圖7 X-ray、Micro-CT觀察骨折愈合程度并分析BV與TV

3 討論

隨著現(xiàn)代社會的高速發(fā)展以及人口老齡化程度的不斷加重,骨代謝疾病的發(fā)病率逐年增加[16]。中醫(yī)學(xué)治療骨科疾病具有獨特的理論及方法,壯筋養(yǎng)血湯源自清·錢秀昌《傷科補要》,主要功效為養(yǎng)血活絡(luò),強筋壯腰,其藥物組成為當(dāng)歸、白芍、川續(xù)斷、杜仲、生地黃、川芎、紅花、牡丹皮、牛膝。實驗研究表明壯筋養(yǎng)血湯可降低NO、IL-1及iNOS的含量,從而減輕關(guān)節(jié)軟骨損傷[17]。此外,臨床研究顯示壯筋養(yǎng)血湯對腰椎間盤突出癥、骨關(guān)節(jié)炎、腰背痛、跟骨關(guān)節(jié)骨折亦有較好的療效[17-19]。本研究通過實驗證實6 %壯筋養(yǎng)血湯含藥血清可以顯著促進BMSCs細(xì)胞的增殖。

LncRNA相關(guān)中藥作用機制是當(dāng)下中醫(yī)藥研究的熱點之一,多種中藥可通過LncRNA發(fā)揮疾病治療作用[20]。LncRNA ANRIL是眾多LncRNA中的一員,位于激酶4抑制因子(INK4)位點,作為一種反義非編碼RNA[21],它與眾多疾病均有一定的相關(guān)性。已有研究證明LncRNA ANRIL沉默可促進牙周韌帶成骨細(xì)胞的分化,促進人BMSCs細(xì)胞的增殖,抑制其凋亡[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)壯筋養(yǎng)血湯可以顯著促進鈣鹽沉積與成骨分泌物的形成,同時促進成骨相關(guān)因子基因及蛋白的表達,進一步研究發(fā)現(xiàn)壯筋養(yǎng)血湯可以降低ANRIL mRNA表達,過表達ANRIL則導(dǎo)致壯筋養(yǎng)血湯成骨及礦化結(jié)節(jié)形成能力減弱,抑制成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因及蛋白的表達,這些研究結(jié)果表明壯筋養(yǎng)血湯可能通過LncRNA ANRIL發(fā)揮成骨作用。

骨代謝疾病的發(fā)生不僅與成骨細(xì)胞減少相關(guān),還與骨髓中脂肪細(xì)胞增加有關(guān)[24]。因此增加成骨細(xì)胞形成,抑制脂肪細(xì)胞生成,對于防治骨質(zhì)疏松癥等一系列骨代謝性疾病具有重要的意義[25]。本研究發(fā)現(xiàn)壯筋養(yǎng)血湯可抑制成脂細(xì)胞中的脂滴形成,并且降低成脂相關(guān)因子基因及蛋白的表達量,過表達ANRIL后壯筋養(yǎng)血湯抑制成脂細(xì)胞能力減弱,這些結(jié)果表明壯筋養(yǎng)血湯通過抑制ANRIL能夠促進成骨細(xì)胞形成,同時抑制成脂細(xì)胞的增殖。體內(nèi)實驗也驗證了以上結(jié)論,X-ray與Micro-CT均顯示壯筋養(yǎng)血湯可提高骨折后愈合程度,過表達ANRIL則會導(dǎo)致愈合緩慢。由此可見壯筋養(yǎng)血湯對BMSCs成骨和成脂具有雙向影響,促進BMSCs成骨分化的同時又在抑制成脂分化,且這種影響是通過調(diào)控ANRIL實現(xiàn)。

MAPK信號通路在骨代謝疾病進程中具有促進成骨細(xì)胞增殖分化的作用[26]。MAPK信號通路主要由p38 MAPK、ERK1/2、ERK5等組成[27]。研究表明LncRNA ANRIL通過MAPK信號通路調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11-12], ANRIL通過調(diào)節(jié)RAS/RAF/ERK信號通路促進動脈粥樣硬化進展,同時有研究證實激活MAPK通路會誘導(dǎo)成骨的生成,加入抑制劑后會增加脂肪細(xì)胞的生成[28-29]。據(jù)此,筆者推測壯筋養(yǎng)血湯可能通過LncRNA ANRIL介導(dǎo)的MAPK/ ERK信號通路發(fā)揮作用。通過本研究發(fā)現(xiàn),壯筋養(yǎng)血湯可以顯著增強P38、P-ERK的表達,過表達ANRIL則抑制其表達。以上實驗結(jié)果證實壯筋養(yǎng)血湯通過LncRNA ANRIL介導(dǎo)的MAPK/P38-ERK通路調(diào)控BMSCs成骨成脂分化。

綜上所述,本研究通過體外、體內(nèi)實驗證實了壯筋養(yǎng)血湯具有促進成骨的生成、抑制成脂分化的作用,而這種作用是通過LncRNA ANRIL調(diào)控MAPK/P38-ERK信號通路實現(xiàn)的。本次研究為壯筋養(yǎng)血湯治療骨代謝疾病提供了重要的實驗依據(jù),拓寬了臨床治療骨代謝疾病的思路。