電針聯(lián)合延胡索水提物對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠的改善作用

溫志剛 路帥 馬欣

1. 河北省中醫(yī)院骨傷二科,河北 石家莊 050000

2.石家莊市中醫(yī)院,河北 石家莊 050000

3.河北省第八人民醫(yī)院,河北 石家莊 050000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是一種被認(rèn)為與卵巢激素缺乏相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥,是迄今為止與年齡相關(guān)的骨質(zhì)流失的最常見(jiàn)原因。目前西醫(yī)主要以雌激素替代療法為主,但存在不良反應(yīng)多、致癌風(fēng)險(xiǎn)高等缺點(diǎn)。電針作為一種特定的中醫(yī)療法,是在普通針灸的基礎(chǔ)上使用現(xiàn)代技術(shù)來(lái)模擬醫(yī)者完成相應(yīng)的運(yùn)針并給予患者長(zhǎng)時(shí)間規(guī)律的電刺激,具有操作方便、無(wú)副作用等優(yōu)點(diǎn),在臨床上得到廣泛應(yīng)用[1]。電針在骨質(zhì)疏松癥中的治療效果已被大量臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究所證實(shí)。將針灸療法與藥物治療結(jié)合起來(lái)已成為目前臨床上治療骨質(zhì)疏松癥的研究熱點(diǎn)。延胡索是罌粟科細(xì)紫堇屬植物的干燥塊莖,也被稱(chēng)為“元胡”。作為傳統(tǒng)中藥,延胡索有行氣活血、化瘀通絡(luò)的功效。包含延胡索的中藥制劑已被用于治療腰椎間盤(pán)突出、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和頸椎病[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[3]發(fā)現(xiàn),延胡索的主要化學(xué)成分是生物堿,具有抗炎、抗腫瘤、抗凋亡和鎮(zhèn)痛等多種生物學(xué)作用。Ling等[4]發(fā)現(xiàn),延胡索提取物通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)減少心肌缺血再灌注大鼠的心臟功能。Wang等[5]發(fā)現(xiàn),延胡索提取物巴馬汀通過(guò)抑制炎癥小體的活化和半胱天冬酶-1的形成來(lái)減輕痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)。然而,延胡索水提物在骨質(zhì)疏松癥中的作用及相關(guān)機(jī)制尚未明確。本研究探討了電針聯(lián)合延胡索水提物對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠的保護(hù)作用,并初步探究其可能的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:48只成年雌性SD大鼠購(gòu)自購(gòu)自華蘭生物工程股份有限公司[許可證號(hào)SYXK(豫)2018-0014],體重300～330 g,8～10周齡。將大鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下,自由獲取食物和水,室溫為22 ℃,濕度約為45 % ～ 55 %。所有實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并按照國(guó)家有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。動(dòng)物倫理審查號(hào)為(院科倫審:AEWC -2001281)。

1.1.2藥物及試劑:延胡索中藥飲片購(gòu)自張仲景大藥房,經(jīng)河南食品藥品檢驗(yàn)所檢驗(yàn)為真品。IP細(xì)胞裂解液(貨號(hào)P0013)、蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)P0010)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;抗GSK-3β抗體(貨號(hào)ab93926)、抗DVL抗體(貨號(hào)ab233003)、抗Runx2抗體(貨號(hào)ab236639)、抗Wnt3a抗體(貨號(hào)ab219412)、抗β-catenin抗體(貨號(hào)ab68183)、抗GAPDH抗體(貨號(hào)ab9485)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。骨保護(hù)素(Osteoprotegerin,OPG;貨號(hào)MOP00)和核因子-κB配體的受體激活劑(Receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL;貨號(hào)462-TR)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司;酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(DNM9606)購(gòu)自北京普朗新技術(shù)有限公司。SDZ-III型華佗牌電子針療儀購(gòu)自蘇州醫(yī)療用品廠有限公司;MEDIX90雙能X線骨密度檢測(cè)儀購(gòu)自法國(guó)奧斯托公司。

1.2 方法

1.2.1延胡索有效成分的提取及處理:延胡索提取物采用水提方式制備,方法如下:取延胡索中藥飲片500 g,加入1 800 mL水,大火燒開(kāi)后浸泡1 h,再次大火燒開(kāi)后,文火煮1 h。靜置冷卻至室溫后,經(jīng)100目濾布過(guò)濾收集水提液。經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分析發(fā)現(xiàn),延胡索水提取物的主要成分詳見(jiàn)圖1。

圖1 延胡索水提物的HPLC圖

1.2.2骨質(zhì)疏松癥模型及分組:采用雙側(cè)卵巢切除法[6]制備骨質(zhì)疏松癥大鼠模型,共40只。簡(jiǎn)而言之,用2 %戊巴比妥鈉麻醉大鼠,然后切除兩個(gè)卵巢。同時(shí),Sham組(假手術(shù)組,8只)的大鼠只切除了卵巢附近的脂肪組織。手術(shù)后,以青霉素5萬(wàn) U/d的劑量進(jìn)行肌肉注射,每次持續(xù)3 d。手術(shù)一周后,將卵巢切除大鼠隨機(jī)分為五組(每組8只):模型組、雌二醇組、電針組、延胡索組和針?biāo)幗M。

1.2.3干預(yù)方法:按照人鼠等效劑量,雌二醇組給予戊酸雌二醇50 μg/(kg·d)灌胃,每天一次。電針組根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]取穴,將毫針刺入腎俞穴、三陰交穴、關(guān)元穴和足三里穴后,連接電針儀,連續(xù)波、設(shè)置刺激強(qiáng)度2 mA,2 Hz/100 Hz,每次15 min,每天一次。延胡索組給予延胡索水提物灌胃治療,根據(jù)參考文獻(xiàn)[8],選擇劑量為0.5 g/kg。針?biāo)幗M先通過(guò)灌胃延胡索水提物0.5 g/kg,間隔15 min后進(jìn)行電針治療,處理方法同上。Sham組和模型組每日給予等體積生理鹽水。連續(xù)治療12周。

1.3 標(biāo)本采集

治療結(jié)束后,將大鼠經(jīng)腹腔注射3 %戊巴比妥鈉(每100 g體質(zhì)量0.1 mL)麻醉后,腹主動(dòng)脈取血,3 000 r/min離心10 min后將血清置于- 20 ℃保存。大鼠放血致死后,剝離大鼠右側(cè)股骨遠(yuǎn)端干骺端、右側(cè)股骨組織以及股骨遠(yuǎn)端部分骨組織,一部分置于10 % EDTA溶液(pH 7.4)中在4 ℃下固定3周,用于觀察骨組織形態(tài);另一部分置于- 80 ℃保存,用于蛋白免疫印跡分析。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1骨密度測(cè)定:使用骨密度儀掃描剝離的大鼠右側(cè)股骨遠(yuǎn)端干骺端,記錄各組大鼠的骨密度(bone mineral density, BMD)值。

1.4.2骨組織形態(tài)及骨小梁微結(jié)構(gòu)測(cè)定:將經(jīng)DETA溶液固定的股骨組織脫鈣后,用石蠟包埋,并在冠狀面切割成3 μm厚的切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水合、行常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色后,于顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化,并進(jìn)行定性分析。通過(guò)微型CT測(cè)量脛骨遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu),測(cè)量的參數(shù)包括骨小梁的平均厚度(Tb.Th)、骨小梁面積百分比(Tb.Ar,%)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)和骨小梁分離度(Tb.Sp)。具體操作根據(jù)CT操作手冊(cè)進(jìn)行。

1.4.3酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA):根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中骨特異性堿性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase,BALP)、核結(jié)合因子-α1(core-binding factor subunit- α1,CBF-α1)、I型前膠原氨基端前肽(precollagen type I amino-terminal prepropeptide,PINP)、骨鈣素(osteocalcin,OC)、骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)和核因子-κB配體的受體激活劑(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)的含量。

1.4.4蛋白免疫印跡分析:將骨組織用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解。將裂解物以12 000g離心15 min。收集上清液,使用雙辛可寧酸定量測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)與負(fù)載緩沖液混合,并在100 ℃下孵育6 min。將等量的蛋白質(zhì)(50 μg)進(jìn)行10 %十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后轉(zhuǎn)移至孔徑為0.45 μm的聚偏氟乙烯膜上。將膜與抗Runx2、抗Wnt3a、抗β-catenin、抗GAPDH抗體于4 ℃下孵育過(guò)夜。洗滌后,將膜與二級(jí)抗體辣根過(guò)氧化物酶綴合的抗小鼠(或兔)IgG在室溫下孵育1 h。ECL試劑顯影后,使用Image Lab軟件對(duì)免疫反應(yīng)帶的像素強(qiáng)度進(jìn)行量化。以GAPDH作為內(nèi)部參照。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 體重和骨密度的比較

治療前,各組之間大鼠的體重和骨密度值均無(wú)明顯差異(P>0.05)。治療后,與Sham組相比,模型組大鼠的骨密度值明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療后,與模型組相比,雌二醇、電針、延胡索、針?biāo)幗M大鼠的骨密度值明顯升高,且針?biāo)幗M大鼠的骨密度值顯著高于電針組和延胡索組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠治療前后體重和骨密度的比較

2.2 骨組織形態(tài)及骨小梁微結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較

如HE染色所示(圖2),Sham組顯示出完整的骨小梁結(jié)構(gòu),且骨小梁排列有序、直徑正常、罕見(jiàn)空骨陷窩。與Sham組相比,模型組骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂、骨小梁變薄,且空骨陷安窩增加,并觀察到輕微骨折。與模型組相比,雌二醇、電針、延胡索、針?biāo)幗M的骨組織形態(tài)損傷明顯減輕。進(jìn)一步比較骨小梁微結(jié)構(gòu)參數(shù)發(fā)現(xiàn)(表2),與Sham組相比,模型組大鼠的Tb.Th、Tb.Ar和Tb.N均明顯降低,而Tb.Sp明顯增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)12周后,與模型組相比,雌二醇、電針、延胡索、針?biāo)幗M大鼠的Tb.Th、Tb.Ar和Tb.N均明顯增加,而Tb.Sp明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外,針?biāo)幗M的干預(yù)效果明顯優(yōu)于電針組和延胡索組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠治療后骨小梁微結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較

圖2 各組大鼠股骨組織HE染色(×400)

2.3 骨代謝標(biāo)志物的比較

與Sham組相比,模型組大鼠骨代謝標(biāo)志物BALP、CBF-α-1、PINP和OC含量均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)12周后,與模型組相比,雌二醇、電針、延胡索、針?biāo)幗M大鼠的BALP、CBF-α-1、PINP和OC水平均明顯升高,且針?biāo)幗M大鼠骨代謝標(biāo)志物水平顯著高于電針組和延胡索組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠治療后骨代謝標(biāo)志物含量的比較

2.4 各組大鼠血清OPG和RANKL水平的比較

與Sham組相比,模型組大鼠血清OPG水平明顯降低,而RANKL水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療后,與模型組相比,雌二醇、電針、延胡索、針?biāo)幗M大鼠血清OPG水平明顯升高,而RANKL水平明顯降低(P<0.05)。針?biāo)幗M血清OPG水平明顯高于、RANKL水平明顯低于電針組和延胡索組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血清OPG和RANKL水平的比較

2.5 各組大鼠股骨遠(yuǎn)端骨組織中Runx2、Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)的比較

與Sham組相比,模型組大鼠骨組織中Runx2、Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)明顯降低,而GSK-3β和DVL1蛋白表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比,雌二醇、電針、延胡索、針?biāo)幗M大鼠骨組織中Runx2、Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)明顯升高,而GSK-3β和DVL1蛋白表達(dá)顯著降低,且針?biāo)幗MRunx2、Wnt3a和β-catenin蛋白的表達(dá)顯著高于電針組和延胡索組,而GSK-3β和DVL1蛋白表達(dá)顯著低于電針組和延胡索組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表5。

表5 各組大鼠股骨遠(yuǎn)端骨組織中Runx2、Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)的比較

圖3 蛋白免疫印跡檢測(cè)股骨遠(yuǎn)端骨組織中GSK-3β、DVL1、Runx2、Wnt3a和β-catenin蛋白的表達(dá)

3 討論

針灸和中藥作為中醫(yī)學(xué)的兩大療法,被廣泛用于疾病的治療。電針作為一種改良的針灸方法,其原理是調(diào)節(jié)陰陽(yáng)、消除氣滯和氣血瘀的通道和側(cè)支?；谥嗅t(yī)學(xué)原理,腎俞穴、三陰交穴、關(guān)元穴和足三里穴是預(yù)防和治療絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥最常用的傳統(tǒng)穴位[9]。動(dòng)物研究[10]表明,電針預(yù)處理可防止卵巢切除術(shù)導(dǎo)致的骨丟失和骨結(jié)構(gòu)惡化,并促進(jìn)骨愈合和骨痂形成。此外,電針刺激不僅可以增加骨密度,還可以防止卵巢切除引起的骨質(zhì)流失[11]。延胡索作為傳統(tǒng)中藥之一,其水提物中含多種化學(xué)成分,其中延胡索乙素、脫氫紫堇堿、鹽酸小檗堿等都被證實(shí)是鈣離子拮抗劑[12]。研究[13]已證實(shí),口服延胡索提取物能夠降低大鼠耳朵腫脹,提示其具有良好的抗炎作用。此外,延胡索提取物在多種腫瘤細(xì)胞中的抗癌細(xì)胞增殖作用也被證實(shí)[14]。然而,延胡索提取物在骨質(zhì)疏松癥中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn),電針刺激和延胡索水提物治療均能夠減輕骨組織形態(tài)損傷和骨小梁結(jié)構(gòu)損傷,提示電針和延胡索水提物治療能夠改善骨質(zhì)疏松癥中發(fā)生的病理變化。PINP、CBF-α1和OC的水平降低會(huì)影響骨代謝過(guò)程中的骨形成[7]。本研究發(fā)現(xiàn)電針和延胡索水提物治療均能夠增加骨質(zhì)疏松癥大鼠血清ALP和BGP水平、增加骨密度,提示電針和延胡索水提物能夠改善骨代謝。

目前研究認(rèn)為,針?biāo)幉⒂媚軌蛟诒ＷC治療效果的基礎(chǔ)上減輕針灸的刺激量、降低藥物的毒副作用[15]。本研究中電針與延胡索水提物聯(lián)用能夠發(fā)揮出比單獨(dú)治療更好的抗骨質(zhì)疏松癥效果。既往研究[16]指出,電針能夠提高中藥作用的敏感性和靶向性。一項(xiàng)薈萃分析[17]顯示,電針與中藥或西藥結(jié)合可以改善單一干預(yù)方式的不足之處,提高整體療效?；诩韧芯客茰y(cè),電針刺激“腎俞穴”“三陰交穴”“關(guān)元穴”和“足三里穴”可治本扶正、益腎調(diào)經(jīng),防止卵巢切除術(shù)導(dǎo)致的骨丟失和骨結(jié)構(gòu)惡化;延胡索提取物可減輕促使骨質(zhì)疏松發(fā)生的病理因素;二者結(jié)合在治療骨質(zhì)疏松癥時(shí)可起到協(xié)同增效作用。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的致病機(jī)制十分復(fù)雜,與多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。OPG/RANKL系統(tǒng)是骨生物學(xué)史上最重要的發(fā)現(xiàn)之一,被證明參與了骨代謝的調(diào)節(jié)[18]。RANKL作為腫瘤壞死因子配體家族的膜結(jié)合分子,參與促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成并抑制成骨細(xì)胞的增殖和分化,為破骨細(xì)胞祖細(xì)胞提供重要信號(hào)[19]。RANKL與其受體結(jié)合,誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生存和成熟破骨細(xì)胞活化。OPG是RANKL的誘餌受體,由成骨細(xì)胞合成和分泌。其通過(guò)阻斷RANKL與其受體之間的相互作用,抑制破骨細(xì)胞的形成和成熟破骨細(xì)胞的活化。本研究發(fā)現(xiàn),電針和延胡索水提物治療導(dǎo)致OPG表達(dá)上調(diào)、RANKL表達(dá)上調(diào)。基于既往研究推測(cè)電針和延胡索水提物可能通過(guò)激活成骨細(xì)胞的形成并抑制破骨細(xì)胞的形成,從而改善卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨生長(zhǎng)和骨重塑的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。Wnt信號(hào)缺失時(shí),GSK-3β、酪蛋白激酶1(CK1)和軸蛋白(Axin)會(huì)構(gòu)成降解復(fù)合物,介導(dǎo)β-catenin的泛素化和降解。在異常持續(xù)激活時(shí),Wnt配體與細(xì)胞表面卷曲蛋白和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白組成的受體復(fù)合物相互作用,經(jīng)DVL傳遞信號(hào)后,導(dǎo)致降解復(fù)合物的失活,進(jìn)而抑制β-catenin的降解。β-catenin是Wnt信號(hào)通路經(jīng)典途徑的核心蛋白分子。β-catenin在細(xì)胞核中積累,并與淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子-1/轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,以上調(diào)Wnt靶基因的表達(dá),如Runx2,進(jìn)而引發(fā)多種效應(yīng),包括成骨細(xì)胞的增殖和分化。靶向Wnt/β-catenin信號(hào)途徑已成為骨質(zhì)疏松靶向治療的研究熱點(diǎn)之一。范懷玲等[21]發(fā)現(xiàn),電針刺激能夠激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)改善骨質(zhì)疏松。與既往研究一致,本研究也發(fā)現(xiàn)電針治療能夠上調(diào)Runx2、Wnt2a和β-catenin的表達(dá),并下調(diào)GSK-3β和DVL1的蛋白表達(dá),提示其對(duì)Wnt信號(hào)途徑的激活。此外,延胡索水提物治療也能夠激活Wnt信號(hào)途徑,且電針與延胡索水提物聯(lián)合治療對(duì)Wnt信號(hào)途徑的激活效應(yīng)比單一處理更明顯?；谶@些研究,推測(cè)電針和延胡索水提物聯(lián)合能夠協(xié)同增效,至少部分是激活Wnt/β-catenin通路來(lái)抑制卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),電針刺激與延胡索水提物聯(lián)合治療能夠減少骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨量損失、增加骨密度、改善骨組織的微觀結(jié)構(gòu)和骨代謝,從而減輕卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥,其可能是通過(guò)調(diào)控OPG/RANKL和Wnt/β-catenin途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外,電針刺激與延胡索水提物結(jié)合能夠起到協(xié)同增效作用,這一新發(fā)現(xiàn)可能為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新思路。然而,考慮到臨床應(yīng)用中患者需接受長(zhǎng)時(shí)間電針刺激,可能存在依從性較差的缺點(diǎn),因此仍需結(jié)合臨床病例進(jìn)行深入研究。