絕經(jīng)后股四頭肌肌肉萎縮膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型的建立及鑒定

陳澤華 申震 陳國茜 許學(xué)猛,4* 劉文剛,4*

1. 株洲市中醫(yī)傷科醫(yī)院,湖南 株洲 412000

2. 昆明市中醫(yī)院/云南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,云南 昆明 650011

3. 浙江省中醫(yī)院骨傷科,浙江 杭州 310000

4. 廣東省第二中醫(yī)院,廣東 廣州 510405

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是一種慢性退行性骨關(guān)節(jié)病,正嚴(yán)重威脅著中老年人的健康[1]。近年來發(fā)現(xiàn),KOA的病理變化累及全關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍組織,除軟骨退變、軟骨下骨硬化、囊性變、骨贅形成等骨質(zhì)結(jié)構(gòu)改變外,還伴有膝關(guān)節(jié)周圍肌肉組織的異常改變[2]。研究發(fā)現(xiàn)KOA患者下肢肌肉萎縮主要以股四頭肌為主,股四頭肌肌肉萎縮會降低膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性,會加劇關(guān)節(jié)軟骨磨損,導(dǎo)致KOA形成[3-4]。目前,KOA的動物模型很多,包括Hulth造模法、膝關(guān)節(jié)制動,關(guān)節(jié)內(nèi)注射碘乙酸、木瓜蛋白酶,卵巢切除去勢等造模方法[5]。其中絕大部分造模方法僅關(guān)注膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)炎表現(xiàn),即軟骨破壞和關(guān)節(jié)炎癥,卻忽視了股四頭肌肌肉萎縮在KOA發(fā)病過程中的作用。盡管采用肉毒素肌注引起股四頭肌肌肉萎縮進而誘導(dǎo)KOA的動物模型在兔及大鼠中已被證實,但是既往肉毒素股四頭肌肌肉注射的KOA模型存在一些不足,如需多次進行肉毒素注射,單次注射隨著股四頭肌肌肉修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨退變減輕,這并不符合KOA的病理過程[6-13]。由于女性絕經(jīng)后雌激素水平下降可影響肌肉代謝,導(dǎo)致老齡性肌肉流失,故女性的KOA發(fā)病率高于男性,且女性中老年KOA患者伴有明顯的股四頭肌肌肉萎縮[14]。因此,本研究在肉毒素誘導(dǎo)股四頭肌肌肉萎縮的基礎(chǔ)上,結(jié)合卵巢切除去勢進行疊加造模,以建立一種更符合絕經(jīng)后KOA真實病理變化的大鼠模型,并比較不同模型之間的差異,為研究股四頭肌肌肉萎縮與KOA之間的關(guān)系、探尋KOA的防治方法提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:3月齡SPF級雌性SD大鼠,共40只,體重(250 ± 15)g,購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心[SCXK(粵)2020-0059],于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院藥理毒理實驗室進行喂養(yǎng),動物許可證編號為[SYXK(粵)2018-0002]。飼養(yǎng)條件:恒溫25 ℃,相對濕度為40 % ～ 50 %,晝夜各12 h,自由飲水及攝食,每籠5只、分籠喂養(yǎng)。本實驗研究經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會審查通過(048785)。

1.1.2主要試劑和儀器:注射用A型肉毒素(BOTOX-A,保妥適,100 U/支,注冊證號:S20171005,愛爾蘭);戊巴比妥鈉(北京嵐泰化工科技公司,中國);番紅固綠染色液(賽維爾,產(chǎn)品編號:G1053-100 ML,中國);伊紅-蘇木素(HE)試劑(碧云天,產(chǎn)品編號:C0105 S,中國);BX51熒光顯微鏡(Olympus,日本);大小鼠抓力測定儀(型號:YLS-13A,上海欣軟科技,中國)。

1.2 方法

1.2.1實驗分組:隨機將40只雌性SD大鼠分為卵巢切除組(OVX組)、卵巢切除+肉毒素組(OVX+BTX組)、肉毒素組(BTX組)和空白組(Control組),每組各10只。每組中的5只于造模后4周取材,另5只于造模后9周取材,對9周取材的各組大鼠定期稱重。

1.2.2建立卵巢切除動物模型:采用2 %的戊巴比妥鈉、按30 mg/kg劑量對除Control組外的三組大鼠進行腹腔注射麻醉。麻醉成功后,大鼠取俯臥位,消毒鋪巾,在腰椎兩側(cè)各切開約1 cm,分離皮下組織及脂肪,小心牽拉出卵巢,絲線結(jié)扎后剪除卵巢。將輸卵管回納后,清洗傷口后予以縫合。術(shù)后予以左側(cè)臀肌注射青霉素5萬U預(yù)防感染,連續(xù)3 d。

1.2.3建立肉毒素股四頭肌肌肉注射模型:BTX組大鼠肉毒素注射在麻醉后進行,OVX+BTX組則在卵巢切除術(shù)后進行肉毒素注射。注射方法:先將肉毒素用生理鹽水配制成10 U/mL,在助手幫助下,沿右側(cè)股直肌、股內(nèi)側(cè)肌及股外側(cè)肌中點位置,按10 U/kg劑量平均于以上3個位置進行肌肉注射。僅單次注射,造模后大鼠如步態(tài)發(fā)生變化即造模成功。

1.2.4Lequesne MG評分:對9周取材的大鼠,在第4周和第9周時進行Lequesne MG評分[15],總分為0～11分,評分越高說明其KOA越嚴(yán)重。

1.2.5大鼠抓力測定:對9周取材的20只大鼠分別于第4周和第9周測定其四肢抓力及雙后肢抓力。測定方法:將大鼠放置于抓力板上,向后輕拉大鼠尾巴,大鼠四肢抓緊抓力板時,均勻用力后拉至脫爪,測試儀自動記錄下最大抓力。測量大鼠雙后肢抓力時,懸吊大鼠上半身,使其身體與抓力板保持約30 °角,向后牽拉至脫爪測出雙后肢的抓力。測量3次,取平均值。

1.2.6標(biāo)本收集:造模后4周,每組取材5只,剩下的于造模后9周取材。先將大鼠麻醉后脫頸處死。在股四頭肌遠端于髕上緣止點處切斷,沿肌間隙完整分離股四頭肌。小心分離并切下右側(cè)滑膜,最后將右側(cè)膝關(guān)節(jié)完整取下。

1.2.7固定、切片及染色:將取下的肌肉、滑膜和膝關(guān)節(jié)置于含4 %多聚甲醛溶液中固定72 h,肌肉和滑膜組織可進行包埋切片,膝關(guān)節(jié)標(biāo)本則先用EDTA脫鈣5周后再進行包埋及切片。對肌肉及滑膜組織切片進行HE染色,膝關(guān)節(jié)切片則采用HE和番紅-固綠染色。

1.2.8軟骨Mankin評分及滑膜炎癥評分:根據(jù)關(guān)節(jié)軟骨切片的HE染色和番紅-固綠染色進行Mankin評分[16](總分為0～14分),分?jǐn)?shù)越高表示軟骨破壞越嚴(yán)重。滑膜評分采用9分制[17],總分為0 ～ 9分,分值越高代表滑膜炎癥越嚴(yán)重。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重比較

各組大鼠造模前體重?zé)o明顯差異,造模4周后 OVX組體重[(359.00 ± 5.79)g]明顯大于OVX+BTX組[(342.00 ± 11.83)g]和Control 組[(331.80 ± 22.99)]g,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001、0.024,均< 0.05);而OVX+BTX組體重明顯大于BTX組[(313.80 ± 22.15)]g,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.020 <0.05)。造模9周后,OVX組大鼠體重[(463.20 ± 15.77)g]明顯大于OVX+BTX組[(424.80 ± 16.96)g]、BTX組[(360.40 ± 14.22)g]和Control組[(373.00 ± 23.19)g],且有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004、<0.001、<0.001,均<0.01),且OVX+BTX組體重明顯大于BTX組和Control組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001、<0.001,均<0.05)。

2.2 各組大鼠Lequesne MG評分比較

造模4周后,OVX+BTX組和BTX組大鼠的Lequesne MG評分[分別為(6.20 ± 0.45)、(5.20 ± 0.45)]明顯高于OVX組(1.00 ± 1.22)和Control組(0.20 ± 0.45),且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。造模9周后,OVX組、OVX+BTX組和BTX組大鼠的Lequesne MG評分較前均有不同程度的升高。比較發(fā)現(xiàn),OVX+BTX組和BTX組大鼠Lequesne MG評分[分別為(9.00 ± 1.22)、(7.20 ± 0.84)]明顯高于OVX組(4.40 ± 0.89)和Control組(0.20 ± 0.45),且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01);且OVX+BTX組大鼠Lequesne MG評分高于BTX組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。同時,OVX組大鼠的Lequesne MG評分明顯高于Control 組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 大鼠抓力情況比較

造模4周后,OVX+BTX組和BTX組大鼠的四肢抓力[分別為(1 337.00 ± 167.41)g、(1 414.00 ± 203.22)g]明顯低于OVX組[(1 640.00 ± 117.12)g],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.007、0.035,均<0.05)。同時OVX+BTX組的四肢抓力體重比值(3.91 ± 0.50)明顯低于OVX 組(4.57 ± 0.36)和Control組(4.67 ± 0.39),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.038、0.008,均<0.05)。OVX+BTX組的雙后肢抓力[(475.80 ± 20.44)g]和抓力體重比[(1.39 ± 0.07)]均明顯低于OVX組[(741.00 ± 12.14)g、(2.06 ± 0.04)]和Control組[(968.80 ± 54.21)g、(2.63 ± 0.24)],均P< 0.01;BTX組的雙后肢抓力[(587.00 ± 21.12)g]和抓力體重比(1.88 ± 0.09)均顯著低于OVX組(P<0.001、P=0.042,均<0.05)和Control組(均<0.01),OVX組雙后肢抓力和抓力體重比均顯著低于Control組(P均<0.01);且OVX+BTX組雙后肢抓力和抓力體重比均顯著低于BTX組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。

造模9周后,OVX+BTX組四肢抓力[(1 504.00 ± 116.98)g]均顯著低于OVX組[(1 852.40 ± 12.14)g]、BTX組[(1 753.80 ± 83.71)g]和Control組[(1 756.00 ± 37.12)g],P=0.001、0.024、0.018,均<0.05;OVX組四肢抓力體重比(4.01± 0.35)均明顯低于BTX組(4.87± 0.34)和Control組(4.73 ± 0.56),P=0.004、0.013,均< 0.05,OVX+BTX組四肢抓力體重比(3.55 ± 0.33)明顯低于BTX組和Control組(均<0.01)。OVX+BTX組雙后肢抓力[(579.20 ± 65.42)g]及抓力體重比(1.36 ± 0.15)均顯著低于OVX組[(943.20 ± 36.87)g、(2.04 ± 0.05)]、BTX組[(743.20 ± 52.98)g、(2.06 ± 0.17)]和Control組[(968.80 ± 54.21)g、(2.61 ± 0.26)],均< 0.01,且BTX組雙后肢抓力及抓力體重比均顯著低于Control組(均<0.01)。BTX組雙后肢抓力明顯低于OVX組(P<0.01),而二者的雙后肢抓力體重比并無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.798)。OVX組雙后肢抓力體重比明顯低于Control組(P<0.01),而二者的雙后肢抓力卻并無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.459)。

2.4 各組股四頭肌組織形態(tài)學(xué)觀察

各組大鼠右側(cè)股四頭肌橫切截面如圖1所示,OVX+BTX組和BTX組在造模4周后,右側(cè)股四頭肌均出現(xiàn)明顯萎縮,肌肉組織內(nèi)出現(xiàn)炎性浸潤,肌纖維橫截面較Control組和OVX組明顯減小。造模后9周,OVX組、OVX+BTX組和BTX組均可見肌纖維間隙增寬,OVX+BTX組和BTX組的萎縮肌肉組織炎性吸收,但仍未完成修復(fù),部分萎縮肌纖維細胞發(fā)生脂肪變。

圖1 各組大鼠股四頭肌組織切片圖

2.5 膝關(guān)節(jié)組織切片及Mankin評分

造模后第4、9周各組關(guān)節(jié)軟骨切片染色如圖2。各組的Mankin評分情況:OVX+BTX組和BTX組的Mankin評分[分別為(5.20 ± 0.84)、(4.60 ± 1.14)]明顯大于Control組(0.60 ± 0.89),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.015、0.002,均<0.05),而與OVX組(2.80 ± 0.84)相比,差異卻無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在造模后9周,各組的Mankin評分情況:OVX組為5.00 ± 0.71,OVX+BTX組為8.20 ± 1.30,BTX組為5.20 ± 0.84,Control組為0.80 ± 0.84,比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨切片的HE和番紅固綠染色圖

2.6 膝關(guān)節(jié)滑膜組織切片觀察及炎癥評分

造模后4周,OVX組關(guān)節(jié)滑膜較無明顯炎性改變,各組的滑膜評分無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。造模后9周,模型組滑膜均出現(xiàn)明顯炎性改變,如滑膜襯里細胞增生,層數(shù)明顯增加,且滑膜組織明顯纖維樣改變,襯里下層出現(xiàn)柵欄樣變化,但均為低度滑膜炎癥。見圖3。OVX組、OVX+BTX組和BTX組的滑膜炎性評分[分別為(3.00 ± 0.71)、(2.80 ± 0.84)、(3.20 ± 0.84)]均高于Control組(0.40 ± 0.55),比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05),而各模型組之間的滑膜炎性評分無顯著差異(P均>0.05)。

圖3 各組滑膜組織切片的HE染色形態(tài)圖

3 討論

骨骼肌產(chǎn)生的肌動蛋白(細胞因子、肽和生長因子)在分子水平上與軟骨和骨相互作用,與KOA發(fā)病密切相關(guān)[18],且肌肉具有抗炎和促軟骨生成的重要作用,是影響KOA病程進展的重要因素[19]。股四頭肌是膝關(guān)節(jié)主要的伸肌,股四頭肌肌肉萎縮可直接影響膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性,引起關(guān)節(jié)軟骨退化[4],增加KOA的患病風(fēng)險。有實驗研究也驗證了肉毒素造成的股四頭肌肌萎縮可導(dǎo)致KOA形成[11],說明肌肉與骨骼相互依存。在對伴有肌肉萎縮的KOA動物模型的干預(yù)過程中,發(fā)現(xiàn)單純針對骨性變化治療的療效似乎不及對肌肉治療的療效[20]。同時大量臨床研究也表明,加強股四頭肌肉鍛煉可明顯改善KOA[21]。因此可見,改善股四頭肌肌肉萎縮可能是防治KOA的關(guān)鍵。同時也說明在KOA的治療過程中應(yīng)重視股四頭肌肌肉的修復(fù),而進一步合理研發(fā)、改良伴有股四頭肌肌肉萎縮的KOA動物模型具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn),采用肉毒素誘導(dǎo)股四肌肌肉萎縮,造模4周后膝關(guān)節(jié)軟骨即出現(xiàn)明顯破損,9周時明顯加重,均以O(shè)VX+BTX組的Mankin評分最高。研究發(fā)現(xiàn),肉毒素A可通過破壞生物的神經(jīng)系統(tǒng)而形成局部神經(jīng)性肌肉萎縮,KOA的肌肉萎縮主要包括廢用性肌萎縮和神經(jīng)源性肌萎縮,其中神經(jīng)源性I型纖維萎縮約占32 %[22-23],故肉毒素A誘導(dǎo)的KOA形成符合KOA發(fā)病過程中肌肉萎縮的病理基礎(chǔ)。而且在股四頭肌肌注肉毒素9周后,部分肌纖維出現(xiàn)成脂分化,這與KOA患者股四頭肌脂肪浸潤尤為貼合[24]。同時,肉毒素的體外實驗研究證明其對軟骨細胞無明顯毒副作用,膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射肉毒素A還能緩解KOA癥狀,這也說明KOA形成是肉毒素誘導(dǎo)股四頭肌肌肉萎縮所致,而不是肉毒素對膝關(guān)節(jié)軟骨破壞造成的[25-26]。然而,有研究發(fā)現(xiàn),對雄性大鼠進行股四頭肌肌注肉毒素造模8周后,膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評分較造模后4周減小[11],這與KOA進行性加重的發(fā)病過程是不一致的。而本研究在造模9周后未見膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評分較造模4周時減輕,這可能是由于本實驗中肉毒素注射劑量較大,同時選用的雌性大鼠活動量較雄性少,股四頭肌肌肉萎縮恢復(fù)相對緩慢,使得其關(guān)節(jié)軟骨破壞進行性加重,Mankin評分進行性升高,這更符合KOA的發(fā)病規(guī)律。

雌激素水平的下降是導(dǎo)致絕經(jīng)后女性KOA高發(fā)的重要原因,本研究采用肉毒素局部肌注誘導(dǎo)股四頭肌肌肉萎縮,結(jié)合卵巢切除進行造模,以獲得更貼近絕經(jīng)后KOA病程變化的動物模型。卵巢切除是獲得KOA大鼠模型的一種方法[27],但其造模時間長,且關(guān)節(jié)軟骨破壞較輕,因此在臨床應(yīng)用中有一定局限性。本研究發(fā)現(xiàn),在卵巢切除4周后,OVX組和OVX+BTX組的體重較Control組明顯增加,在造模9周時OVX組和OVX+BTX組的體重均顯著大于BTX組和Contorl組,這一結(jié)果與之前研究一致[28]。說明卵巢切除后由于雌激素缺失引起肥胖,這符合大多數(shù)絕經(jīng)后女性肥胖的現(xiàn)象[29]。由于OVX+BTX組和BTX組在肌注肉毒素后,股四頭肌發(fā)生失神經(jīng)性肌萎縮,而出現(xiàn)右后肢明顯跛行,且股四頭肌肌肉萎縮誘發(fā)KOA,會導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)壓痛、腫脹等情況,故在造模后4周時,OVX+BTX組和BTX組的Lequesne MG評分均明顯高于OVX組和Control組。隨著造模時間的延長,造模后第9周時,OVX+BTX組和BTX組關(guān)節(jié)軟骨破損加重,關(guān)節(jié)疼痛及腫脹隨之加重,且OVX組關(guān)節(jié)軟骨也發(fā)生破壞,故三個模型組的Lequesne MG評分均明顯高于Control組,而OVX+BTX組Lequesne MG評分最高,說明該組大鼠KOA癥狀最為嚴(yán)重。同時,由于股四頭肌肌肉萎縮導(dǎo)致大鼠抓力降低,故造模后第4周和第9周時OVX+BTX組大鼠四肢抓力較Control組明顯降低。在排除大鼠體重和雙前肢抓力對測定結(jié)果的影響后發(fā)現(xiàn),造模后4周和9周時,OVX+BTX組、OVX組和BTX組大鼠的雙后肢抓力體重比均小于Control組,且以O(shè)VX+BTX組最為顯著。

從膝關(guān)節(jié)滑膜炎癥情況來看,本研究中的三種造模方法,早期均以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹?滑膜炎癥并不顯著。隨著軟骨破損的加劇、關(guān)節(jié)炎癥的增加從而引發(fā)滑膜增生和滑膜炎癥。同時,本研究中由肉毒素肌注聯(lián)合卵巢切除建立的KOA模型,雖然很好地還原了KOA的真實病理狀態(tài),但由于疊加造模牽涉的影響因素較多,在研究KOA的發(fā)病機制及其相關(guān)干預(yù)中的應(yīng)用可能會存在一定的限制。因此,在KOA相關(guān)機制的研究中,仍然需要根據(jù)實驗要求選擇合適的KOA動物模型。

4 結(jié)論

本研究中涉及的三種造模方法均可建立KOA模型,而通過股四頭肌肌注肉毒素結(jié)合卵巢切除建立的KOA模型,則關(guān)節(jié)軟骨破壞更明顯,且更符合絕經(jīng)后KOA肌肉和骨骼的真實病理變化,有利于進一步研究KOA發(fā)病及防治過程中肌肉和骨骼之間的關(guān)系。