β-1,3-葡聚糖酶的結(jié)構(gòu)、功能及應(yīng)用研究進(jìn)展

魏夏森，余賽男，張哲一，高海燕*，秦 臻*

（上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444）

β-1,3-葡聚糖是一類(lèi)廣泛存在于自然界中的高分子多糖，其主鏈由葡萄糖單元通過(guò)β-1,3-糖苷鍵連接。一些天然β-1,3-葡聚糖同時(shí)還含有不同比例和大小的通過(guò)β-1,6-糖苷鍵連接的支鏈。例如褐藻中的昆布多糖側(cè)鏈含有30%左右的β-1,6連接支鏈結(jié)構(gòu)，并因此具有水溶性[1]。天然β-1,3-葡聚糖廣泛分布于真菌、細(xì)菌和植物中，常見(jiàn)的β-1,3-葡聚糖包括昆布多糖、可得然多糖、酵母葡聚糖、茯苓多糖、香菇多糖、胼胝質(zhì)等。由于β-1,3-糖苷鍵的連接方式及分子間的氫鍵相互作用，長(zhǎng)鏈β-1,3-葡聚糖在天然狀態(tài)下通常會(huì)呈現(xiàn)不同的螺旋型三級(jí)結(jié)構(gòu)[2]，這些特殊的三級(jí)結(jié)構(gòu)賦予β-1,3-葡聚糖多樣的生物功能，包括調(diào)節(jié)免疫力[3]、促進(jìn)腸道益生菌增殖[4]、調(diào)節(jié)血糖平衡及降低膽固醇[5]等。β-1,3-葡聚糖的生物活性及其特殊的三級(jí)結(jié)構(gòu)使其在食品、日化、醫(yī)療等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。

β-1,3-葡聚糖酶是一類(lèi)能夠水解以β-1,3-糖苷鍵連接的葡聚糖的酶系，在β-1,3-葡聚糖的生物降解、重構(gòu)以及開(kāi)發(fā)應(yīng)用中發(fā)揮著重要作用。自然界中，β-1,3-葡聚糖酶廣泛分布于古生菌、細(xì)菌、真菌、高等植物及動(dòng)物中。β-1,3-葡聚糖酶在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值，如制備低分子質(zhì)量β-1,3-葡寡糖、降低啤酒發(fā)酵液黏度、抑制果蔬采后病原真菌等。盡管目前研究者對(duì)β-1,3-葡聚糖酶的表達(dá)純化、分子結(jié)構(gòu)、酶學(xué)性質(zhì)、催化機(jī)制等做了大量研究，然而不同類(lèi)型β-1,3-葡聚糖的復(fù)雜結(jié)構(gòu)限制了β-1,3-葡聚糖酶的廣泛應(yīng)用。不同家族、不同作用模式的β-1,3-葡聚糖酶系需要協(xié)同參與復(fù)雜β-1,3-葡聚糖的高效降解。因此，充分認(rèn)識(shí)不同類(lèi)型β-1,3-葡聚糖酶的結(jié)構(gòu)、功能、催化模式，對(duì)于β-1,3-葡聚糖酶的應(yīng)用及進(jìn)一步的分子改造具有重要意義。本文總結(jié)典型β-1,3葡聚糖酶的結(jié)構(gòu)、功能及應(yīng)用領(lǐng)域的研究進(jìn)展，旨在為其后續(xù)催化機(jī)理研究及其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 β-1,3-葡聚糖酶的分類(lèi)及其催化機(jī)制

β-1,3-葡聚糖酶根據(jù)其催化方式可以分為內(nèi)切型和外切型兩種類(lèi)型。內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶（EC3.2.1.39）又被稱為昆布多糖酶，是一種專(zhuān)一性水解β-1,3-葡聚糖糖鏈中β-1,3-糖苷鍵的酶類(lèi)，在自然界β-1,3-葡聚糖的分解、重構(gòu)中發(fā)揮關(guān)鍵生物學(xué)功能，在β-1,3-葡聚糖酶系中具有重要意義。內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶從糖鏈內(nèi)側(cè)水解β-1,3-葡聚糖，產(chǎn)生一系列不同聚合度的寡糖。外切β-1,3-葡聚糖酶（EC3.2.1.58）則從糖鏈的非還原端逐一水解β-1,3-葡聚糖底物，水解產(chǎn)物一般為葡萄糖或單一寡糖，在β-1,3-葡聚糖的降解過(guò)程中起輔助作用。

基于其序列進(jìn)化關(guān)系，根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.cazy.org/）的分類(lèi)，已發(fā)現(xiàn)的β-1,3-葡聚糖酶可歸屬于12 個(gè)糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GH）家族。其中，內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶可以歸屬于9 個(gè)GH家族（圖1）：GH16、GH17、GH55、GH64、GH81、GH128、GH152、GH157和GH158；已發(fā)現(xiàn)的外切β-1,3-葡聚糖酶可以歸屬于6 個(gè)GH家族：GH3、GH5、GH17、GH55、GH128和GH132。

β-1,3-葡聚糖酶具有兩種水解機(jī)制，分別是保留型機(jī)制和反轉(zhuǎn)型機(jī)制[6]。保留型水解機(jī)制的催化過(guò)程分為兩個(gè)步驟，首先，活性中心的谷氨酸殘基作為廣義酸（質(zhì)子供體），給糖苷鍵氧提供一個(gè)質(zhì)子來(lái)切去離去基團(tuán)，使β-1,3-糖苷鍵斷裂，并形成酶-糖基中間體。隨后，活性中心的谷氨酸殘基作為廣義堿，協(xié)助水分子攻擊酶-糖基中間體的異頭碳位置。最終，底物的β-1,3-糖苷鍵被水解，形成最終的水解產(chǎn)物。異頭碳的兩次反轉(zhuǎn)導(dǎo)致底物的構(gòu)象得到保留，因此稱為保留型機(jī)制。反轉(zhuǎn)型機(jī)制的β-1,3-葡萄聚糖酶涉及兩個(gè)保守的催化殘基，分別為廣義酸及一個(gè)廣義堿。在反應(yīng)歷程中，廣義酸首先提供一個(gè)質(zhì)子給底物的異頭碳，同時(shí)廣義堿從水分子中去除一個(gè)質(zhì)子，增加了其親核性，促進(jìn)其攻擊異頭物的中心，從而使糖鍵斷裂，生成水解產(chǎn)物（圖2）。

圖2 糖苷水解酶的兩種催化機(jī)制[6]Fig.2 Two catalytic mechanisms of glycoside hydrolase[6]

2 β-1,3-葡聚糖酶的來(lái)源及制備

β-1,3-葡聚糖酶主要來(lái)源于真菌、細(xì)菌、植物、昆蟲(chóng)以及軟體動(dòng)物中。表1統(tǒng)計(jì)了目前已報(bào)道的具有應(yīng)用潛力的不同來(lái)源的典型β-1,3-葡聚糖酶。目前已報(bào)道的產(chǎn)β-1,3-葡聚糖酶的細(xì)菌主要有熱球菌（Pyrococcus furiosus）[7]、多黏類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）[8]、芽孢桿菌（Bacillus lehensisG1）[9]、鏈霉菌（Streptomycessp.）[10]等。真菌和植物也是β-1,3-葡聚糖酶的重要來(lái)源，主要包括煙曲霉（Aspergillus fumigatus）[11]、棘孢木霉（Trichoderma asperellum）[12]、白腐菌（Phanerochaete chrysosporium）[13]、大麥[14]、葡萄[15]等。天然來(lái)源的β-1,3-葡聚糖酶資源豐度、性質(zhì)穩(wěn)定，顯示出特定的催化活性，表現(xiàn)出獨(dú)特的應(yīng)用潛力，如土壤芽孢桿菌（Paenibacillus terrae）[16]產(chǎn)生的β-1,3-葡聚糖酶可有效抑制植物病原真菌的生長(zhǎng)，在植物保護(hù)等方面發(fā)揮重要的作用；來(lái)源于魁蚶（Arca inflata）[17]的β-1,3-葡聚糖酶活力較高，對(duì)腫瘤壞死因子等表現(xiàn)出免疫增強(qiáng)效果。來(lái)源于哈茨木霉（Trichoderma harzianum）[18]的β-1,3-葡聚糖酶是生產(chǎn)β-1,3-寡糖苷的理想候選酶，可用于寡糖的工業(yè)制備。

表1 具有應(yīng)用潛力的典型β-1,3-葡聚糖酶Table 1 Typical β-1,3-glucanases with potential applications

除了發(fā)掘具有優(yōu)良特性的天然來(lái)源β-1,3-葡聚糖酶，異源重組表達(dá)技術(shù)也可以用于β-1,3-葡聚糖酶的挖掘和制備，從而擴(kuò)展其來(lái)源、提高表達(dá)量、擴(kuò)大β-1,3-葡聚糖酶的應(yīng)用范圍。目前，β-1,3-葡聚糖酶的重組表達(dá)制備宿主主要包括大腸桿菌、畢赤酵母、芽孢桿菌等。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相對(duì)于酵母表達(dá)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)技術(shù)更成熟、操作相對(duì)簡(jiǎn)單，被廣泛應(yīng)用于新型β-1,3-葡聚糖酶的發(fā)掘和制備，例如拮抗酵母（Pichia guilliermondii）[19]、駝鹿瘤胃微生物宏基因組[20]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[21]等來(lái)源的β-1,3-葡聚糖酶都是通過(guò)大腸桿菌重組制備獲得。來(lái)源于稻瘟病菌的β-1,3-葡聚糖酶MoGluB可通過(guò)大腸桿菌系統(tǒng)高效表達(dá)，并表現(xiàn)出抗真菌的作用[22]。雖然大腸桿菌原核表達(dá)具有生長(zhǎng)迅速、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，但是，由于原核表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法識(shí)別真核轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，并且不具有翻譯后加工修飾功能，會(huì)導(dǎo)致部分真核基因無(wú)法被有效表達(dá)。因此，近年來(lái)研究者也常用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)β-1,3-葡聚糖酶，例如畢赤酵母、芽孢桿菌等表達(dá)體系[23]。畢赤酵母在誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中，自身所分泌的蛋白量較少，因此目的蛋白的表達(dá)量相對(duì)較高，但由于部分β-1,3-葡聚糖酶對(duì)于酵母細(xì)胞壁具有水解作用，因此，其適用性需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。異源重組表達(dá)技術(shù)目前已成為β-1,3-葡聚糖酶酶學(xué)研究及制備應(yīng)用的重要方法。同時(shí)，結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)、分子生物學(xué)、定向進(jìn)化等研究方法對(duì)異源重組表達(dá)得到的β-1,3-葡聚糖酶進(jìn)行分子改造，可進(jìn)一步提高酶的催化性能及應(yīng)用價(jià)值。Feng Jianwei等[24]從堆肥中發(fā)現(xiàn)了一種嗜熱β-1,3-葡聚糖酶，通過(guò)定點(diǎn)突變使160位氨基酸由賴氨酸變?yōu)楣劝彼?，使其酶活力提高?7%。Muhammed等[25]利用modeler和I-TASSER程序?qū)σ环N來(lái)源于酵母Wickerhamomyces normusNCYC 434的β-1,3-葡聚糖酶進(jìn)行同源建模，隨后通過(guò)SPDBViewer和AUTO-MUTE增強(qiáng)模型的熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)突變體E186R的熱穩(wěn)定性最好，其熔解溫度提高了9.58 K。

3 β-1,3-葡聚糖酶的結(jié)構(gòu)與催化機(jī)制

3.1 內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶

內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶又稱昆布多糖酶，可以特異性地從β-1,3-葡聚糖鏈內(nèi)部隨機(jī)水解切斷β-1,3-糖苷鍵，產(chǎn)生長(zhǎng)短不一的低聚糖。已有報(bào)道的內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶主要分布于GH16、GH17、GH64與GH81 4 個(gè)GH家族。到目前為止，GH16、GH17、GH64、GH81、GH128與GH158 6 個(gè)GH家族的內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制已得到解析，而GH55、GH152、GH157中鮮有關(guān)于內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶結(jié)構(gòu)的報(bào)道，其詳細(xì)的催化機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。

3.1.1 GH16家族內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶

目前已報(bào)道的GH16家族β-1,3-葡聚糖酶全部為內(nèi)切型，廣泛分布于細(xì)菌、真菌及古生菌中，以細(xì)菌來(lái)源為主。GH16家族β-1,3-葡聚糖酶三級(jí)結(jié)構(gòu)富含β-折疊，這些鏈彎曲折疊成兩個(gè)面對(duì)面反向平行的片層結(jié)構(gòu)，構(gòu)成一個(gè)供長(zhǎng)鏈底物結(jié)合的狹長(zhǎng)催化凹槽。GH16家族β-1,3-葡聚糖酶三維結(jié)構(gòu)整體呈一種果凍卷結(jié)構(gòu)，又稱三明治夾心結(jié)構(gòu)（圖3）。Fibriansah等[26]于2007年報(bào)道了一例來(lái)源于Nocardiopsissp.的GH16家族內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶（BglF）結(jié)構(gòu)，將其定義為經(jīng)典的三明治狀β-折疊果凍卷結(jié)構(gòu)。GH16家族的β-1,3-葡聚糖酶遵循典型的保留水解機(jī)制，在反應(yīng)歷程中會(huì)形成不穩(wěn)定的酶-糖基中間體[27]。GH16家族β-1,3-葡聚糖酶的底物特異性與催化凹槽構(gòu)造直接相關(guān)，對(duì)不同的底物具有不同的水解能力，例如，來(lái)源于海洋細(xì)菌Zobellia galactanivorans的β-1,3-葡聚糖酶ZgLamA對(duì)昆布多糖底物（laminarin）的催化效率要比對(duì)混合鏈葡聚糖（mixed-linkage glucan，MLG）（β-1,3-1,4-葡聚糖）高將近22 倍。這是由于ZgLamA催化中心呈現(xiàn)出彎曲凹槽的構(gòu)象，有利于結(jié)合螺旋型的β-1,3-葡聚糖而不是直線型的β-1,3-1,4-葡聚糖（圖3B）。

圖3 GH16家族典型β-1,3-葡聚糖酶結(jié)構(gòu)[26,28-34]Fig.3 Typical β-1,3-glucanase structure of GH16 family[26,28-34]

3.1.2 GH17家族內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶

GH17家族β-1,3-葡聚糖酶包括內(nèi)切型和外切型兩種，且大部分是內(nèi)切型，主要來(lái)源于植物。目前，得到結(jié)構(gòu)解析的GH17家族β-1,3-葡聚糖酶均為內(nèi)切型。GH17家族蛋白呈典型的（β/α）8 TIM（triose-phosphate isomerase）桶狀結(jié)構(gòu)（圖4），由8 個(gè)α-螺旋和8 個(gè)β-折疊環(huán)繞而成，在整個(gè)酶的表面形成了一個(gè)能夠容納長(zhǎng)鏈底物的狹長(zhǎng)催化凹槽并貫穿而過(guò)。桶狀結(jié)構(gòu)核心區(qū)域的β鏈?zhǔn)歉叨缺Ｊ氐模饕町惗及l(fā)生在蛋白外圍的環(huán)結(jié)構(gòu)和螺旋結(jié)構(gòu)處。GH17家族內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶與GH16家族類(lèi)似，遵循典型的保留型水解反應(yīng)機(jī)制，反應(yīng)歷程中會(huì)形成不穩(wěn)定的酶-糖基中間體。

圖4 GH17家族典型β-1,3-葡聚糖酶結(jié)構(gòu)[14,35-38]Fig.4 Typical β-1,3-glucanase structure of GH17 family[14,35-38]

Wojtkowiak等[35]獲得了馬鈴薯內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶（GLUB20-2）突變體E259A與昆布多糖共結(jié)晶的晶體結(jié)構(gòu)（圖4B），這是研究者得到的首個(gè)GH17家族糖苷水解酶與寡糖分子的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)。即使將其活性位點(diǎn)突變，GLUB20-2E259A仍具有殘存活性，質(zhì)譜分析揭示該突變體用兩種方式切割了昆布六糖，分別產(chǎn)生兩個(gè)昆布三糖分子或者一個(gè)昆布四糖分子和一個(gè)昆布二糖分子。GLUB20-2的催化凹槽形成了兩端開(kāi)口中間彎曲的峽谷型幾何構(gòu)象，該構(gòu)象排除了直線型底物如β-1,4-葡聚糖與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的可能，這表明活性位點(diǎn)裂隙的幾何形狀決定了酶的底物特異性。

3.1.3 GH64家族內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶

目前，已報(bào)道的GH64家族蛋白全部為內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶，主要來(lái)源于細(xì)菌。GH64家族內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶又稱為昆布五糖型β-1,3-葡聚糖酶，特點(diǎn)是催化水解β-1,3-葡聚糖的水解產(chǎn)物以昆布五糖為主。GH64家族內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶遵循典型的反轉(zhuǎn)型催化機(jī)制，催化中心附近的天冬氨酸殘基作為廣義堿，而谷氨酸殘基作為廣義酸參與水解反應(yīng)。Wu等[39]獲得了一種來(lái)源于馬特鏈霉菌（Streptomyces matensis）的GH64家族β-1,3-葡聚糖酶（LPHase）。LPHase由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，C末端是由α-螺旋和β-折疊構(gòu)成的α/β結(jié)構(gòu)域，N末端是由兩組反向平行的β-折疊組成的結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間形成了U型催化凹槽（圖5）。Qin Zhen等[40]報(bào)道了一種來(lái)源于巴倫氏類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus barengoltzii）的GH64家族β-1,3-葡聚糖酶（PbBgl64A）與昆布六糖的結(jié)合形式，即兩條寡糖鏈形成一個(gè)螺旋，同時(shí)與PbBgl64A的催化凹槽結(jié)合（圖5B、C）。這兩條鏈的構(gòu)象與三螺旋β-1,3-葡聚糖中的三螺旋結(jié)構(gòu)幾乎相同。這表明β-1,3-葡聚糖可以直接以三螺旋形式結(jié)合在GH64家族內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶的催化凹槽中。GH64家族β-1,3-葡聚糖酶與三螺旋β-1,3-葡聚糖底物的結(jié)合方式與植物病程相關(guān)抗真菌甜蛋白和β-1,3-葡聚糖螺旋糖鏈的結(jié)合方式相似，表明這是一種糖苷水解酶直接結(jié)合多糖四級(jí)結(jié)構(gòu)底物的新型結(jié)合方式[41-42]。

圖5 GH64家族典型β-1,3-葡聚糖酶結(jié)構(gòu)[39-40]Fig.5 Typical β-1,3-glucanase structure of GH64 family[39-40]

3.1.4 GH81家族內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶

GH81家族蛋白廣泛分布于細(xì)菌、真菌、植物和古生菌中，且全部為內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶。到目前為止，已有3 種GH81家族β-1,3-葡聚糖酶的晶體結(jié)構(gòu)得到解析，分別是來(lái)自耐鹽芽孢桿菌（Bacillus halodurans）的BhGH81、來(lái)自熱纖梭菌（Clostridium thermocellum）的CtLam81A[43]和來(lái)自米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）的RmLam81A[44]。GH81家族內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶由3 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中N端結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)β-折疊夾層結(jié)構(gòu)，包含兩組反向平行的β-折疊片層。C端結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)典型的（α/α）6-桶狀結(jié)構(gòu)。N端和C端中間的小結(jié)構(gòu)域包含2 個(gè)反向平行的β-折疊和2 個(gè)α-螺旋。3 個(gè)結(jié)構(gòu)域共同組成了一條縱向的狹長(zhǎng)催化凹槽（圖6）。

圖6 GH81家族典型β-1,3-葡聚糖酶結(jié)構(gòu)[44,46]Fig.6 Typical β-1, 3-glucanase structure of GH81 family[44,46]

Ma Junwen等[45]報(bào)道了一種來(lái)源于米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）的GH81家族β-1,3-葡聚糖酶（RmLam81A），揭示了其底物識(shí)別和催化機(jī)制。研究表明RmLam81A可以結(jié)合三螺旋β-1,3-葡聚糖，遵循典型的反轉(zhuǎn)型水解機(jī)制，通常是通過(guò)一步反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的，催化中心的保守天冬氨酸殘基作為廣義酸質(zhì)子化糖苷鍵上的氧原子，而谷氨酸殘基作為廣義堿則對(duì)其去質(zhì)子化，從而使糖苷鍵斷裂完成水解過(guò)程。Pluvinage等[46]報(bào)道了一種來(lái)源于耐鹽芽孢桿菌（B.halodurans）的GH81家族β-1,3-葡聚糖酶（BhGH81），將542位谷氨酸突變?yōu)楣劝滨０坊蛘邔?66位天冬氨酸突變?yōu)樘於０?，BhGH8均完全失活，這表明Glu542和Asp466是其關(guān)鍵催化殘基。此外，該酶與多糖鏈的復(fù)合結(jié)構(gòu)表明其至少能結(jié)合兩個(gè)單獨(dú)的β-1,3-葡聚糖鏈（圖6B），這意味著該酶可能可以直接與三螺旋β-1,3-葡聚糖結(jié)合（圖6C）。

3.2 外切型β-1,3-葡聚糖酶

外切型β-1,3-葡聚糖酶的水解模式是從β-1,3-葡聚糖糖鏈末端開(kāi)始，依次切斷糖鏈的β-1,3-糖苷鍵，產(chǎn)生葡萄糖或單一寡糖。已發(fā)現(xiàn)的外切型β-1,3-葡聚糖酶可以歸屬于6 個(gè)GH家族：GH3、GH5、GH17、GH55、GH128和GH132，其中大部分屬于GH55以及GH5家族。目前GH5、GH55、GH128家族的外切型β-1,3-葡聚糖酶晶體結(jié)構(gòu)均已得到解析，而GH3、GH17與GH132家族則鮮有結(jié)構(gòu)解析。

GH55家族β-1,3-葡聚糖酶主要來(lái)源于細(xì)菌及真菌，且絕大部分屬于外切型。GH55家族蛋白具有兩個(gè)平行的右手β-螺旋結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成一種類(lèi)似于胸腔肋骨的結(jié)構(gòu)，N末端和C末端的分別有7 個(gè)和10 個(gè)由右旋β-螺旋結(jié)構(gòu)域組成的線圈，并通過(guò)一段氨基酸殘基連接，該殘基包括兩個(gè)反向平行的β-折疊，催化位點(diǎn)位于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間（圖7A）。Bianchetti等[47]發(fā)現(xiàn)來(lái)源于鏈霉菌的（Setreptomycessp.）的外切型β-1,3-葡聚糖酶（sacteLam55A），其底物復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯示GH55家族外切型β-1,3-葡聚糖酶具有一個(gè)口袋型催化凹槽，具有6 個(gè)糖基結(jié)合位點(diǎn)，能夠從糖鏈非還原末端逐一切下葡萄糖單糖（圖7B）。GH55家族蛋白遵循反轉(zhuǎn)催化機(jī)制，廣義酸首先提供一個(gè)質(zhì)子給底物異頭碳，同時(shí)廣義堿從水分子中奪走一個(gè)質(zhì)子，增加了其親核性，促進(jìn)其攻擊異頭物的中心，從而斷裂糖苷鍵，產(chǎn)生水解產(chǎn)物。Papageorgiou等[48]發(fā)現(xiàn)了來(lái)源于嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum）的β-1,3-葡聚糖酶（CtLam55），通過(guò)結(jié)構(gòu)比較和定點(diǎn)突變確定了Glu654是關(guān)鍵催化殘基。

圖7 GH55家族典型β-1,3-葡聚糖酶結(jié)構(gòu)[13,47-48]Fig.7 Typical β-1,3-glucanase structure of GH55 family[13,47-48]

3.3 GH128家族β-1,3-葡聚糖酶

在近年的研究中，還發(fā)現(xiàn)了一些新型的β-1,3-葡聚糖酶，在CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中歸屬于GH128家族。GH128家族β-1,3-葡聚糖酶屬于GH-A超家族，具有碳水化合物結(jié)合區(qū)域和（α/β）8-桶狀結(jié)構(gòu)[49]，且該桶狀結(jié)構(gòu)是所有已知GH128家族中最短的，平均僅有240 個(gè)氨基酸殘基[50]，該家族兼具內(nèi)切型和外切型β-1,3-葡聚糖酶。

Santos等[50]利用序列相似性網(wǎng)絡(luò)聚類(lèi)將GH128家族分為7 個(gè)亞群，并對(duì)每種亞群的底物結(jié)合方式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GH128家族β-1,3-葡聚糖酶的底物結(jié)合模式與疏水關(guān)節(jié)緊密相關(guān)，并且在這7 種亞群中，糖鏈會(huì)以“彎曲狀”和“扁平狀”這兩種不同的形態(tài)與酶進(jìn)行結(jié)合，此外第三亞群的GH128家族β-1,3-葡聚糖酶還可以直接與三螺旋β-1,3-葡聚糖糖鏈結(jié)合。

3.4 其他家族β-1,3-葡聚糖酶

除了上述家族典型的β-1,3-葡聚糖酶外，在GH3及GH5家族中也發(fā)現(xiàn)了少量的外切β-1,3-葡聚糖酶，它們具有典型的（β/α）8 TIM桶狀結(jié)構(gòu)，均遵循保留型催化機(jī)制。GH132家族β-1,3-葡聚糖酶被稱為SUN-蛋白，被發(fā)現(xiàn)存在于絲狀真菌和酵母中[51]。目前關(guān)于GH132家族蛋白的相關(guān)報(bào)道較少，尚不清楚其蛋白結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理。GH158家族β-1,3-葡聚糖酶隸屬于GH-A超家族，目前僅有一例GH158家族β-1,3-葡聚糖酶的結(jié)構(gòu)解析被報(bào)道。Déjean等[52]獲得了一種來(lái)源于單形擬桿菌（Bacteroides uniformis）的GH158家族β-1,3-葡聚糖酶（BuGH158），其由一個(gè)N末端的（β/α）8 TIM桶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C末端免疫球蛋白（immune globulin，Ig）樣結(jié)構(gòu)域組成。此外，該酶對(duì)可得然多糖與昆布多糖具有較高水解活性。

4 β-1,3-葡聚糖酶的應(yīng)用

4.1 β-1,3-葡聚糖酶在抗真菌中的應(yīng)用

果蔬在采后運(yùn)輸、貯藏和銷(xiāo)售期間的腐爛、劣變等問(wèn)題是影響果蔬品質(zhì)、保存期和人體食用安全性的重要因素。由植物病原真菌引起的腐敗是果蔬采后損失的主要原因。真菌是一種真核生物，細(xì)胞壁是真菌細(xì)胞生存的必要條件，細(xì)胞壁的降解會(huì)導(dǎo)致真菌細(xì)胞失去滲透壓平衡，因此破壞細(xì)胞壁完整性成為一種潛在的抗真菌手段。β-1,3-葡聚糖酶是生防微生物分泌的一種重要抑菌蛋白，植物自身在抵御真菌侵染過(guò)程中也會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生β-1,3-葡聚糖酶[53]。β-1,3-葡聚糖酶能夠降解細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖糖鏈，致使病原菌菌絲斷裂或畸形，造成病原真菌原生質(zhì)泄漏，同時(shí)抑制其孢子萌發(fā)。此外，這一過(guò)程還可以釋放真菌細(xì)胞壁碎片誘導(dǎo)物，誘發(fā)植物免疫誘抗作用，間接促進(jìn)植物寄主體內(nèi)植保素的積累，增加其抗病能力[54]。基于β-1,3-葡聚糖酶的生物防治手段能夠有效防治植物真菌病害，具有不產(chǎn)生抗藥性、只針對(duì)靶標(biāo)病原菌而不傷害其他有益生物、無(wú)農(nóng)藥殘留、無(wú)毒無(wú)污染等優(yōu)勢(shì)。因此，探索β-1,3-葡聚糖酶在果蔬采后保鮮中的作用，發(fā)展基于β-1,3-葡聚糖酶的新型綠色生物防腐保鮮劑是果蔬綠色保鮮技術(shù)的潛在發(fā)展趨勢(shì)之一。婁樹(shù)寶等[55]測(cè)定了大豆葉片β-1,3-葡聚糖酶的活性和對(duì)霉菌的抑菌作用，結(jié)果表明，在接種大豆疫霉菌48 h后，植物體β-1,3-葡聚糖酶活性達(dá)到峰值，利用接種48 h后提取的β-1,3-葡聚糖酶粗酶液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)β-1,3-葡聚糖酶粗酶液對(duì)大豆疫霉菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用。陳小云等[56]研究表明，β-1,3-葡聚糖酶對(duì)于蘋(píng)果、梨、香蕉等水果采摘后抑菌抗病有明顯的效果，可以很好地防止真菌造成的采后腐爛，這一特點(diǎn)可以為熱帶水果貯藏保鮮所利用。Rajninec等[57]發(fā)現(xiàn)來(lái)自叉葉茅膏菜（Drosera binate）的β-1,3-葡聚糖酶粗蛋白對(duì)立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、茄鏈格孢（Alternaria solani）和梨孢鐮刀菌（Fusarium poae）的生長(zhǎng)有抑制作用。

4.2 β-1,3-葡聚糖酶制備功能性低聚糖

β-1,3-葡寡糖也被稱為昆布寡糖，是一種具有良好生物活性的食品功能因子，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗感染、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡等活性。由可得然多糖或昆布多糖水解制備的β-1,3-葡寡糖可作為一種新型益生元應(yīng)用于功能食品開(kāi)發(fā)。此外，一些小分子質(zhì)量的可溶性β-1,3-低聚糖可以作為免疫激活劑誘導(dǎo)植物產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而提高植物抗病性。而β-1,3-葡聚糖酶水解β-1,3-葡聚糖制備β-1,3-低聚糖具有特異性強(qiáng)且副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種有潛力的低聚糖生產(chǎn)方法。Wang Yanxin等[22]發(fā)現(xiàn)GH55家族β-1,3-葡聚糖酶（AcGluA）能夠?qū)⒗ゲ级嗵撬鉃橐幌盗泄烟牵邉┝康墓烟强梢哉T導(dǎo)水稻幼苗產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而對(duì)稻瘟病產(chǎn)生抗性，這說(shuō)明β-1,3-葡聚糖酶的水解產(chǎn)物具有顯著的生防效果，對(duì)β-1,3-低聚糖的應(yīng)用具有一定指導(dǎo)作用。Li Kuikui等[58]從纖維化纖維微細(xì)菌（Cellulosimicrobium cellulans）克隆純化得到了一種新型的β-1,3-葡聚糖酶（GcGluE），對(duì)其進(jìn)行底物特異性和水解產(chǎn)物分析，發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)可得然多糖表現(xiàn)出最高水解活性，水解產(chǎn)物主要為二糖和三糖。此外，可得然多糖經(jīng)過(guò)勻質(zhì)化預(yù)處理后，GcGluE對(duì)其降解效率將提高7.1 倍，具有一定應(yīng)用潛力。Gao Minjie等[18]獲得了來(lái)源于哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的β-1,3-葡聚糖酶，在發(fā)酵118 h后酶活力最高可達(dá)198.57 U/mL。根據(jù)該酶的特性，建立了酶法水解β-1,3-葡聚糖制備多功能低聚糖的方法，這使β-1,3-葡聚糖酶在工業(yè)化生產(chǎn)低聚糖方面具有一定的應(yīng)用前景。

4.3 β-1,3-葡聚糖酶釀酒工業(yè)中的應(yīng)用

β-1,3-葡聚糖酶除了在抗真菌及寡糖制備中具有重要作用，還可以應(yīng)用于釀酒工業(yè)中。在釀酒工業(yè)中，大麥?zhǔn)巧a(chǎn)啤酒的主要原料，而生產(chǎn)加工過(guò)程中，某些微生物分泌到胞外的高聚β-1,3-葡聚糖增加了發(fā)酵液的黏度，造成過(guò)濾困難，最終可能在啤酒中形成絮狀凝膠，使啤酒產(chǎn)量下降并增加釀酒成本。呂麗麗等[59]研究發(fā)現(xiàn)，如果在發(fā)酵過(guò)程中加入適當(dāng)?shù)摩?1,3-葡聚糖酶，則可以顯著降低高聚葡聚糖的含量，從而降低發(fā)酵液黏度，達(dá)到精益啤酒和改善過(guò)濾工藝的目的。

4.4 β-1,3-葡聚糖酶制備酵母原生質(zhì)體

酵母菌細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分是β-葡聚糖，一類(lèi)是構(gòu)成酵母菌細(xì)胞壁的骨架且含量較多的β-1,3-葡聚糖，另一類(lèi)是起填充作用的含量較少的β-1,6-葡聚糖。制備酵母菌原生質(zhì)體的關(guān)鍵在于分解細(xì)胞壁中不溶的β-1,3-葡聚糖，因此β-1,3-葡聚糖酶是制備原生質(zhì)體的重要制劑[60]。段會(huì)軻等[61]利用木霉菌株LE02所產(chǎn)的β-1,3-葡聚糖酶對(duì)啤酒酵母葡聚糖進(jìn)行酶解增溶，通過(guò)β-1,3-葡聚糖酶酶解技術(shù)和超濾分離技術(shù)還可以獲得大分子質(zhì)量的水溶性酵母葡聚糖。

4.5 β-1,3-葡聚糖酶清除生物被膜

生物被膜是指由微生物和其胞外分泌物組成的復(fù)合組織。鼠傷寒沙門(mén)氏菌、假單胞菌等食品中關(guān)鍵的腐敗菌會(huì)產(chǎn)生生物被膜，生物被膜會(huì)導(dǎo)致常用的消毒劑、抗生素的殺菌效果減弱，造成食品安全隱患。β-1,3-葡聚糖作為念珠酵母菌生物被膜的重要成分之一，在胞外基質(zhì)發(fā)揮耐藥性的過(guò)程中起到了重要作用。而β-1,3-葡聚糖酶在清除生物被膜方面具有一定功效，可以在食品工業(yè)中對(duì)腐敗菌起到一定的控制作用。Nett等[62]研究發(fā)現(xiàn)用低濃度的β-1,3-葡聚糖酶處理念珠菌后，顯著增強(qiáng)了抗真菌藥物氟康唑和兩性霉素B對(duì)于該菌的作用效果。Mitchell等[63]也通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，隨著胞外基質(zhì)中β-1,3葡聚糖的水解，抗真菌藥物的敏感性也逐漸增強(qiáng)，這說(shuō)明β-1,3-葡聚糖酶在清除生物被膜方面有一定功效。

4.6 β-1,3-葡聚糖酶與幾丁質(zhì)酶協(xié)同作用

β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶均具有降解真菌細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖和幾丁質(zhì)以及肽聚糖的作用，二者在防御植物病蟲(chóng)害方面具有廣譜抗性，能夠減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，降低環(huán)境污染。Mauch等[64]發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶聯(lián)合作用時(shí)的抑菌效果優(yōu)于單個(gè)酶，表明二者在抑制病原菌生長(zhǎng)的過(guò)程中發(fā)揮協(xié)同作用。Cota等[65]對(duì)西紅柿進(jìn)行感染互隔交鏈孢霉（Alternaria alternata）抗病實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶協(xié)同作用能夠顯著抵御此類(lèi)病菌對(duì)西紅柿貯藏時(shí)的影響。這說(shuō)明β-1,3-葡聚糖酶與幾丁質(zhì)酶在果蔬菜后抑菌保鮮方面具有協(xié)同效應(yīng)，比單個(gè)菌種抑菌能力更強(qiáng)，具有良好的應(yīng)用前景。

5 結(jié) 語(yǔ)

β-1,3-葡聚糖酶因能夠特異性水解β-1,3-葡聚糖，在功能性寡糖制備、果蔬保鮮、生物醫(yī)藥、植物抗病等領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用前景。目前研究者已對(duì)一系列不同家族β-1,3-葡聚糖酶的結(jié)構(gòu)、功能及應(yīng)用展開(kāi)研究。在此背景下，如何獲得具有良好應(yīng)用性能的新型β-1,3-葡聚糖酶并實(shí)現(xiàn)其高效發(fā)酵制備，將是β-1,3-葡聚糖酶后續(xù)研究的重點(diǎn)。但由于天然β-1,3-葡聚糖底物的復(fù)雜性，現(xiàn)有β-1,3-葡聚糖酶對(duì)于不同類(lèi)型底物的催化效率還有待進(jìn)一步提高，部分不溶性β-1,3-葡聚糖底物的酶解仍然存在一定困難。此外，酶結(jié)構(gòu)與功能的研究是探索酶催化機(jī)理、挖掘酶的催化特性以及進(jìn)行酶分子改造研究的重要基礎(chǔ)。針對(duì)天然β-1,3-葡聚糖底物的復(fù)雜性以及β-1,3-葡聚糖酶系的多樣性，研究不同β-1,3-葡聚糖酶家族對(duì)于底物的結(jié)合差異和催化機(jī)理，明確β-1,3-葡聚糖酶對(duì)于復(fù)雜葡聚糖分子的底物識(shí)別機(jī)制，探索基于β-1,3-葡聚糖酶的多酶組合催化體系，是實(shí)現(xiàn)β-1,3-葡聚糖酶高效應(yīng)用的發(fā)展趨勢(shì)。