基于ox-LDL信號通路探討桑芪滋陰補(bǔ)腎湯對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制

張衛(wèi)麗,張衛(wèi)紅,劉海立,張文靜 ,曹 巖

(1.唐山市中醫(yī)醫(yī)院心血管內(nèi)科,河北 唐山 063000;2.唐山市豐潤區(qū)中醫(yī)醫(yī)院中風(fēng)一科,河北 唐山 064000)

高血壓患者血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能等往往受到影響,進(jìn)而誘發(fā)動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)[1]。頸動脈粥樣硬化(Carotid atherosclerosis,CAS)屬于全身動脈粥樣硬化的一部分,可以作為反映全身動脈粥樣硬化病變的“窗口”[2]。臨床研究數(shù)據(jù)顯示,超過70%的高血壓患者往往伴有不同程度的頸動脈粥樣硬化[3-4]。臨床通常采用他汀類藥物與降壓藥聯(lián)合使用的方法來治療CAS[4],但作用靶點(diǎn)單一,且部分患者頭暈、頭痛、惡心等臨床癥狀無法得到緩解,久病后容易造成多種并發(fā)癥[5],因此給患者的正常生活和身心健康造成了巨大的困擾。近年來有研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞焦亡和炎癥在AS的發(fā)生和發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用[6],氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是AS的危險因素,其可通過增加氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng),誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,并導(dǎo)致內(nèi)皮損傷,進(jìn)而促進(jìn)AS發(fā)生和發(fā)展[7]。因此,減輕ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷可能是防治AS的潛在機(jī)制[8]。

桑芪滋陰補(bǔ)腎湯由桑寄生、黃芪、白芍、制首烏、當(dāng)歸、炒杜仲、丹參、川芎、火麻仁、鉤藤、天麻、炒谷麥芽、夜交藤和三七組成,具有補(bǔ)肝益腎、益氣固表、活血祛瘀、養(yǎng)心安神的功效。且中藥復(fù)方治療疾病具有“多成分”“多通路”“多靶點(diǎn)”協(xié)同作用的優(yōu)勢,療效確切,不良反應(yīng)少。因此,本研究通過觀察桑芪滋陰補(bǔ)腎湯對體外ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)細(xì)胞存活率的影響,以NLRP3/Caspase-1誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡信號通路為靶點(diǎn),探討桑芪滋陰補(bǔ)腎湯改善CAS的藥理活性及潛在機(jī)制,為臨床防治高血壓頸動脈粥樣硬化提供新的思路和治療藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞:HUVEC細(xì)胞系由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究所提供。

1.1.2 儀器:Real-Time PCR儀Q162D(河北三獅生物科技有限公司);蛋白核酸分析儀(德國Eppendorf公司);Odyssey雙色紅外激光掃描顯影儀(美國Li-Cor公司);酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Thermo公司);MK3酶標(biāo)儀(日本島津公司);熒光顯微鏡(Carl Zeiss公司);光學(xué)顯微鏡(北京英威泰科技有限公司);高速離心機(jī)(美國Thermo公司);移液槍(德國Eppendorf公司)。

1.1.3 藥物與試劑:Ham’s F-12K培養(yǎng)液、胎牛血清、青鏈霉素混合液購自武漢普諾賽生物公司;ox-LDL購自美國Sigma公司;CCK-8試劑盒購自北京全式金公司;RIPA裂解液購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;一抗NLRP3、Caspase-1(貨號:SH-bs-10021R、22915-1-AP)購自美國Abcam公司;內(nèi)參一抗GAPDH(貨號:PA1-988)購自美國Thermo公司;qPCR試劑盒:Taq pro Universal SYBR qPCR Master Mix(貨號:Q712-02)購自中國諾唯贊公司;Trizol試劑(貨號:15596018)購自美國invitrogen公司;PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司提供;IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(批號:CAS148157-34-0/CAS94948-59-1)購自上海恪敏生物科技有限公司;辛伐他汀片購自哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司(批號:120100);中藥飲片均購自北京同仁堂科技有限公司;水為屈臣氏純凈水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桑芪滋陰補(bǔ)腎湯水煎液的制備:取黃芪30 g,桑寄生、鉤藤、夜交藤各20 g,白芍、炒杜仲、炒谷芽、炒麥芽各15 g,制首烏12 g,當(dāng)歸、丹參、火麻仁各10 g,川芎、天麻、三七各6 g;分別加10倍、8倍量水煎煮2次,合并兩次煎液并濃縮至500 ml,備用。取適量濃縮液,用細(xì)胞培養(yǎng)液分別稀釋100、1000、10000倍,作為高、中、低濃度桑芪滋陰補(bǔ)腎湯藥液。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組:將HUVEC分為空白對照組、模型組、高濃度桑芪滋陰補(bǔ)腎湯組、中濃度桑芪滋陰補(bǔ)腎湯組、低濃度桑芪滋陰補(bǔ)腎湯組和陽性藥組。

HUVEC采用Ham’s F-12K培養(yǎng)液(加0.1 mg/ml肝素、0.03 mg/ml的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液)在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育,取對數(shù)生長期的細(xì)胞,用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個/ml,每孔100 μl接種于96孔板中?？瞻讓φ战MHUVEC細(xì)胞正常培養(yǎng);模型組HUVEC細(xì)胞加入5 μl含200 μg/ml ox-LDL培養(yǎng)液孵育24 h[9];低、中、高濃度桑芪滋陰補(bǔ)腎湯組和陽性藥組HUVEC細(xì)胞分別加入5 μl相應(yīng)濃度的桑芪滋陰補(bǔ)腎湯藥液和5 μl濃度為10 μmol/L的阿托伐他汀的培養(yǎng)液預(yù)處理24 h[10],然后給予和模型組相同的處理。

1.2.3 CCK8法檢測細(xì)胞存活率:HUVEC細(xì)胞在培養(yǎng)液中按分組處理并繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μl CCK-8工作液,培養(yǎng)1 h后測定各組細(xì)胞的吸光度(A)值,并計算細(xì)胞存活率[11]。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/空白對照組A值×100%[12]。

1.2.4 RT-PCR法檢測細(xì)胞中VEGFA的mRNA表達(dá)水平:采用Trizol試劑提取細(xì)胞RNA樣品,按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄總RNA得到的cDNA,并根據(jù)qPCR試劑盒說明,使用Real-Time PCR儀進(jìn)行Real-Time PCR反應(yīng),記錄數(shù)據(jù),以Actin為內(nèi)參,根據(jù)CT值計算VEGFA的mRNA 表達(dá)水平。用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.5 Western blot法檢測細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1的蛋白表達(dá)情況:使用預(yù)冷的PBS沖洗各組HUVEC細(xì)胞后,加入RIPA緩沖液進(jìn)行裂解,離心后提取組織蛋白并用BCA試劑盒測定蛋白濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離各組HUVEC細(xì)胞蛋白樣品,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,分別孵育不同的一抗,加入比例為NLRP3(1∶1000)、Caspase-1(1∶1000)以及內(nèi)參GAPDH(1∶4000),保持4 ℃過夜,漂洗膜后,在室溫條件下二抗(1∶2000)孵育2 h。洗滌3次后加入顯影液,化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光觀察,得到NLRP3、Caspase-1和GAPDH蛋白條帶,采用Image J軟件掃描蛋白條帶的灰度值,并對NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1.2.6 ELISA法檢測細(xì)胞上清液中IL-6和TNF-α水平:收取各組細(xì)胞上清液,根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作,檢測各組細(xì)胞上清液中IL-6和TNF-α的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析;P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞存活率比較 與模型組比較,桑芪滋陰補(bǔ)腎湯各組可以顯著提高細(xì)胞存活率(P>0.05),且呈劑量依賴性,其中高濃度桑芪滋陰補(bǔ)腎湯組的活性與陽性藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞存活率比較

2.2 各組細(xì)胞中VEGFA的mRNA表達(dá)水平比較 與空白對照組比較,模型組細(xì)胞中VEGFA的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),提示造模成功。與模型組比較,低、中、高濃度桑芪滋陰補(bǔ)腎湯組細(xì)胞中VEGFA的mRNA表達(dá)水平逐漸升高(P<0.05);與陽性藥組比較,低、中濃度桑芪滋陰補(bǔ)腎湯組細(xì)胞中VEGFA的mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組細(xì)胞中VEGFA的mRNA表達(dá)水平

2.3 各組細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)水平比較 與空白對照組比較,模型組細(xì)胞中NLRP3和Caspase-1的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),提示造模成功。與模型組比較,低、中、高濃度桑芪滋陰補(bǔ)腎湯組細(xì)胞中NLRP3和Caspase-1的蛋白表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05);與陽性藥組比較,低、中濃度桑芪滋陰補(bǔ)腎湯組細(xì)胞中NLRP3和Caspase-1的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)水平比較

2.4 各組細(xì)胞上清液中IL-6和TNF-α的含量比較 與空白對照組比較,模型組細(xì)胞上清液中IL-6和TNF-α的含量顯著升高(P<0.05),提示造模成功。與模型組比較,低、中、高濃度桑芪滋陰補(bǔ)腎湯組細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α的含量逐漸降低(P<0.05);與陽性藥組比較,低、中、高濃度桑芪滋陰補(bǔ)腎湯組細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α的含量升高(P<0.05)。見表5。

表5 各組細(xì)胞上清液中IL-6和TNF-α含量比較(pg/ml)

3 討 論

高血壓是臨床常見的心血管疾病之一,高血壓患者的機(jī)體血壓長期處于高位狀態(tài)會造成血管壁張力和切應(yīng)力的改變,還會損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)而引發(fā)AS[13-14]。臨床研究數(shù)據(jù)顯示,高血壓患者的 CAS檢出率比血壓正常者更高[15],說明高血壓可能會加速CAS的發(fā)生和發(fā)展。臨床治療高血壓伴頸動脈粥樣硬化多采用他汀類藥物與降壓藥物合用[16],其對于改善患者臨床癥狀有一定的效果,但同時也存在療效不穩(wěn)定、不良反應(yīng)大等弊端[17],而中醫(yī)藥在治療高血壓合頸動脈粥樣硬化方面積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn),并取得了較好的治療效果。

臨床研究表明,桑芪滋陰補(bǔ)腎湯對于高血壓引發(fā)的頸動脈粥樣硬化具有良好的治療作用。方中以桑寄生、黃芪為君藥,桑寄生長于補(bǔ)肝益腎;黃芪善于益氣固表、升陽健脾、以固后天之本;制首烏、杜仲、白芍用作臣藥,以助君藥補(bǔ)肝益腎、活血生津之效,白芍?jǐn)筷幦岣?平抑肝陽;制首烏補(bǔ)肝益腎,滋陰補(bǔ)血;杜仲溫而不燥,補(bǔ)肝益腎;丹參、川芎、當(dāng)歸氣血同調(diào),補(bǔ)而不滯,活血祛瘀,燥中有潤;天麻、鉤藤能平肝潛陽;夜交藤養(yǎng)心安神,除煩通絡(luò);火麻仁健脾補(bǔ)氣,強(qiáng)腎;谷麥芽用作使藥,能消食開胃,以補(bǔ)養(yǎng)先天之虛。全方合用,共同發(fā)揮補(bǔ)肝益腎、益氣固表、活血祛瘀、養(yǎng)心安神之效。因此本文對桑芪滋陰補(bǔ)腎湯對HUVEC細(xì)胞損傷的保護(hù)作用進(jìn)行研究,并探討其起效機(jī)制,以期為高血壓合頸動脈粥樣硬化的臨床治療提供新的思路。

VEGFA是一種具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的細(xì)胞因子,是血管生成中最重要的調(diào)節(jié)因子,其基因表達(dá)水平與血管形成密切相關(guān)[18],因此VAGFA的表達(dá)水平可以作為評價藥物血管保護(hù)作用的重要指標(biāo)。RT-PCR檢測結(jié)果表明,與模型組比較,低、中、高濃度桑芪滋陰補(bǔ)腎湯組細(xì)胞VEGFA的mRNA表達(dá)水平逐漸升高,說明桑芪滋陰補(bǔ)腎湯可以呈劑量依賴性上調(diào)VEGFA基因的表達(dá),且高濃度桑芪滋陰補(bǔ)腎湯上調(diào)VEGFA基因表達(dá)水平的作用與陽性藥比較無統(tǒng)計學(xué)差異。

ox-LDL是AS的危險因素,近年來的研究發(fā)現(xiàn),ox-LDL可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡、損傷內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)炎癥反應(yīng)等途徑參與AS的形成與發(fā)展[19]。NLRP3是目前研究最多一種炎癥介質(zhì)[20]。研究表明NLRP3/Caspase-1信號通路誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)與AS密切相關(guān)[21-22],因此可以將NLRP3和Caspase-1的表達(dá)水平作為評價藥物對CAS改善作用的重要指標(biāo)。Western blot檢測結(jié)果表明,與模型組比較,低、中、高濃度桑芪滋陰補(bǔ)腎湯組細(xì)胞NLRP3和Caspase-1的蛋白表達(dá)水平逐漸降低,說明桑芪滋陰補(bǔ)腎湯可以呈劑量依賴性下調(diào)NLRP3和Caspase-1基因的表達(dá),且高濃度桑芪滋陰補(bǔ)腎湯下調(diào)NLRP3和Caspase-1基因表達(dá)水平的作用與陽性藥比較無統(tǒng)計學(xué)差異。

IL-6和 TNF-α是參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的兩種重要因子[23],可以根據(jù)所處環(huán)境的不同發(fā)揮促炎或抑炎的作用[24]。研究發(fā)現(xiàn),IL-6與相應(yīng)的受體結(jié)合后,可以發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平、誘導(dǎo)受體表達(dá)以及促進(jìn)炎癥發(fā)生和發(fā)展等作用[25]。且在病理機(jī)體中,TNF-α炎癥因子可以促進(jìn)IL-6等因子的分泌,使炎癥反應(yīng)加劇[26]。本研究ELISA檢測結(jié)果顯示,模型組細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α的含量遠(yuǎn)高于空白對照組;與模型組比較,三濃度桑芪滋陰補(bǔ)腎湯組細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α的含量降低,且含量降低水平與藥物濃度呈正相關(guān),說明桑芪滋陰補(bǔ)腎湯可以呈劑量依賴性下調(diào)IL-6和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)。

綜上所述,本研究通過ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞損傷模型,探討了桑芪滋陰補(bǔ)腎湯對HUVEC細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及起效機(jī)制。本研究結(jié)果表明,桑芪滋陰補(bǔ)腎湯對HUVEC細(xì)胞損傷具有改善作用,可顯著上調(diào)細(xì)胞中VEGFA的基因表達(dá)水平,下調(diào)細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1的基因的表達(dá)水平和細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α的基因表達(dá)水平,減少炎癥反應(yīng)及血管病變。提示其作用機(jī)制可能是通過NLRP3/Caspase-1誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡信號通路,上調(diào)VEGFA基因的表達(dá)水平,下調(diào)NLRP3/Caspase-1基因的表達(dá)水平及病理狀態(tài)下IL-6和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)水平,來發(fā)揮血管保護(hù)和炎癥保護(hù)作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果為桑芪滋陰補(bǔ)腎湯的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)及參考,一定程度上闡釋了桑芪滋陰補(bǔ)腎湯治療高血壓合頸動脈粥樣硬化的科學(xué)內(nèi)涵。