調(diào)肝清心沖劑治療室性早搏分子機(jī)制研究

姚繼紅,孫櫻丹,張海燕,王丹妮

(煙臺(tái)市煙臺(tái)山醫(yī)院,山東 煙臺(tái) 264008)

室性早搏是一種常見的臨床心律失常,也稱為室性期前收縮,是由于心室內(nèi)某異位室內(nèi)節(jié)律電脈沖過早導(dǎo)致的心臟去極化,常發(fā)生在冠心病和心肌病等器質(zhì)性心臟病中[1-2]。室性早搏在臨床上的發(fā)病率和致殘率較高,輕癥患者僅存在心悸不適,重癥患者則出現(xiàn)心室顫動(dòng)等,如果不及時(shí)治療,患者會(huì)誘發(fā)心力衰竭等惡性心血管事件,嚴(yán)重威脅患者的生命安全[3]。目前,西醫(yī)常用抗心律失常藥物,鉀拮抗劑、鈉拮抗劑、β受體拮抗劑和鈣拮抗劑以及射頻消融手術(shù)來治療室性早搏,但易出現(xiàn)負(fù)性肌力等不良反應(yīng)[4],整體效果不佳。中醫(yī)學(xué)中將室性早搏劃分為“心悸”“怔忡”等范疇,目前多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為其病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)[5]?；诖?本研究通過觀察大鼠模型實(shí)驗(yàn),探討調(diào)肝清心沖劑的作用機(jī)制,闡明缺血性室性早搏的發(fā)病機(jī)制并提出針對(duì)性的治療;通過觀察大鼠模型實(shí)驗(yàn),探討調(diào)肝清心沖劑灌胃預(yù)處理對(duì)缺血性心律失常大鼠心肌酶學(xué)、心律失常發(fā)生率及間隙連接蛋白43(Cx43)表達(dá)的影響,探討其治療室性早搏的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:實(shí)驗(yàn)于2016年5月至2017年5月進(jìn)行。清潔級(jí)SD大鼠購自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,由40只6～8周齡的SD大鼠(雌雄各半,體重180～220 g)作為受體。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)煙臺(tái)市煙臺(tái)山醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):煙山倫準(zhǔn)2023050號(hào))。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物:穩(wěn)心顆粒(規(guī)格:9 g/袋,國藥準(zhǔn)字Z10950026,廠家:山東步長制藥股份有限公司)。調(diào)肝清心沖劑組成:珍珠母、炒棗仁、葛根、赤芍、白芍各30 g,全瓜蔞、石菖蒲各15 g,柴胡、枳殼、郁金、半夏、苦參、炙甘草各10 g,黃連6 g,中藥藥材由北京同仁堂藥店提供,水煎并濃縮,制成沖劑備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 分組處理及模型建立:按隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組、穩(wěn)心顆粒組、調(diào)肝清心沖劑治療組四組,每組10只大鼠(雌雄各5只),共40只實(shí)驗(yàn)大鼠。假手術(shù)組采用0.9%NaCl溶液等劑量灌胃;模型組采用0.9%NaCl溶液等劑量灌胃;穩(wěn)心顆粒組采用1 ml/100 g(相當(dāng)于4.28 g生藥/kg體重)的劑量每天1次灌胃,在手術(shù)前7天開始;調(diào)肝清心沖劑治療組,1 ml/100 g(相當(dāng)于4.28 g生藥/kg體重)的劑量每天1次灌胃,在手術(shù)前7天開始。模型制備:連續(xù)用藥7 d后,對(duì)大鼠進(jìn)行稱重,并通過腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。將大鼠以俯臥姿勢固定在老鼠床上,并進(jìn)行氣管切開。將大鼠的四肢皮下連接到BL-420E生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),并記錄標(biāo)準(zhǔn)的Ⅱ?qū)?lián)心電圖。通過開胸,在左胸骨第三和第四根肋骨之間擠出心臟,并通過冠狀動(dòng)脈前降支下的1號(hào)絲線將心臟重新定位,收緊絲線5 min,松開5 min,共3次;當(dāng)心電圖監(jiān)測中ST段明顯升高時(shí),即認(rèn)為缺血成功。假手術(shù)組大鼠僅開胸,不施行冠脈結(jié)扎。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 室性早搏出現(xiàn)的時(shí)間和持續(xù)時(shí)間:在灌注后30 min內(nèi)通過心電圖監(jiān)測記錄各組室性早搏出現(xiàn)的時(shí)間和持續(xù)時(shí)間。

1.3.2 室性早搏和室性心動(dòng)過速的發(fā)生頻率:在灌注后30 min內(nèi)通過心電圖監(jiān)測記錄室性早搏和室性心動(dòng)過速的發(fā)生頻率。

1.3.3 心律失常評(píng)分:采用Mest法[6]評(píng)估心律失常評(píng)分,竇性心律為0分;室上性心律失常,Ⅰ度房室傳導(dǎo)阻滯為20分;Ⅱ度房室傳導(dǎo)阻滯,室性早搏二聯(lián)律、三聯(lián)律為40分;多源性室早、陣發(fā)室速為60分;心室顫動(dòng)為80分;死亡為100分。

1.3.4 血清中乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(Creatine kinase,CK)水平、Cx43含量:檢測完心電圖后,從腹主動(dòng)脈采集5 ml血液,在室溫下儲(chǔ)存8 h,以3000 r/min離心10 min,上清液儲(chǔ)存在-20 ℃的冰箱中,采用速率法測定LDH、CK水平;Western blot法測定大鼠左室心肌組織細(xì)胞Cx43的表達(dá):將心室心肌組織從-80 ℃的冰箱中取出,在冰上研磨后加入裂解液,從每組心肌組織中提取總蛋白,用BCA試劑盒定量,確定每組的總蛋白濃度,在12%的SDS-PAGE分離凝膠上電泳后,用5%的脫脂牛奶洗膜2 h,徹底洗凈用兔抗Cx43大鼠一抗(1∶1000,Affinity,美國)孵育過夜;第2天,加入HRP結(jié)合的二抗(1∶1000,北京博奧森生物技術(shù)有限公司,中國),在室溫下?lián)u晃孵育1 h,然后ECL顯影并使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon-5200上海天能科技有限公司,中國)曝光。用圖像處理軟件Image J分析灰度帶值,用GAPDH(1∶1000,Bioword,美國)作為內(nèi)部參考計(jì)算相對(duì)蛋白含量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠室性早搏出現(xiàn)時(shí)間和持續(xù)時(shí)間比較 與假手術(shù)組、模型組、穩(wěn)心顆粒組比較,調(diào)肝清心沖劑治療組的室性早搏出現(xiàn)明顯增加和持續(xù)時(shí)間明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠室性早搏出現(xiàn)時(shí)間和持續(xù)時(shí)間比較(min)

2.2 各組大鼠室性早搏和室性心動(dòng)過速發(fā)生率比較 調(diào)肝清心沖劑治療組的室性早搏和室性心動(dòng)過速的發(fā)生率均低于假手術(shù)組、模型組、穩(wěn)心顆粒組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠室性早搏和室性心動(dòng)過速發(fā)生率比較[例(%)]

2.3 各組大鼠Mest評(píng)分比較 與假手術(shù)組、模型組、穩(wěn)心顆粒組比較,調(diào)肝清心沖劑治療組的Mest評(píng)分明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 各組大鼠Mest評(píng)分比較(分)

2.4 各組大鼠血清LDH、CK水平比較 與假手術(shù)組、模型組、穩(wěn)心顆粒組比較,調(diào)肝清心沖劑治療組的血清LDH、CK水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表4。

表4 各組大鼠血清LDH、CK水平比較(U/L)

2.5 各組大鼠心肌組織Cx43含量比較 與假手術(shù)組、模型組、穩(wěn)心顆粒組比較,調(diào)肝清心沖劑治療組的Cx43含量明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表5。

表5 各組大鼠心肌組織Cx43含量比較

3 討 論

研究表明,常規(guī)24 h動(dòng)態(tài)心電圖的室性早搏發(fā)生率為40%～75%,其發(fā)生率隨年齡增長而呈上升趨勢[7-8]。室性早搏臨床常見癥狀有心悸、呼吸困難、暈厥等,它能引起收縮期左心室功能障礙,誘發(fā)心室相關(guān)的心肌病,對(duì)患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[9-10]。隨著現(xiàn)代生活方式和生活方式的改變,室性早搏的發(fā)病率越來越高,如工作壓力增大,過量飲酒、吸煙、食用脂肪和甜食,部分患者常伴有情緒不穩(wěn)定、焦慮和抑郁,這些都會(huì)加重心悸癥狀,形成惡性循環(huán)[11]。目前,西醫(yī)主要使用抗心律失常藥物來治療室性早搏,但西藥的不良反應(yīng)和導(dǎo)管消融術(shù)的創(chuàng)傷性操作令部分患者難以受益[12]。

近年來,中醫(yī)中藥作為治療室性早搏的重要手段,受到了患者的歡迎,現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為,心悸的主要病理是血液充盈、脈絡(luò)不通,治療應(yīng)以活血為主[13]。而有些學(xué)者認(rèn)為,心悸的主要原因是心脾兩虛,治療應(yīng)以健脾養(yǎng)心、補(bǔ)氣養(yǎng)血為主[14-15]。本文選用的調(diào)肝清心沖劑,方中柴胡、枳殼共為君藥,疏肝理氣為主;郁金、赤芍、白芍、全瓜蔞、半夏、黃連合而為臣藥,清熱燥濕、化痰活血;苦參、石菖蒲、葛根、珍珠母、炒棗仁共為佐藥,寧心安神定悸;炙甘草養(yǎng)陰生津、益氣復(fù)脈為使藥,全方主疏肝理氣、寧心安神。本研究結(jié)果中,調(diào)肝清心沖劑治療組的室性早搏和室性心動(dòng)過速的發(fā)生率以及室性早搏出現(xiàn)和持續(xù)時(shí)間明顯增高,且Mest評(píng)分明顯降低,提示調(diào)肝清心沖劑能夠縮短早搏出現(xiàn)時(shí)間和持續(xù)時(shí)間,并減少心率失常的發(fā)生個(gè)數(shù)。本研究使用藥方以疏肝理氣為先,柴胡疏肝解郁,枳殼行氣消脹。李三洋等[16]以疏肝湯加減治療肝郁氣滯型室性早搏,患者服用1月余病愈且無復(fù)發(fā);以化痰清熱為助,郁金清心活血,全瓜蔞辛溫化燥;另加以珍珠母、炒棗仁安神定悸。

LDH是與蛋白質(zhì)結(jié)合的酶,在臟器障礙和重癥感染癥中表達(dá)顯著上升,水平越高表示病情越嚴(yán)重[17]。CK廣泛存在于骨骼肌、心肌及大腦組織中,能夠維持細(xì)胞能量的穩(wěn)態(tài),其水平可以反映潛在疾病過程中的嚴(yán)重程度和肌肉失神經(jīng)的程度[18-20]。本研究結(jié)果中,調(diào)肝清心沖劑治療組的血清LDH、CK含量與其他組比較明顯降低,Cx43含量明顯增高,提示室性早搏的發(fā)病機(jī)制可能與降低LDH、CK水平,增加Cx43含量有關(guān)。安麗等[21]的研究指出,心肌缺血后再灌注損傷后容易出現(xiàn)再灌注心律失常,心律失常的發(fā)生與Cx43表達(dá)減少有關(guān)。中藥的現(xiàn)代藥理學(xué)研究為中藥治療室性早搏提供了理論依據(jù)。本研究選用的藥方中,柴胡提取物對(duì)中樞神經(jīng)有明顯的抑制作用[22],黃連抗心律失常,能夠降低心肌自律性[23],白芍提取物具有鎮(zhèn)靜作用[24],全方化痰清熱疏肝理氣,在抗心律失常方面具有較大的優(yōu)勢。

綜上所述,調(diào)肝清心沖劑灌胃能夠降低心肌缺血模型大鼠心律失常的發(fā)生率,其機(jī)制可能與降低LDH、CK水平,增加Cx43含量有關(guān)。